Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) of one and two day(s)-old oocytes after complete in vitro fertilization (IVF) failure

Authors
Mohammad Mehdi Akhondi 1
Maerefat Ghaffari 2
Mahnaz Ashrafi 3
Ensieh Sh.Tehrani 3
Ashraf Moeini 3
Tahereh Madani 3
Mohammad Reza Sadeghi 2
Leila Karimiyan 3
1 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran; Infertility team of Royan Research Center, Tehran, Iran
2 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
3 Royan Research Center, Endocrinology & Infertility Department, Tehran, Iran
Abstract
The objective of this study was to evaluate the outcome of late (one and two days) Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) after total fertilization failure in IVF. 35 IVF cycles that were part of our regular IVF program and showed no evidence of fertilization 16-46 hours after insemination (oocytes were observed at 16-18 hours and again 42-44 hours after the IVF procedures), were assigned to two treatment groups. Assisted fertilization with ICSI was carried out at 24 and 48 hours after oocyte retrieval. Group I (injected-day 1),consisted of 21 patients with 72 failed-fertilized metaphase II oocytes injected 1 day after ovum pick-up; and group II (injected-day 2), included 14 patients with 45 failed-fertilized metaphase II oocytes injected 2 days after ovum pick-up. A single spermatozoon from the patient's husband (same as that used for insemination in IVF program) was injected into the cytoplasm of each of these oocytes. Resultant embryos were transferred 72 and 96 hours after oocyte retrieval in group I and II, respectively. Fertilization was achieved with ICSI in most patients with fertilization failure. In group I, (80.5%) oocytes fertilized, whereas in group II, 46.6% of oocytes fertilized. Cleavage rate was 79.3% of injected oocytes in group I, and 42.8% in group II. Finally, in group one 19 of 21 (94%) embryos well transferred. The transfer rate for group two was 11 of 14 (78%). These results indicate significant differences between fertilization and cleavage rates in both groups. One of the singleton pregnancies resulted from transfer of the embryos in group II, and none in group I. This is the first known pregnancy achieved from late (two days) ICSI and late transferred embryos, after failed IVF. In conclusion, late (24 and 48 hours) ICSI after complete failed fertilization in IVF, can give good fertilization and good cleavage rates. This method can be used as an ideal protocol in IVF programs, to increase chance of pregnancy in infertile couples using the advantages of two main assisted reproductive treatments including IVF and ICSI.
Keywords
Failed IVF
Fertilization failure
Late ICSI
Reinsemination

مقدمه

علیرغم وجود تست های متعدد آزمایشگاهی در بررسی قدرت عملکردی اسپرم، متاسفانه در حال حاضر‌، توانایی باروری یک نمونه Semen بطور دقیق قابل پیش بینی نیست. معیارهای بررسی توانایی عملکردی اسپرم همچون حرکت، مرفولوژی، تعداد و موقعیت آکروزوم و بسیاری مشخصات دیگر قادر به پیش بینی قدرت باروری اسپرم بطور دقیق و معنی داری نیستند. (2و1) علاوه بر این بدست آوردن اطلاعات دقیق و قابل اعتماد از باروری اسپرم بوسیله تست های آزمایشگاهی معرفی شده، چندان آسان نیست. این مشکل در هنگام انتخاب بهترین روش مناسب درمان ناباروری یک زوج نابارور از قبیلIVF و ICSI بیشتر محسوس میشود. یکی از مهمترین موارد غیر منتظره که یک زوج نازا در یک سیکلIVF با آن مواجه میشوند، اشکال در عدم باروری تخمک و عمل لقاح می باشد. عدم باروری تخمک و عدم انتقال جنین منجر به توقف سیکل درمانی و ایجاد یاس و ناامیدی در بیمار می‏گردد، و اثرات روحی و مالی فراوانی را بر زوج وارد می‏نماید. عدم باروری یا میزان بسیار کم باروری در سیکل درمانی IVF میتواند ناشی از شرایط هورمونی ناشی از پروتکل های تحریک تخمک گذاری و یا اختلالات خاص مربوط به سیکل و همچنین در مواردی اختلال در توانایی عملکردی اسپرم در نفوذ بداخل تخمک باشد.

