The effect of pentoxifytline on motility and morphology of spermatozoa from epididymal and testicular samples of infertile men

Khalili, Mohammad Ali; Vahidi, Serajoddin

The effect of pentoxifytline on motility and morphology of spermatozoa from epididymal and testicular samples of infertile men

Authors

Mohammad Ali Khalili ¹

Serajoddin Vahidi ²

¹ Embryology Department, Shahid Sadoughi Medical Sciences University, Yazd, Iran

² Urology Department, Shahid Sadoughi Medical Sciences University, Yazd, Iran

Abstract

There are generally three factors involved in male infertility:low count, weak motility, and abnormal morphology of spermatozoa. Currently, it is impossible to improve the quality of sperm count and morphology in vitro . However, it may become possible to improve the sperm motility with the application of motility enhancer medicine. The objective of this study was to evaluate the effect of pentoxifylline(PX) on sperm motility and morphology of asthenozoospermic epididymal and testicular samples. The specimens were retrieved with percutaneous epididymal sperm aspiration (PESA) and testicular sperm extraction (TESE) from men with obstructive azoospermia. A total of 40 PESA and 40 TESE samples were allocated to this prospective study. Following preliminary evaluation, each sample was processed with swim up procedure and then divided into two aliquots of control (non –PX ) and PX (3.5 mM PX). Following 45 min of incubation at 37C, the percentages of motility and normal morphology of spermatozoa were evaluated using Mackler chamber and papaniclau staining techinque, respectively. The mean sperm counts in the PESA and TESE groups were 7.47.3106 and 2.431.3x106, respectively. The percentages of normal morphology in the above groups were 22.6711.6 and 14.99.2 which were respectively changed to 23.215.7 and 9.51.9 with PX incubation. In addition, the percentage of control progressive motility in the PESA and TESE samples were 13.94.2% and 0.260.6% which were increased to 20.19.7% (p < 0.001) and 0.950.03% (p < 0.05). These results strongly suggest that PX was successful in enhancing sperm motility particularly in the PESA group. It also did not have any significant side effect on sperm morphology. PX is considered to be safe and cheap, with easy application which may be used for improving the male infertility treatment program. With its dual role as motility enhancer and vitality detector of spermatozoa, it can be used safely for the ICSI treatment of severe cases of asthenozoospermia.

Keywords

Infertile men

morphology

motility

pentoxifylline

مقدمه

امروزه، بیش از 60 میلیون نفر از مردم جهان با مشکلات ناباروری در برهه ای از زندگی مشترک خود مواجه هستند، و این در حالی است که در نیمی از موارد، مردان به نحوی عامل ناباروری می‏باشند. در حدود 10% موارد، عدم وجود اسپرم در مایع انزال علت اصلی ناباروری مردان می باشد. هر گاه در ناحیه ای از مجاری دستگاه تناسلی انسداد ایجاد شود سلولهای اسپرم قادر به عبور از مجاری نخواهند شد و به آن آزوسپرمی انسدادی اطلاق می شود (1و2).

در جهان برای اولین بار Pryor و همکاران در سال 1984 روش تخلیه اسپرم از ناحیه اپیدیدیم را انجام دادند (3). این روش به PESA معروف شد. در همین راستا، اولین نوزاد به روش فوق توسط Silber و همکاران بدنیا آمد (4).متاسفانه درصد موفقیت PESA با روشIVF بعلت تحرک ضعیف سلولهای اسپرمی بسیار پایین بود. البته باید اذعان نمود که قابلیت باروری این اسپرمها توسط محققین گزارش شده است (5). در افراد آزوسپرمی انسدادی در ناحیه اپیدیدیم و یا در مجاری درون بیضه، معمولاً بعداز عمل بیحسی موضعی مستقیماً ازبیضه نمونه گیری می‏شود این روش غیرتهاجمی‏ به روش (TESE) معروف می‏باشد. اولین

تولد حاصله از روش TESE و میکرواینجکشن در سال 1996 توسط Tournaye گزارش شد (6) . با این روش میتوان به مردان آزوسپرم که علاقه به داشتن فرزند ژنتیکی خود را دارند امید زیادی داد قبلاً این دسته از بیماران می بایست در انتظار برنامه اهداء اسپرم باشند و یا فرزند خواندگی را بعنوان یک راه حل پایانی تقبل کنند. اگر چه، ‌روش ICSI+TESE موفقیتهای چشمگیری را بدنبال داشته است ولی اسپرمهای استخراج شده از بافت بیضه معمولاً فاقد تحرک پیشرونده بوده و گاهاً فاقد هر گونه تحرک می باشند (7).

