Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Does Intracytoplasmic Sperm Injection Overcome the Reduce of Fertilization Rate by Increasing Maternal Age?

Authors
Robabeh Taheripanah 1
Mohammad Ali Karimzadeh Meybodi 2
Abbas Aflatoonian 2
Mohammad Hossein Amirarjmand 3
1 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
2 Department of Obstet . and Gynecol . of Shahid Sadughi Medical Science of Yazd, Yazd, Iran
3 Shahid Sadoughi of Yazd Medical Sciences University, Yazd, Iran
Abstract
Introduction: The aim of this study was to determine the effects of maternal age in fertilization rate of intracytoplasmic sperm injection comparison with IVF. Material and Methods: In this prospective clinical trial study, 200 couples with male subinfertility that referred to infertility clinic were enrolled. Couples were selected on the basis of semen parameters and divided randomly into two groups of IVF and ICSI. Couples were divided into different subgroups based on age of females The fertilization rate of every subgroups were assessed and compared together. Results were analyzed by Chi-square method. Results: After induction ovulation with standard protocols, 525 oocytes were retrieved during egg collection in ICSI groups versus 474 in IVF. After selection of good quality oocytes, IVF and ICSI was done as routine The fertilization rate of every age group was measured and compared with age increased. In IVF group, the fertilization rate was 41.3% in patients <35 years versus 26.7% in older than 35 years old The mean fertilization rate was 89.3% in patients <35 comparison with 75.2% in women >35 years old by ICSI On the other hand the mean cleavage rate of IVF cycles was significantly lower in patients >35 years in IVF (49.5%) versus younger patients (P value<0.001) but this finding was not observed by ICSI (85.17% VS 85.15%).Reduction of fertilization rate with increase of female age was statistically meaningful (Pvalue <0.001) in IVF and ICSI. Conclusion: These findings suggest that fertilization of oocyte reduce consequently with maternal age increased. therefore, ICSI can not overcome this problem their cause is not clear and may refer to chromosomal or structural abnormality in oocytes.

مقدمه

کاهش قدرت باروری با افزایش سن زن موضوع جدیدی نیست. مطالعات مختلف نشان میدهد که قدرت باروری زنان تحت تاثیر سن آنها است بنحوی که قدرت باروری در عرض یکسال از 86% در سن 24-20 ساله به 52% در زنان 39-35 ساله کاهش میابد(1)، بنحویکه حتی کاهش قدرت باروری را درزنان قبیلهHutterite که به طور متوسط هر یک 14-12 فرزند دارند هم میتوان پس از سن 30 سالگی مشاهده کرد (2). Guttmacher در سال 1995 در ایالات متحده مقایسه‌ای را بر روی میزان حاملگی در زنان گروه سنی 24-25 و44-35 سال انجام داده و مشاهده نمود که در گروه اول، میزان حاملگی تقریباً دوبرابر گروه دیگر بوده است(3).

به عبارت دیگر به نظر می‌رسد که به ازای هر سال افزایش سن زن قدرت باروری 9% ‌کاهش میابد (4). علل مختلفی همچون کاهش دفعات مقاربت یا افزایش سن ازدواج و دیگر بیماریهای سیستمیک هم در کاهش باروری دخالت دارند(5). البته مسائل مختلفی از جمله ذخیره تخمدان و پذیرش اندومتر نیز در این مساله دخیل هستند. تجارب بالینی حاصل از تخمک اهدایی نشان میدهد که پیر شدن اووسیتها و کاهش ذخیره تخمدان بیش از محیط داخلی رحم تحت تاثیر سن بیمار قرار می‌گیرد(6). با افزایش سن و همچنین سن اووسیت های نابالغ احتمال بروز اختلالات کروموزومی در هنگام تقسیم سلولی افزایش میابد(7). از طرف دیگر تغییرات شیمیایی داخل و خارج اووسیت باعث افزایش ضخامت زوناپلوسیدا و سختی آن میگردد که عامل بسیار مهمی در نفوذ اسپرم به داخل اووسیت و لانه‌گزینی است. محققین نشان داده‌اند که انجامZona Hatching در زنان مسن یا افرادی که ضخامت زونا پلوسیدای بالای 15 میکرن دارند، در افزایش قدرت باروری نقش مهمی را ایفا مینماید (8). هدف از این مطالعه، بررسی تاثیر سن زن در روشهای کمک باروری و مقایسه آن در