به منظور نجات تخمک های باور نشده، بدنبال IVF Trourson و همکاران در سال 1984 و Pampiglione و همکاران در سال 1990 اقدام به تلقیح مجدد تخمک به روش IVF نمودند که نتایج حاصل حاکی از میزان پایین باروری بود. اگر چه تلقیح مجدد تخمک بوسیله میکرواینجکشن با تکنیک‏های (PZD) (5) و یا (SUZI) (6) موجب بالا رفتن میزان باروری شد. ولی متاسفانه در این روش تخمک های با بیش از 3 پرونوکلئوس (PN) که نشانه غیر طبیعی بودن لقاح بود، به میزان زیادی دیده شد (5). گزارشات اخیر نشان می دهد که تزریق اسپرم بداخل سیتوپلاسم تخمک های بارور نشده پس از یک روز از شکست IVF و (عدم باروری تخمک ها) می تواند موجب باروری تخمک ها شود (7و8و9). مطالعه حاضر با توجه به وجود تعداد موارد اندک گزارش در این زمینه و عدم وجود اطلاعات در مورد سقف زمانی تزریق به تخمک، پس از جمع آوری تخمک ها انجام پذیرفت. هدف از این مطالعه ارزیابی و بررسی قدرت باروری تخمک های بارور نشده یک و یا دو روز پس از انجام IVF، بوسیله تکنیک ICSI و همچنین توانائی جنین‏های حاصل در ایجاد حاملگی می‏باشد.

مواد و روشها

این مطالعه بر روی تخمک های بارور نشده 35 بیمار تحت درمان IVF از شروع مهرماه سال 1377 تا پایان اسفندماه سال 378 انجام شد و تمام بیماران با استاندارد های لازم برای انجام IVF مطابقت داشتند.

تحریک تخمک‏گذاری برای انجام IVF به وسیله پروتکل طولانی با استفاده از GnRH (Busereline acetate) و بدنبال آن hMG انجام شد. در طول انجام این مطالعه hMG از منابع تجاری مختلفی از جمله (Serono) Metrodin hP, Pergonal ، Humegon و (Organon) Normagon استفاده شد.

بیماران در طی درمان بوسیله سونوگرافی و اندازه گیری استرادیول تحت کنترل بودند. زمانی که در بیماران حداقل 4 فولیکول با قطر متوسط 19-17 میلی متر دیده شد hCG با دوز 10000 IU تزریق گردید و فولیکول های رسیده 36-34 ساعت پس از تزریق hCG بوسیله پمپ خلاء متصل به سوزنی که از Transvaginal ultrasound probe به طرف تخمدانها هدایت می شد، تخلیه و جمع آوری شد.

مایع فولیکول حاوی کمپلکس سلولهای کومولوس و تخمک به داخل لوله آزمایش استریل آسپیره شدند. سپس تخمک‏ها از مایع فولیکولی برداشته و در محیط کشت Ham's F10 برای 3-2 ساعت زیر روغن پارافین کشت داده شد و سپس در مجاورت اسپرم های متحرک به تعداد 106 × 05/0 که بوسیله درجات مختلف پرکل شستشو و جداسازی شده بودند قرار داده شدند.

ارزیابی باروری بعد از IVF

سلولهای کومولوس 22-19 ساعت بعد از جمع آوری تخمک‌، یا 19-16 ساعت بعد از تلقیح بوسیله پیپت پاستور و با آسپیراسیون آرام و بطور مکانیکی، زیر میکروسکوپ معکوس از تخمک ها جدا شده، سپس تخمک های کشت داده شده را از نظر وجود پرونوکلئوس(PN) و گویچه قطبی بررسی گردید. باروری در صورت وجود دو پرونوکلئوس مشخص با دو گویچه قطبی، طبیعی محسوب شد و تنها تخمک هایی که باروری نداشتند برای این مطالعه استفاده شدند.

آماده سازی تخمک های بارور نشده برای ICSI

102 تخمک که از نظر مرفولوژی فاقد نشانه های باروری بودند و در مرحله متافاز IIقرار داشتند برای میکرواینجکشن انتخاب شدند و بعد از 24 تا 48 ساعت از جمع آوری تخمک ها، ‌اسپرم متحرک با مرفولوژی طبیعی که از اسپرم های تهیه شده از روز جمع آوری تخمک در درجه حرارت اتاق نگه داری شده بود انتخاب و بعد از غیر متحرک کردن آن بداخل تخمک تزریق شد. سپس تخمک های تزریق شده سه بار در محیط کشت IVF شستشو داده شده و به قطره های 100 میکرولیتر محیط کشت IVF در پتری دیش های با اندازه mm 15×60 در زیر روغن پارافین منتقل و در انکوباتور با CO2 5% و درجه حرارت 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. تخمک ها 18-16 ساعت پس از تزریق مجدداً از نظر وجود پرونوکلئوس و گویچه قطبی مورد بررسی قرار گرفتند.