یکی از روشهای استاندارد جهت افزایش قدرت تحرک اسپرم، بکارگیری داروی پنتوکسی فیلین (PX) می باشد که در محیط in vitro و در کمترین زمان میتواند افزایش تحرک اسپرم را بدنبال داشته باشد. تاریخچه استفاده این دارو به سال 1972 بر می‏گردد که در بیماریهای عروقی نظیر تصلب شرائین جهت بهبودی در وضعیت جریان خون شریانی استفاده می شد (8) در درمان ناباروری، PX در مرحله اول جهت افزایش جریان خون بیضه مصرف می شد. در چند سال اخیر، PX مورد توجه محققین آندرولوژی قرار گرفته است. PX به عنوان مهار کننده آنزیم فسفودی استراز عمل کرده و افزایش سطح cAMP سلولی را بدنبال خواهد داشت (8) این افزایش متعاقباً باعث ازدیاد گلیکولیز سلولی وتولید ATP می شود. لذا، افزایش در سطح تولید ATP میتواند افزایش تحرک اسپرم را ایجاد کند. با توجه به موارد فوق و تعداد معدود مراجعه کننده آزوسپرم به مراکز ناباروی، هدف این مطالعه بررسی اثر PX روی قدرت تحرک و مرفولوژی اسپرمهای استخراج شده از ناحیه سراپیدیدیم (PESA) و بافت بیضه (TESE) مردان آزوسپرم بوده است.

مواد و روشها

تعداد 80 مرد نابارور با مشکل آزوسپرمی انسدادی مراجعه کننده به مرکز تحقیقاتی و درمانی ناباروری یزد مورد مطالعه قرار گرفتند. از آنجا که سن و مدت ناباروری فاکتورهای دخیل در ناباروری مردان مطرح نمی باشد، در این تحقیق افراد با شرایط سنی متفاوت مورد بررسی قرار گرفتند. جمعاً 40 نمونه PESA و 40

مورد TESE مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفتند.

گروه PESA: با استفاده از بیحسی موضعی با لیدوکائین 2% و سر سوزن 21 از طریق پوست وارد ناحیه سر اپیدیدیم شده و عمل آسپیراسیون اسپرم انجام گرفت. محتویات بداخل لوله فالکن حاوی 1 میلی لیتر محیط Ham’s F10 و سرم بند ناف 10% کشیده شد. بعد از مخلوط نمودن، یک قطره l10 از نمونه با بزرگنمایی 400 مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفت. در بعضی موارد جهت دستیابی به نمونه مناسب تر بیش از یک نمونه آسپیره شده و یا از اپیدیدیم طرف مقابل نمونه گیری شد. تعداد اسپرم و سلولهای گرد مشخص شده و بعد عمل شستشو با سانتریفوژ دور rpm 2000 برای دوبار ( هر دفعه 5 دقیقه) انجام گرفت. در مرحلة بعد، رسوب بعلاوه 3/0 میلی لیتر از مایع نگهداری شد و دو نمونة (کنترل و PX) هر کدام l 100 تهیه شدند که هر دو برای 45 دقیقه در انکوباتور C °37 نگهداری شدند. مقدار استاندارد mM6/3 PX مورد استفاده قرار گرفت. در نهایت تحرک اسپرم (پیشرونده و درجا) به همراه مرفولوژی طبیعی اسپرم در هر دو نمونه کنترل و PX مورد مطالعه قرار گرفت. جهت بررسی تحرک از روش Mackler chamber استفاه شد. همچنین از هر نمونه حداقل 2 لام تهیه شده و با متانول تثبیت شدند بعد از آماده سازی لام با استفاده از درصدهای مختلف الکل، نهایتاً رنگ آمیزی اختصاصی Papaniclau طبق دستورالعمل WHO انجام گرفت (9). تعداد یکصد اسپرم از هر نمونه جهت مرفولوژی بررسی شد.

گروه TESE: با استفاده از بیحسی موضعی ، پوست اسکروتوم با استفاده از روشهای استریل جهت انجام بیوپسی آماده شد. یک برش طولی کوچک ( حداکثر 1 سانتی متر) روی پوست اسکروتوم، لایه واژینالیس و لایه سفید انجام گرفت و یک تکه کوچک (کمتر از نیم سانتی متر) از بافت مجاری منی ساز جدا شد. بلافاصله آنرا داخل لولة فالکن حاوی 1 میلی لیتر محیط قرار داده و در آزمایشگاه با استفاده از میکروسکوپ استریو و تیغ استریل به تکه های کوچکتر تبدیل شد. محتویات دوباره به لوله فالکن برگردانده و با استفاده از شیکر لوله برای مدت 2 دقیقه مخلوط شد مراحل بعد همچون PESA انجام گرفت.

یافته های پژوهشی پس از جمع آوری اطلاعات بین گروه کنترل و گروه PX با استفاده از برنامه نرم افزاری SPSS مورد ارزیابی قرار گرفتند.