دو روش IVF (In Vitro Fertilization) وICSI (Intracytoplasmic sperm Injection) است. سوال مطرح شده این است که آیا در مواردی که IVF با شکست مواجه میشود و یا در زنان مسن میتوان با حذف زوناپلوسیدا و تزریق اسپرم به داخل اووسیت مانع از تاثیر افزایش سن گردید؟ چنین به نظر میرسد که میکرواینجکشن هم نمیتواند بر تاثیر سوء افزایش سن زنان فائق آید و غیر از زوناپلوسیدا، تغییرات دیگری از جمله محیط شیمیایی اووسیت و محتویات کروموزومی هم در مسئله باروری دخیل است و در میکرواینجکشن فقط بر برخی از این عوامل از جمله زوناپلواسیدا و فعال کردن محیط داخلی اووسیت میتوان غلبه نمود و تغییرات ذاتی و بالقوه اووسیت تاثیر خود را همچنان برجای خواهد گذاشت و باروری در زنان مسن موجب کاهش میزان لقاح و حاملگی و افزایش عوارض جانبی مثل سقط خواهد شد(9).

مواد و روش اجرا

این مطالعه از نوع تحلیلی و به روش Clinical trial آینده نگر که از تاریخ1/7/74 لغایت31/5/76 در مورد زوجهایی که به علت ناباروری به مرکز درمان ناباروری یزد مراجعه کرده بودند اجرا گردید. در این بررسی 200 زوج که به علت subfertility مرد دچار مشکل ناباروری بودند و اشکالی از نظر فاکتورهای زن از جمله علل تخمدانی یا لوله ای نداشتند، وارد مطالعه شدند. زوجهایی که تعداد کل اسپرم متحرک شوهران آنها بین 20-5 میلیون در میلی لیتر یعنی در حد قابل قبول برای انجامIVF بوده است در این بررسی شرکت داده شدند. بیماران بطور تصادفی به دو گروه میکرواینجکشن و IVF تقسیم شدند. زنان مورد مطالعه تحت تحریک تخمک‌گذاری با روشهای مختلف از جمله تزریق آمپولهای عضلانی hMG (Human Menopausal Gonadotropin) روزی 2 عدد برای زنان زیر 35 سال و 3 عدد برای زنان بالای 35 سال و یا روش Flare-up یعنی با استفاده ازGnRh-a(Gonadotropin Releasing Hormone Agonist) زیر جلدی (Lupron,1mg) از روز اول hMG یا FSH (Follicle Stimulating Hormone) (Fertinorm,serono,75IU) از روز دوم قرار گرفتند. به کمک سونوگرافی روزانه، از روز پنجم شروع hMG اندازه‌گیری فولیکولها آغاز گردید. بر اساس میزان رشد فولیکولها تعداد آمپول مورد مصرف بیمار کم یا زیاد شد. هنگامی که قطر فولیکول در دو بعد به طور متوسط به حدود mm18  رسید، 000/10 واحدSerono, profasi) hCG بطور عضلانی تزریق شد. 36-34 ساعت پس از تزریق hMG (Human Chorionic Gonadotropin) اووسیتهای با کیفیت مناسب یعنی دارای کومولوس اووفروس پراکنده، زوناپلوسیدای مشخص و اووپلاسم شفاف برای تلقیح انتخاب شدند. نمونه منی شوهر بیمار را به روش swim-up آماده کرده و تعداد اسپرم‌های متحرک، تحرک، مورفولوژی و حرکت رو به جلوی آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس در گروه IVF پس از 5-4 ساعت از جمع‌آوری اووسیت، 100 هزار اسپرم به ازای هر اووسیت به ظرف مخصوص petri dish اضافه کرده و انکوبه میگردید. در گروه میکرواینجکشن اسپرم‌های متحرک و با مورفولوژی نرمال را انتخاب کرده و بداخل اووسیت تزریق میگردید.

