Detection and typing of human papilloma virus DNA in cervical cancer with In situ hybridization method

Niakan, Mohammad; Garshasbi, Ahya; Jalali, Mohammad Reza; Gilani, Modares; Faghihzadeh, Soghrat

Detection and typing of human papilloma virus DNA in cervical cancer with In situ hybridization method

Authors

Mohammad Niakan ¹

Ahya Garshasbi ²

Mohammad Reza Jalali ³

Modares Gilani ⁴

Soghrat Faghihzadeh ⁵

¹ Microbiology Department, Faculty of Medicine, Shahed University, Tehran, Iran

² Department of Obstet . and Gynecol Of Medicine, Shahed University, Tehran, Iran

³ Pathology Department, Faculty of Medicine, Shahed University, Tehran, Iran

⁴ Department of Gynecology and Obstetrics ,Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

⁵ Department of Biostatistics, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran

Abstract

Cervical cancer is one of the most frequently found cancers in women and appears to have a viral aetiology.certain types of the human papillomavirus (HPV) are well established as the primary causes of cervical cancer.Clinical follow-up data, histopathologic diagnosis, Insitu hybridization (ISH ) and HPV DNA typing were available from 60 patients.ISH technique was performed with comercial biotinylated probes.The presence of 7 high risk HPV was evaluated in 60 cervical biopsies with squamous cell carcinoma (SCC) and Cervical Intraepithelial neoplasia (CIN) of differeat degrees by ISH.We analysed 60 biopsies from Iranian women. 42 of 60 (70%) carcinoma specimens were positive for HPV-DNA. HPV 31/33/51 (25%) was most frequently found, follwed by HPV 16/18 (23.33%) and HPV 6/11 (21.66%) while HPV negative cases were 18(30%).High risk HPV types appear to be most frequently associated with SCC and CIN. ISH is a sensitive test in the detection and typing of HPV DNA both in clinical and latent infections.

Keywords

Cervical cancer

human papillomavirus

Insitu hybridization

Pathology

مقدمه

تیپ های مختلفی از ویروس HPV باعث آلودگی و بروز بیماریهای مقاربتی میگردد. (5و1). تنوع ضایعات این ویروس زیاد است و از زگیل‏های خوش خیم پوستی که خود محدود شونده بوده و اغلب روی دست و پا ظاهر می شوند تا ضایعات بدخیم و تهاجمی بصورت سرطان کشنده دهانه رحم (سرویکس) تظاهر می‏نماید (8 و7 و5 و3). سرطان سرویکس در تمام دنیا شایع بوده و دومین سرطان مرگ‏آور نزد خانمها می باشد. شیوع آلودگی در جوامع مختلف متفاوت است. ‌در خانمهای جوان اروپایی میزان آلودگی تا 46% گزارش شده است (13و6و2). کوندیلوما آکومیناتا (زگیل آنوژنیتال) از شایعترین بیماریهای ویروس است که از طریق تماس جنسی STD) ) منتقل می گردد (7و4). گسترش جهانی سرطان سرویکس زیاد است و در دنیا سالیانه حدود 000/440 بیمار جدید از طریق WHO و CDC شناسایی وگزارش می شود (13و10و6). ارتباط مستقیم سرطان دهانه رحم و آلودگی با ویروس HPV ثابت شده می باشد و بخشی از ژنوم ویروس (پروتئین های E1-7) عامل ترانسفورمه شدن سلولهای بدخیمی، تغییرات کروموزومی در سلولهای اپی‏تلیال سرویکس و بروز سرطان رحم هستند (6و4).

سرطان ممکن است به یکی از اشکال بدخیم مانند: CIN و یا SCC ظاهر شود ( 13و7) . تا کنون بیش از 80 نوع ژنوتیپ ویروس HPV شناسایی شده است ولی عمدتاً تیپ های: 56و51و45و35و33و18و16و11و6 موجب ضایعات سرطانی می شوند که معمولاً پس از دورة کمون آلودگی 4-1 سال حدود 16% ضایعات بطرف بدخیمی با درجات بالا سیر می کند (7و6و4) .