نتایج

سن مردان گروه PESA بین 24 تا 48 سال مشخص شد که از نظر کلینیکی اهمیت خاصی ندارد. در ضمن، سن افراد گروه TESE بین 56-21 سال گزارش شد. وضعیت کلینیکی هر دو گروه در جدول شماره یک مشخص شده است. در ضمن تعداد 8 و 6 نمونه به ترتیب از گروههای TESE,PESA فاقد سلول گرد بودند. در گروه PESA تحرک پیشرونده و درجا از 2/4 9/13 % و 9/4 3/5% در نمونه های کنترل به 7/91/20% و 4/79% در نمونه های PX افزایش یافت. بطور کلی تاثیر ‍PX در افزایش تحرک اسپرم قابل توجه بود. در ضمن در گروه TESE حرکت پیشرونده و همچنین در جای اسپرم از 6/026/0% و 06/048/1% در نمونه‏های کنترل به 03/095/0% و 8/088/7% در نمونه‏های PX افزایش یافت. افزایش حرکت درجا در نمونه PX در مقایسه با کنترل در گروه TESE قابل توجه بود (001/0(p< همچنین درصد مرفولوژی طبیعی اسپرم در نمونه‏های کنترل PESA و TESEبترتیب 6/1167/22% و 2/99/14% بوده که هر دو به ترتیب به 7/152/23% و 9/15/9% تغییر یافته بود. بطور کلی نمونه های TESE دارای اسپرمهای بامرفولوژی غیر طبیعی بودند. نمودارهای 3-1 نشان دهنده وضعیت حرکتی اسپرم و مرفولوژی طبیعی اسپرم درPESA و TESE می باشند. همچنین نمونه های TESE دارای تعداد بیش از حد طبیعی سلولهای گرد در هر میدان دید میکروسکوپی بودند (8/1 2/9) که این میتواند بیانگر عفونتهای دستگاه تولید مثل باشد.

بحث

امروزه، مشخص شده است که سه عامل مهم در ناباروری مردان، کاهش تعداد اسپرم ، کاهش قدرت حرکتی و مرفولوژی غیر طبیعی می باشد بنابراین یک فاکتور اصلی در موفقیت سیکلهای ART فعالیت حرکتی اسپرم می‏باشد. بدیهی است که هر چه کیفیت حرکتی اسپرمها بهبود یابد، درصد موفقیت سیکل درمانی بخصوص در روشهای درمانی IUI و IVF افزایش می یابد (4و8).

بر همین اساس، در طی چند سال گذشته داروی PX در موارد کلینیکی و تجربی (حیوانی) در تعدادی از مراکز ناباروری جهان مورد مطالعه قرار گرفته است.PX بسهولت در آب حل شده و دارای نیمه عمر طولانی می‏باشد، در ضمن میتواند در بهبودی واکنش آکروزومی و همچنین در تشخیص اسپرم زنده از مرده موثر باشد (7و10). بنابراین مطالعه حاضر بر این اساس پایه ریزی شد تا تاثیر PX بر روی تحرک اسپرمهای بدست آمده از دو روش متداول TESE,PESA از مردان آزوسپرم انسدادی مورد بررسی قرار گیرد. معمولاً نمونه‏هایی که از ناحیه اپیدیدیم و یا از بافت بیضه بدست می‏آیند دچار کاهش تحرک اسپرم بوده که همین امر میتواند تاثیر مستقیم در نتیجه درمان داشته باشد. به همین علت روش ساده‏ای نظیر افزودن PX به محیط حاوی نمونه‏های PESA/TESE حائز اهمیت می باشد. در بعضی مواقع حتی میتوان بکمک PX نمونه های PESA را در سیکل درمانی IVF مورد استفاده قرار داد. درضمن، اسپرم های فعال شده موفقیت بیشتری را در سیکل های میکرواینجکشن (ICSI) کسب می نمایند. در این راستا، پروفسور Ng و همکاران (1993) در تحقیق کلینیکی خود به این نتیجه رسیدند که موفقیت ICSI وابسته به تزریق یک اسپرم زنده (با مرفولوژی و تحرک طبیعی) و یا افزایش تحرک اسپرم با PX و یا دیگر ترکیبات افزاینده تحرک مانند 2-deoxyadenosine می باشد (11).