18 تا 20 ساعت بعد اووسیتها به منظور تایید باروری یعنی وجود 2 عدد پرونوکلئوس درآن مورد ارزیابی قرار گرفت. امبریوهای با کیفیت خوب پس از 72-48 ساعت در مرحله 8-4 سلولی به داخل رحم ترانسفر و به منظور حمایت از فازلوتئال پروژسترون به میزان mg100 روزانه حداقل تا زمان نتیجه آزمایش -hcG تجویز شد. میزان باروری (Fertilization Rate) براساس درصد اووسیت‌های تلقیح شده که پس از24 ساعت از تزریق دارای 2 پرونوکلئوس بودند و به میزان تقسیم سلولی بر اساس درصد اووسیتهای بارور شده‌ای که وارد مرحله تقسیم 4-2 سلولی شده و به علت مناسب بودن به مرحله ترانسفر می‌رسیدند محاسبه گردید. مقایسه بین گروهها و نسبتها بر اساس آزمون Chi-square انجام گرفته است. P value<0.05 از نظر آماری معنی دار و قابل قبول انتخاب شده است.

نتایج

بیماران هر دو گروه ICSI وIVF بر اساس گروه‌های سنی مختلف تقسیم شدند و همانطور که در جدول شماره 1 مشاهده می‌گردد، توزیع فراوانی در گروه‌های سنی مختلف در دو گروه تقریباً مشابه بوده است و بیشترین گروه را زنان بین 34-25 سال تشکیل می‌دهند. متوسط سن زن در گروه IVF، 45/4±30 سال و در گروه ICSI، 7/3±33 سال بوده است و نشان میدهد که سن زنان گروه ICSI نسبت به گروه IVF اندکی بیشتر است. پس از اینداکشن اوولاسیون تعداد اووسیت‌های بدست آ‎مده و با کیفیت مناسب در گروه IVF، 474 عدد بوده که فقط 190 عدد از آنها بارور گردیدند. بدین ترتیب میزان باروری محاسبه شده 40% بوده است. در گروه میکرواینجکشن 525 اووسیت مناسب بدست آمد که 447 عدد آنها یعنی14/85% بارور شدند. ارتباط افزایش سن زن با میزان باروری در هر دو گروه محاسبه گردید که در جدول شماره 2 ذکر گردیده است. همانطوری که مشاهده می‌شود در گروه IVF میزان باروری در افراد زیر 35 سال،3/41% ‌در مقایسه با زنان بالای 35 سال 7/26% میباشد. از طرف دیگر میزان باروری در گروهICSI بترتیب3/89% و 2/75% است که در هر دو گروه با اختلاف معنی داری بالاتر است (p value<0.001). بنابراین میکرواینجکشن نتوانسته است که بر عامل سن و احتمالاً تغییرات بیوشیمیایی سلولی تخمک غالب گردد. همچنین توزیع فراوانی میزان cleavage rate در دو گروه در گروه‌های سنی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که مشاهده میشود میزان تقسیم سلولی در زنان زیر 35 سال در گروه IVF38/74% و در زنان بالای 35 سال بطور متوسط 5/49% است که از نظر آماری اختلاف معنی‌دار است (p value<0.001). در گروه میکرواینجکشن میزان تقسیم سلولی بترتیب 17/85%

و 15/85% است که تفاوت بارزی بچشم نمی‌خورد.

در نهایت تعداد 139 از امبریوهای با کیفیت مناسب در 42 نفر از بیماران گروه اول در مقابل 286 عدد امبریو در گروه دوم بداخل رحم 72 نفر ترانسفر گردید.

در گروه میکرواینجکشن 64 امبریو دچار Fragmentation شد و 40 امبریو به علت تعداد زیاد یا خطر (ovarian hyper stimulation syndrome) OHSS منجمد گردید. همانطور که مشاهده میشود باروری در گروهICSI بترتیب 3/89% و 2/75% تعداد ترانسفر امبریو در زنان بالای 35 سال در گروه IVF کمتر از گروهICSI است (p value<0.001). بنابراین ارتباط واضحی بین سن زن ومیزان باروری در گروه IVFو ICSI وجود دارد. بطوریکه بالاترین میزان را گروه سنی 24-20 سال تشکیل میدهند ولی این ارتباط معکوس افزایش سن در میزان تقسیم سلولی در گروهICSI بسیار خفیف است، که شاید به علت حذف مانع زوناپلوسیدا که در اثر افزایش سن دچار تغییراتی میگردد و همچنین تحریک اووسیت در اثر تزریق اسپرم در روش ICSI باشد(نمودار شماره 1).