کشت جنین 72 تا 96 ساعت بعد از جمع آوری تخمک ادامه یافت و جنین هایی که به مرحله 8-4 سلولی رسیده بودند بداخل رحم منتقل شدند. دو هفته بعد از انتقال آزمایش hCG بعمل آمد. در صورت جواب مثبت 6 تا 8 هفته بعد از حاملگی سونوگرافی جهت دیدن کیسة جنینی انجام شد.

مراحل انجام ICSI تاخیری

جمع آوری تخمک های برای انجام IVF

4-2 ساعت

IVF (مجاورت اسپرم با تخمک ها)

19-16ساعت

بررسی باروری تخمک

26-24 ساعت 2-1 ساعت

ICSI تاخیری ICSI تاخیری

19-16 ساعت 19-16 ساعت

بررسی باروری تخمک بررسی باروری تخمک

30-24 ساعت 30-24 ساعت

انتقال جنین انتقال جنین

نتایج

تخمک های 35 بیمار که بدنبال انجام IVF بارور نشده بودند بوسیلهICSI مجدداً مورد تزریق قرار گرفتند. تخمک های بدست آمده از 21 بیمار گروه اول 24 ساعت پس از جمع آوری تخمک ها و عدم ناباروری، ICSI انجام شد. همچنین تخمک های 14 بیمار گروه دوم ، 48 ساعت بعد از جمع آوری تخمک ها بعلت عدم باروری بوسیله ICSI تزریق شدند. میانگین سنی گروه اول 31 سال (42-22) و گروه دوم 32 سال(42-21) بود که این اختلاف بین دو گروه معنی‏دار نبود. در گروه اول 164 تخمک و در گروه دوم 117 تخمک بدست آمد. از این تعداد 72 تخمک در گروه اول و 45 تخمک در گروه دوم برای انجامICSI انتخاب شدند. میزان باروری تخمک ها بدنبال ICSI در گروه اول 5/80% و در گروه دوم 6/46 % بود. که اختلاف معنی داری (05/0p< ) را بین دو گروه نشان میداد. میزان تقسیم سلولی به تخمک های تزریق شده 3/79% در گروه اول و 7/42 % در گروه دوم بود. انتقال جنین در 19 بیمار از گروه اول (94%) و 11 بیمار از گروه دوم (78%) انجام شد. انتقال جنین در گروه اول منجر به حاملگی نشد ولی در گروه دوم یک مورد حاملگی و تولد نوزاد سالم گزارش شد.

بحث:

اختلال در باروری بدنبال IVF ممکن است بدلیل عدم توانایی اسپرم در نفوذ به داخل تخمک باشد، که چنین اتفاقی احتمالاً به آسانی با استفاده از ICSI قابل درمان می باشد. از طرف دیگر عدم باروری بدنبال IVF ممکن است بدلیل اشکالات اساسی در کیفیت اسپرم و تخمک، از جمله عدم توانایی سر اسپرم برای متراکم شدن کروماتین و یا اختلال در فعال شدن تخمک با‌شد که چنین اختلالاتی بوسیله ICSI قابل درمان نیست. لذا با توجه به اینکه تعدادی از تخمک های بارور نشده در IVF توسط ICSI بارور و تعدادی دیگر پس از عدم باروری در IVF و انجام ICSI بارور نشد. لذا می توان حدس زد که هر دو نوع اختلال باروری در این مطالعه دیده میشود.