مواد و روشها

از 60 بیمار مبتلا به سرطان سرویکس (نئوپلاستیک و کارسینوما) در بخش انکولوژی زنان بیمارستان امام خمینی تهران بیوپسی از دهانه رحم تهیه گردید. میانگین سنی بیماران 2241 سال بود. بیوپسی بافتی فیکس شده با فرمالین و پارافین اندود گردیده و پس از تهیه مقاطع روی اسلاید مورد مطالعه پاتولوژی قرار گرفت. پس از تائید بدخیمی ناحیه سرویکس آزمایشهای هیبریدیزاسیون ملکولی (ISH) با موادی که از شرکت ENZO تهیه گردیده بود انجام شد. خلاصه روش آزمایش هیبریدیزاسیون بدین شرح است که مقاطع بافتی به قطر 6-4 میکرون از بیوپسی پاتولوژی تهیه و به مدت 18-2 ساعت در دمای 80-60 درجه سانتیگراد قرار می‏گرفت، از اسلایدهای فوق الذکر حذف پارافین توسط 8 مرحله با مواد گزیلول و اتانول با درجات مختلف انجام می شد. پس از انکوباسیون در C 37 (15 دقیقه) آنزیم پروتئینازK را تاثیر داده و مجدداً انکوباسیون و مراحل آبگیری با الکل صورت میگرفت. پس از تاثیر دادن پروب های اختصاصی DNA ویروس HPV ، نمونه ها به مدت10-8 دقیقه در دمای 395 قرار داده و سپس در بافر شستشو گذاشته و 5/0 میلی لیتر از ماده تعیین کننده مخصوص به هر اسلاید اضافه می گشت، پس از شستشو و افزودن سوبستراو ماده AEG و انکوباسیون، اسلایدها شستشو، خشک و مورد مطالعه قرار می‏گرفت. مجموعه آزمایش در 21 مرحله می باشد که در نهایت اسلایدها با میکروسکوپ نوری بررسی می گردد. نشاندار شدن سلول های آلوده به ویروس و ژنوم آن بصورت خوشه ای و با رنگ قرمز درخشان بعنوان واکنش مثبت ظاهر می شوند. در کلیه مراحل اسلاید کنترل مثبت و منفی نیز بعنوان شاهد وجود دارد. (بطور مثال اسلاید کنترل مثبت از سلول های Caski آلوده به ویروس 16- HPV تهیه گردیده بود).

نتایج

انجام آزمایشهای هیبریداسیون نشان داد که اندازه نمونه ها می بایست حداقل g 200 از تومور و ترجیحاً سلول های نئوپلاستیک ، آدنوکارسینوم و اسکوآموس سل کارسینوما (SCC) باشند. نمونه‏ها بهتر است از ناحیه آندوسرویکس و شامل سلولهای اپیتلیال تهیه گردد.

بدنبال انجام آزمایشهای سیتولوژی و پاتولوژی تشخیصی جهت 60 نفر از خانمهای مبتلا به سرطان دهانه رحم آزمایش ISH نیز صورت گرفت. پروب های مورد استفاده درگروههای اول تا سوم دسته بندی شدند. مواردی که نسبت به گروه اول (11/6 HPV) پاسخ مثبت نشان دادند، 13 نمونه (66/21%) بود، تعداد 14 نمونه (33/23%) با پروب های گروه دوم (18/16 HPV) واکنش دادند و 15 مورد (25%) از بیوپسی های حاوی ژنوم گروه سوم (51/33/31 HPV) بودند. لذا در مجموع 42 نمونه (70%) مثبت و 18 مورد (30 %) فاقد ژنوم های هفت‏گانه فوق از ویروس HPV گزارش گردید جدول (1و2).

بحث

با توجه به شیوع فراوان ویروس HPV در جامعه افراد سالم و بیمار و امکان بروز بدخیمی و عواقب خطرناک بدنبال فعالیت ژنوم آن در بدن و نظر باینکه

آزمایشهای سیتولوژی و پاتولوژی بتنهایی نمی توانند پاسخگویی وضعیت آلودگی ویروس و پیش آگهی بیماریهای مربوطه باشند لذا استفاده از تکنیک ISH با استفاده از پروب های اختصاصی توصیه می شود. با بهره گیری از این روش می توان میزان شیوع و انواع متفاوت ویروس را شناسایی نمود زیرا در این روش با وجود فقط 25-20 کپی از ژنوم DNA ویروس در سلول بافتی قابلیت ردیابی و تشخیص وجود دارد.

در این تحقیق نشان داده شد که آلودگی ویروس HPV در نمونه های سرطان سرویکس زیاد است (حدود 70%) و بیشترین درصد حضور ژنوم ویروس در ضایعات SCC (33/73%) دیده می‏شود (جدول 2) .