بحث

یکی از دلایل کاهش قدرت باروری همزمان با افزایش سن مادر، اختلالاتی است که در غشاء اووسیت بوجود می‌آید. بعنوان مثال عدم فعال شدن اووسیت طی پدیده باروری بعلت سخت و ضخیم بودن زوناپلوسیدا مانعی در برابر لقاح موفق اسپرم و اووسیت خواهد بود. چه بسا که در سنین بالای 37 سال هم میزان لقاح بدون توجه به پروتکل تحریک تخمک‌گذاری و کیفیت و درجه اووسیت کمتر است(10). حتی ICSI هم نتوانسته بر این مشکل فائق آید و در زنان بالای 35 سال بطور محسوسی میزان لانه گزینی و حاملگی کاهش پیدا میکند. در این بررسی میزان باروری 78% و تقسیم سلولی 85% بوده است(11).

یکی از دلایل کاهش میزان لانه گزینی در سنین بالا افزایش ضخامت زوناپلوسیدا است وبه همین علت عده‌ای خدشه‌دار کردن زونا یعنی zona hatching را در زنان بالای 35 سال با میزان موفقیت بالاتری افزایش دادند(8). یکی از دلایلی که میتواند کاهش قدرت باروری اووسیت‌های زنان با سن بالاتر را توجیه نماید، تغییرات کروموزومی و موتاسیونهایی است که در گامتها بوجود می‌آید. البته روشن شدن این نکات مستلزم تحقیقات مولکولی و ژنتیکی گسترده است که در آینده با انجام روش‌های تشخیص ژنتیکی قبل از تولد PIGD امکان پذیر خواهند بود. بعنوان مثال آنوپلوئیدی با افزایش سن مادر افزایش می‏یابد(12). بعبارت دیگر همین اختلالات کروموزومی است که منشا کاهش میزان رشد امبریو تا مرحله بلاستوسیت در زنان با سن بالاتر میباشد.

همچنان که بررسی های انجام شده نشان میدهند تشکیل بلاستوسیت از 82%‌ از زنان زیر30 سال به 36% در زنان بالای 40 سال افت میکند(13) و شاید ناشی از مواد به ارث رسیده از اووسیت، زمان فعالیت ژنوم و الگوی موقتی در میان ژن در مراحل اولیه رشد امبریو باشد(13). تحقیقات انجام گرفته موید آن است که آنوپلوئیدی کروموزوم 16 که از علل نادر در سقط خودبخودی است شیوع بالایی در عدم موفقیت لانه گزینی دارد (14). بررسی سیتوژنتیکی بر روی اووسیت‌های غیر بارور زمانی که تحت IVF قرار گرفته اند نشان داد 7/77% موارد از نظر کاریوتیپ‌هاپلوئیداست ولی در بقیه موارد دچار آنوپلوئیدی، دی پلوئیدی وتتراپلوئید هستند که از میان آنها فقط دیپلوئیدی است که با اختلاف معنی داری با افزایش سن افزایش میابد(15). با توجه به اینکه میتوز و رشد لازم اووسیت و مراحل نهایی است, بنظر میرسد که با افزایش سن کاهش در پروسه فولیکولوژنزیس باعث کاهش کیفیت اووسیت میشود و با افزایش سن سن زنان دی‌جانکشن یکی از علائم اختلال در رشد اووسیت است (16). قدرت باروری زنان با افزایش سن بخصوص پس از سن 30 سال بطور محسوسی کاهش میابد.