در این مطالعه میزان باروری بدنبال ICSI تاخیری در تخمک های یک روزه 5/80% و در تخمک های دو روزه 6/46% بود که در مقایسه با میزان باروری در تخمک های تازه و بدنبال انجام ICSI (90%)، بطور معنی داری پایین می باشد. نتایج بیان کننده این موضوع است، که اگر چه تخمک های بارور نشده 24 و 48 ساعت پس از انجام IVF ، قادر به باروری با انجام ICSI می باشد، ولی میزان باروری با افزایش سن تخمک رابطه معکوس دارد. مطالعات دیگر نیز تائید کننده ارتباط معکوس بین میزان باروری و سن تخمک می باشد (11و9 و7) Mortonو همکاران (9) و Nagy و همکاران (11) از اسپرم مشابه بکار برده شده در IVF اولیه وsjren و همکاران از اسپرم تازه برای انجام ICSI تاخیری استفاده نمودند که در هر دو مورد میزان باروری بالا بود. Lundin و همکاران (13) نشان دادند که اختلاف معنی داری در میزان باروری بین دو منبع اسپرم استفاده شده در ICSI تأخیری وجود ندارد. میزان باروری در این مطالعه، مشابه یا حتی بالاتر از میزان باروری در موارد استفاده شده از اسپرم تازه با نمونه اولیه بکار برده در IVF بود. یکی از مزیت های استفاده از نمونه اسپرم اولیه برای این مرکز ،‌عدم لزوم مراجعه مجدد بیمار جهت دادن نمونه مجدد منی بود، اگر چه در این مطالعه باروری غیر طبیعی بررسی نشده است ولی مطالعات اخیر بیان کننده این موضوع می باشد، که میزان باروری غیر طبیعی ( هاپلوئیدی ، آنوپلوئیدی، تری پلوئیدی) با مسن شدن تخمک افزایش می یابد (14و9 ( . برای مثال مشخص شده است که میزان3PN بدنبال ICSI در تخمک تازه 5% (15) تخمک 1 روزه 25-20% (16) و تخمک 2 روزه تا 40% افزایش می یابد. همچنین کاریوتایپ از 10 جنین ناشی از ICSI تاخیری نشان داد که 5 تا از آنها غیر طبیعی (3PN) می باشند (11) که بیان کننده این موضوع می تواند باشد که مسن شدن تخمک سبب اختلال دوک میوزی و میکرو فیلامنت ها شده که منجر به اختلال اختصاصی در خروج دومین گویچه قطبی و اختلالات کروموزومی می شود. اگر چه میزان باروری (4/80% در تخمک های یک روزه و 6/46 % در تخمک ها دو روزه )تقسیم سلولی (81% در تخمک یک روزه و 73% در تخمک های دو روزه) در این مطالعه و مطالعات دیگر بالا می باشد. ولی میزان حاملگی بسیار پایین می باشد. که این میتواند به دلیل درصد بالای اختلالات کاریوتایپ و سیتوژنتیک در این جنین ها باشد (17) . که منجر به اختلاف معنی دار (05/0p< ) در میزان حاملگی بین ICSI روی تخمک های تازه و تخمک های مسن شود (18).

بطور طبیعی بالاترین شانس لانه گزینی جنین هنگامی می‏باشد که حداکثر هماهنگی بین رشد و تکامل جنین و اندومتر وجود داشته باشد. و بهترین زمان این هماهنگی در زمان Implantation window یعنی 6-5 روز بعد از تخمک گذاری می‏باشد (19). انتقال جنین در این زمان یانزدیک به این زمان شانس لانه گزینی را بالا می برد. در این مطالعه بدنبال انتقال جنین حاصل از ICSI تاخیری (تخمک دو روزه ) بعد از حدود 5 روز از تخمک گذاری داخل رحم یک مورد حاملگی منجر به تولد نوزاد طبیعی و سالم حاصل شد. انتقال جنین در زمان Implantation window در این مورد میتواند توجیه کننده حاملگی در این مورد باشد.

علاوه بر این مطالعه، مطالعات دیگری نیز وجود دارد که حاملگی و تولد نوزاد سالم را گزارش نموده اند. اگر چه هنوزگزارشی از اختلالات ژنتیکی متولدین ناشی از ICSI بر روی تخمک های یک روزه و دو روزه نشده است (9و 8 و7). ولی بسیار زود است که بدون هیچگونه تردیدی به سلامت این نوزادان اطمینان حاصل نمود زیرا این نوزادان از نظر تئوری در معرض خطر بیشتر اختلالات سیتوژنتیکی می باشند و تعداد چنین نوزادانی بسیار کم بوده و از این درصد کم نمی‏توان نتیجه گیری نمود، لذا بهتر است در اینگونه موارد از تشخیص ژنتیکی قبل از تولد استفاده گردد. با توجه به میزان کم حاملگی و اختلالات کروموزومی بالا، ICSI تاخیری و حاملگی موفق بعد از انجام ICSI بدنبال شکست قبلی IVF (20)، استفاده از این روش بعنوان روش درمانی، مورد قبول عده‏ای نمی‏باشد. این گروه بدلیل میزان بالای باروری و تقسیم سلولی بدنبال ICSI تأخیری از این روش بعنوان مقاصد تشخیصی استفاده می کنند این روش میتواند پیش آگهی ICSI روی تخمک های تازه در سیکل های بعدی را مشخص نماید.

نتیجه‏

نتیجة نهایی اینکه دلایل موجود حاکی از آن است که ICSI تاخیری یکی از راههای نجات اختلال باروری کامل یا نزدیک به کامل در سیکل های IVF می باشد. این روش باید در مواردی که بنظر نمی رسد کیفیت تخمک عامل اختلال باروری می باشد در اولین فرصت بعد از تائید عدم باروری بدنبال IVF انجام شود. از آنجائیکه از نظر تئوریک پتانسیل خطر اختلالات سیتوژنتیکی در این جنین ها افزایش می یابد، بهتر است تشخیص ژنتیکی قبل از تولد در حاملگی های ناشی از ICSI تأخیری انجام شود.