در سرطان سرویکس متاپلازی سلول های اپتلیوم ایجاد می شود و خطر انتقال و آلودگی در جامعه وجود دارد. عفونتهای مخفی تقریباً در نزد 10% از افراد دارای فعالیت جنسی دیده می‏شود، آلودگی بیشتر بستگی به عواملی مانند سن ازدواج، سطح فرهنگی، رفتاری و فعالیت جنسی غیر طبیعی ، مصرف دخانیات ، عفونت ناحیه ژنیتال و غیره دارد. بررسی با روش ISH این امکان را ایجاد می کند که بیش از 90% از موارد آلودگی شناسایی شود. در روش قدیمی آزمایش پاپ اسمیر، امکان بروز پاسخ های منفی کاذب به میزان بالا وجود دارد، اخیراً روشهای Bethesda system,Thin prep وPCR نیز پیشنهاد گردیده است. نتیجه کلی اینکه استفاده از روش حساس ISH در تشخیص سرطان سرویکس و تعیین حضور ژنوم ویروس HPV مفید بوده و بعلاوه اینکه با این تکنیک میتوان انواع مختلف ویروس را در افراد بیمار و حتی بظاهر سالم نیز شناسایی نموده و بهره گرفتن از این سیستم میتواند به مطالعات اپیدمیولوژی ویروس HPV درجامعه کمک بزرگی بنماید.

تقدیر و تشکر

این تحقیق با هزینه و امکانات دانشگاه شاهد انجام گردیده است لذا از معاونت پژوهشی، محققین محترم همکار ومسئولین گرامی در پژوهشکده ابن سینا کمال تشکر را داریم.

Reitano M. Counseling patients with Genital warts. Am J Med. 1997,102(5A):35-43
Turazza E, Lapena A, sprovieri O, et al. low-risk human papilloma virus type 6 and 11 associated with carcinomas of the genital and upper aero – digestive tract acta. Obstet Gynecol Scand. 1997, 79:271-276.
Palefsky JM, Holly EA, Ralston ML, et al. Anal cytological abnormalities and anal HPV infection in men with centers for disease control group IV HIV disease. Genitourin Med. 1997, 73:174-180.
Strehler E, sterzik K, Malthaner D, et al. Influence of ovarian stimulation on the detection of human papilloma virus DNA in cervical scrapes obtained from patients undergoing assisted reproductive techniques. Fertil Steril. 1999, 71(5): 815-20.
Motoyasu sugase, Toshihiko M. Distinct manifestations of Human papilloma viruses in the vagina. Int J Cancer. 1997, 412 - 415.
Volker A, Carlo, Mirka S, et al. Detection and Typing of Human papillomavirus in Biopsy and cytological specimens by polymerase chain reaction and restriction enzyme Analysis. J Med Viro. 1996, 48: 161 - 170.
Rezza G, Giuliani M, Branca M, et al. Determinats of squamous intraepithelial lesions (SIL) on pap smear the role of HPV infection and HIV-1-induced immuno suppresion dianaids collaborative study group. Eur J Epidemiol. 1997,13(8):937-43.
Kjaer SK, Van den Brule AJ, Bock JE, et al. Determinants for genital human papilloma virus (HPV) infection in 1000 randomly chosen young Danish with normal pap smear. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1997, 6(10):799-805.
Van Muyden RC, Ter Garnsek BW, Smedts FM, et al. Detection and typing of human papillomavirus in cervical carcinoma in Russian women a prognostic study. Cancer. 1999, 85(9):2011-6.
Cuzick J, Beverly E, Ho L,Tervy G, Mielzynska I, lorincz A. HPV testing in primary screening older women. Br J Cancer. 1999, 81(3):554-8.
Hwang T. Detection and typing of human papillomavirus DNA by PCR using consensus primers in various cervical lesions of korean women. J Korean Med Sci. 1999, 14(6):593-9.
Harnish DG, Velland LM, scheid EE,et. al. Evaluation of human papilloma virus-consensus for HPV detection by the polymerase chain reaction. Mol Cell Probes 1999, 13(1):9-21.
Konno R, Paez CL, Sato S, et al. HPV, histologic grade and age Risk factors for the progression of cervical intraepithelial neoplasia. J Repord Med. 1998,43(7): 561 - 6.