پاتوفیزیولوژی افزایش سن بر دستگاه تناسلی علیرغم توجهی که به آن شده است هنوز نکات ابهام زیادی دارد. علیرغم مشخص بودن کاهش کیفیت اووسیت بدنبال افزایش سن، هنوز نقش آن در روی پذیرش اندومتر بخوبی آشکار نشده است(17) و به همین علت علیرغم استفاده از اووسیت اهدایی و آماده سازی رحم با تجویز هورمونها هنوز میزان سقط در این زنان بالاتر از افراد با سن کمتر است. یکی از دلایل کاهش قدرت باروری کاهش ذخیره تخمدانی است که با اندازه گیری Inhibin و FSH روز سوم قاعدگی است که میتواند نتیجه حاملگی را بخصوص در هنگام استفاده از IVF یا میکرواینجکشن پیش گویی کند(18). به همین علت بررسیها نشان داد که در زنان مسن و آگونادال با استفاده از تخمک اهدایی تفاوتی در میزان حاملگی مشاهده نگردیده است که نشان دهنده اهمیت کمتر پذیرش اندومتر در میزان باروری است(19). Federick هم به این مساله رسید که میزان موفقیت حتی با IVF هم در زنان بالای 40 سال کاهش داخلی میکند(20). در بررسی دیگری هم که انجام داده کمترین میزان حاملگی در بین زنان 40 سال اتفاق افتاده است و به همین علت توصیه شده دفعات CO H/IUI Control ovarian Hyperstimulation/ Intra Uterine Insemination در زنان بالای 40 سال به 3 دفعه محدود گردد(21)و حتی در برخی موارد حتی IVF هم در زنان بالای 40 سال حدوداً ‌توصیه نمیشود(22) از طرف دیگر علیرغم میزان پایین موفقیت در این افراد حتی میزان سقط در این افراد بالاتر حدود 60 % است(23). بنابراین سن بیمار به

عنوان یک فاکتور پیشگویی کننده خیلی مهم حتی در روشهای پیشرفته باروری است(24). میزان لقاح و تقسیم سلولی در زنان بالای 35 سال بدین دو گروه کاملاً یکسان که از دو IVF که فقط از نظر سن بدو گروه شده بودند با اختلاف معنی داری پایین تر بوده است. (25) زیرا مطالعات نشان داده است که بیماران بایستی بر اساس کریتاریای خاصی انتخاب شوند تا میزان کنسل کردن سیکل درمانی کاهش پیدا نکند. ولی با اینحال بطور قطع نمیتوان گفت که سن مادر یک عامل

پیش گویی کننده مهم در لانه گزینی جنین یا پذیرش اندومتر در سیکلهای IVF نیست(26). در یک بررسی دیگر میزان حاملگی در بالای 40 سال 3/11% در مقایسه با 2/28% در زنان زیر 40 سال بوده است(27).

حتی تاثیر سن در باروری بعدی است که در زنان زیر 35-30 سال حداکثر 4-3 جنین توصیه میشود، در حالیکه در سن بالای 34 سال اینگونه نیست(28). بنظر میرسد عوامل محیطی و تغذیه هم در میزان پاسخ‌دهی تخمدان موثرند. خوب نشان داده شده که تجویز Vit-E و Vit-C از روز اول حاملگی تا هفته 12 یا 24 حاملگی میتواند مانع تاثیر سوء سن بالای مادر خواهد شد ولی تاثیری روی رشد امبریو یا لقاح نخواهد داشت(29).