تقدیر و تشکر

از همکاران محترم گروه جنین شناسی و آزمایشگاه جنین شناسی و همچنین همکاران محترم اتاق عمل پژوهشکده رویان بواسطه همکاری در انجام این تحقیق و از سرکار محترم خانم دکتر اشرف معینی و سرکار محترم خانم صادقی بواسطه پی گیری مراحل حاملگی و زایمان و تولد نوزاد ، تقدیر می‏گردد.

  1. Kruger TF, Coetzee K. The role of sperm morphology in assisted reproduction. Hum Reprod Update. 1999 5(2):172-8.
  2. Trounson A, Webb J. Fertilization of human oocytes following reinsemination in vitro.Fertil Steril. 1984,41(6):816-9.
  3. Pampiglione JS, Mills C, Campbell S, et al. The clinical outcome of reinsemination of human oocytes fertilized in vitro. Fertil Steril. 1990, 53(2):306-10.
  4. Malter H, Talansky B, Gordon J, et al. Cohen J. Monospermy and polyspermy after partial zona dissection of reinseminated human oocytes. Gamete Res. 1989, 23(4):377-86.
  5. Imocdcmbc DAG, Ligue AB. The influence of subzonal microinsemination of oocytes failing to fertilize in scheduled routine in vitro fertilization cycles. Hum Reprod 1994, 51:139-48.
  6. Tsirigotis M, Nicholson N, Taranissi M, et al. Late intracytoplasmic sperm injection in unexpected failed fertilization in vitro: diagnostic or therapeutic? Fertil Steril. 1995, 63(4):816-9.
  7. Yuzpe AA, Liu Z, Fluker MR, et al. Rescue intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-salvaging in vitro fertilization (IVF) cycles after total or near-total fertilization failure. Fertil Steril. 2000, 73(6):1115-9.
  8. Morton PC, Yoder CS, Tucker MJ, et al. Reinsemination by intracytoplasmic sperm injection of 1-day-old oocytes after complete conventional fertilization failure. Fertil Steril. 1997, 68(3):488-91.
  9. Boldt J, Howe AM, Butler WJ, et al. The value of oocyte reinsemination in human in vitro fertilization. Fertil Steril. 1987,48(4):617-23.
  10. Nagy ZP, Staessen C, Liu J, et al. Prospective, auto-controlled study on reinsemination of failed-fertilized oocytes by intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 1995, 64(6):1130-5.
  11. Sjogren A, Lundin K, Hamberger L, et al. Itracytoplasmic sperm injection of 1- day- old oocytes after fertilization failure (letter). Hum Reprod. 1995,10:947.
  12. Lundin K, Sjogren A, Hamberger L, et al. Reinsemination of one-day-old oocytes by use of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril. 1996, 66(1):118-21.
  13. Bongso A,Fong CY, Ng SC, et al. Fertilization, cleavage, and cytogenetics of 48-hour zona-intact and zona-free human unfertilized oocytes reinseminated with donor sperm. Fertil Steril. 1992, 57(1):129-33.
  14. Van Steirteghem A, Nagy Z, Liu J, et al. Verheyen G,Smitz J, Tournaye H, Liebaers I, Devroey P. Intracytoplasmic sperm injection (Review). Ba Clin Obstet Gynecol. 1994, 8(1):85-93.
  15. Nagy ZP, Joris H, Liu J, et al. Intracytoplasmic single sperm injection of 1-day-old unfertilized human oocytes. Hum Reprod. 1993, 8(12):2180-4.
  16. Plachot M, de Grouchy J, Junca AM, et al. Chromosome analysis of human oocytes and embryos: does delayed fertilization increase chromosome imbalance? Hum Reprod. 1988, 3(1):125-7.
  17. Van Steirteghem AC, Nagy Z, Joris H, et al. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod. 1993, 8(7):1061-6.
  18. Tabibzadeh S,Babaknia A. The signals and molecular pathways involved in implantation, a symbiotic interaction between blastocyst and endometrium involving adhesion and tissue invasion (Review). Hum Reprod. 1995, 10(6):1579-602.
  19. Benadiva CA, Nulsen J, Siano L, et al. Intracytoplasmic sperm injection overcomes previous fertilization failure with conventional in vitro fertilization. Fertil Steril. 1999, 72(6): 1041-4.
  20. World Health Organization. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm -cervical mucus interaction,third edition.New York Cambridge University Press. 1992, 3-15, 27-8.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 1, Issue 3
Summer 2000
Pages 23-29