  1. Hendershot GE, Mosher WD, Pratt WF. Infertility and age: an unresolved issue, Fam Plan Perspect.14:287;1982.
  2. Tietze: Reproductive span and rate of reproduction among Hutteriete women, Fertil Steril.1957;89-8.
  3. Guttmasher AF. factors affecting normal expectancy of conception. JAMA.1976;161:855-860.
  4. Collins JA, Roue TC., Age of female partner is a prognostic factors in prolonged unexplained infertility: a multicenter study. Fertil Steril.1989; 52:15-20.
  5. Levin RM. Latimore J, Wein AJ, Van Arsdalen KN. Correlation of sperm count and frequency of ejaculation. Fertil Steril.1986;45:732-34.
  6. Saur MV, Paulson RJ, Lobo RA. A preliminary report on oocyte donation extending reproductive potential to women over 40. N Engl J Med.1990; 323:1157.
  7. Key, Chang, Rebar, Soules. Infertility. Evaluation and treatmeny. First Eddition.1995;10.
  8. Cohen J, Alikani M, Trowbridge J. Impair-ments of the hatching process following IVF in the human and implantation by assisting hatching. Hum Reprod.1992;7:685.
  9. Romeo A., Muasher SJ, Acosta AA. Results of in vitro fertilization attempts in women 40 years of age and older: the Norfollk experience. Fertil Steril. 1987;47:130.
  10. Yie SM, Collins JA, Daya S, Hughes E, Sagle M, Younglai EV. Ployploidy and failed fertilization in in vitro fertilization are related to patient’s age and gamete quality. Hum Reprod. 1996 Mar; 11:3, 614-7.
  11. Abdelmassih R, Sollia S, Moretto M, Acosta AA. Female age is an important parameter to predict treatment outcome in intracytoplasmic sperm injection Fertil Steril.1996 Mar;65:3,573-7.
  12. Ishikawa H, Endo A. Combined effects of maternal age and delayed fertilization on the frequency of chromosome anomalies in mice. Hum Reprod. 1995Apr;10:4,883-6.
  13. Janny L, Menezo Y. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyct formation. J Mol Reprod Dev.1996 Sep; 45:1,31-7.
  14. Benadiva CA, Kligman T, Munne S. Aneuploidy 16 in human embryos increases significantly with maternal age Fertil Steril. 1996Aug 66:2,248-55.
  15. Robert CG, O Neill C. Increase in the rate of diploidy with maternal age in unfertilized in vitro fertilization oocytes. Hum Reprod. 1995 Aug;10: 8,2139-41.
  16. Volarcik K, Sheean L, Goldfarb J, Woods L, Abdul Karim FW, Hunt P. the meiotic competence of in vitro matured human oocytes is influenced by donor age: evidence that folliculogenesis is compromised in the reproductively ageds ovary. Hum Reprod. 1998 Jan;13:1,154-60.
  17. Meldrum DR. Female reproductive aging-ovarian and uterine factors, Fertil Steril. 1993;59:1-5.
  18. Toner JP, Philput CB, Jones GS, Basal FSH level is a better predictor of in vitro Fertilization performance than age. Fertil Steril.1991;55:784-91.
  19. Reversing the natural decline in human fertility. An extended clinical trial of oocyte donation to women of advanced reproductive age [Published erratum appears in JAMA. 1993 Jan; 27,269(4):476.
  20. Federick JL, Denken MS, Rojas A, Horta I, Stone SC, Asch RH. Is there a role for ovarian stimulation and intra-uterine insemination after age 40? Hum Reprod. 1994;9:2284-96.
  21. Marine Sahakyan, Bernard L, Harlow, Mark D. Influence of age, diagnosis, and cycle number on pregnancy rate with gonadotropin-induced controlled ovarian hyperstimulation and intra-uterine insemination. Fertil Steril. 1999;3:1:500-4.
  22. Michelmann HW, Micheels P, Mettler L. Effect of maternal age on the success rate of in vitro fertilization. A comparison of human and animal experiment data. Geburtshife frauenheilkd. 1987 Jul; 47:7,495-8.
  23. Romeu A, Muasher SJ, Acosta AA, Veeck LL, Diaz J, Jones GS, Jones HW. Jr, Rosenwaaks Z. results of in vitro fertilization attempts in women 40 years of age and older: the Norfolk experience. Fertil Steril. 1987 Jan, 47:1,130-6.
  24. Di Castro Stringher P, Hern? ndez Vazquez J, Kably Ambe A, Gavi? O Gavi? O F, Calder? n Salda? a MC. Impact of the maternal age variable on ovular harvesting fertilization and segmenta-tion in a program of assisted reproduction Ginecol Obstet Mex. 1992 Mar;60, 86-90.
  25. Cordeiro I, Calhaz-Jorge C, Barata M, Leal F, Proence H, Coelho AM. The effect of the woman’s age, the rate of cleavage and embryo quality on obtaining a pregnancy by in vitro fertilization. Acta Med Port.1995 Mar;8:3,145-50.
  26. Arthur ID, Anthony FW, Masson GM, Thomas EJ. The selection criteria on an IVF program can remove the association between maternal age and implantation. Acta Obstet Gynecol Scand. 1994 Aug;73:7,562-6.
  27. Lass A, Croucher C, Duffy S, Dawson K, Margara R, Winston RM. One thousand initiated cycles of in vitro fertilization in women> or=40 years of age Fertil Steril. 1998 Dec;70:6,1030-4.
  28. Svendsen TO, Jones D, Butler L, Muasher SJ. The incidence of multiple gestations after in vitro fertilization is dependent on the number of embryos transferred and maternal age. Fertil Steril. 1991 Mar; 65:3,561-5.
  29. Tar ?n J, Ten J, Vendrell FJ, de Oliveria MN, Cano A Effects of maternal ageing and dietary antioxidant. Supplementation on ovulation, Fertilization and embryo development in vitro in the mouse. Reprod Nutr Dev. 1998 Sep;-Oct, 38:5,499-508.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 1, Issue 1
Winter 2000
Pages 24-30