بعضی از صاحبنظران نظیر Mekinneyو همکاران 1994، Yovich و همکاران 1990، Tesarikو همکاران 1992 بر این عقیده اند که مقدار استاندارد PX جهت افزایش تحرک اسپرم بدون ایجاد اثر سوء ناشی از سمیت آنm M 6/3 (mg/ml1) می‏باشد و باید بعد از زمان تقریبی یک ساعت با شستشوی مجدد، PX را از محیط نمونه خارج نمود (8،12،13). به همین علت در مطالعه حاضر مقدار معین شده فوق برای مدت 45 دقیقه در نمونه های آزوسپرمی نگهداری شد. در ضمن مرفولوژی اسپرمها نیز درگروه PX مورد بررسی قرار گرفتند تا نقش PX بر روی ساختار مرفولوژیکی اسپرمهای نمونه های TESE/PESA که معمولاً دچار نقص ساختمانی هستند بررسی شود. از اهمیت PX اینکه، در مدت کمتر از یکساعت توانست تحرک در جا و پیشرونده اسپرمها را افزایش دهد ولی تاثیر سوء قابل توجه‏ای بر روی مرفولوژی اسپرم ایجاد ننماید. البته باید اذعان نمود که تاثیر PX بر روی مرفولوژی اسپرم نیاز به مطالعات متعدد واستفاده از میکروسکوپ الکترونی می باشد. همچنین باید تاثیر PX را بر روی نمونه‏های اسپرم طبیعی و با مرفولوژی غیر طبیعی مورد مطالعه دقیق قرار داد.

گروه Yovich در سال 1990 بیان نمودند که PX در افزایش تحرک اسپرمی در نمونه های آستنواسپرمی و همچنین الیگواسپرمی بسیار موفق می باشد. گر چه PX نقشی را در افزایش تعداد اسپرم متحرک ایفا نخواهد کرد (8). بر خلاف نتایج گروه فوق، Tesarik از فرانسه نتوانست افزایش چشمگیری را در تحرک اسپرمهای انزالی نورمواسپرمی مشاهده کند (12). ظاهراً PX تاثیر بیشتری بر روی نمونه های استنوآزوسپرمی دارد. از دیگر خصوصیات PX باقی ماندن اثر آن بر روی اسپرم حتی بعد از شستشو و جداسازی آن از محیط کشت می‏باشد. پس از شستشوی PX از محیط، تحرک اسپرمها برای 3 ساعت باقی میماند، که این امر میتواند اسپرمهای بدست آمده از طریق PESA را جهت نفوذ به تخمک در محیط آزمایشگاه (IVF) یاری دهد. در ضمن، وضعیت نمونه های TESE را تا زمان انجام ICSI در حد مطلوب نگه دارد. اخیراً Tasdemir و همکاران (1998) و Angelopoulos (1999) گزارش نمودند که انکوبه نمودن نمونه TESE با PX برای 30 دقیقه میتواند در افزایش چشمگیر تحرک اسپرم نقش داشته باشد (7و14). آنها افزایش 50% و 70% در تحرک اسپرمهای TESE را به ترتیب بعد از 30 و 90 دقیقه با PX مشاهده نمودند. مطالعة ما نشان داد که نمونه های آزوسپرمی معمولاً دچار نقص در تعداد و مرفولوژی اسپرم می‏باشند. در ضمن نمونه های TESE دارای تعداد زیادی سلولهای گرد بودند که می‏تواند گویای عفونت دستگاه تولید مثل باشد یک رابطه مستقیم بین افزایش تعداد سلول گرد با فعالیت باکتریهای بیماری زا گزارش شده است. بنابراین اختلال در پارامترهای اسپرمی به همراه وجود سلولهای گرد (نظیر نمونه‏های آزوسپرمی مطالعه ما) ممکن است باعث کاهش و یا عدم تحرک اسپرم گردد (15).

نتایج حاصله از این تحقیق مشخص نمود که PX در هر دو گروه موفق بوده است. نقش PX بخصوص در افزایش حرکت در جا اسپرم TESE حائز اهمیت است. همچنین باید در نظر داشت که انکوبه نمودن نمونه با PX در نمونه های فاقد تحرک میتواند نقش یک تست حیاتی را بخوبی ایفا نماید. از آنجا که در روش ICSI فقط یک اسپرم زنده بداخل تخمک بالغ تزریق می‏گردد.(علامت حیات در موقع تزریق حرکت اسپرم می‏باشد). تشخیص یک اسپرم زنده از مرده در نمونه های فاقد تحرک اهمیت کلینیکی خاصی را دارد. Buch و همکاران اسپرمهای TESA منجمد - ذوب شده را با PX مورد بررسی قرار داده و 120 دقیقه بعد از اضافه نمودن PX به محیط، افزایش 30% در تحرک پیشرونده اسپرم را به ثبت رساندند (16).

بطور خلاصه افزودن PX به محیط حاوی اسپرم میتواند باعث افزایش تحرک اسپرم شود و بالعکس اثر سوء بر روی مرفولوژی اسپرم ایجاد ننماید. علاوه بر موارد فوق، PX در بهبودی واکنش آکروزومی نقش دارد و همچنین میتواند بعنوان یک تست حیاتی مناسب مورد استفاده قرار گیرد. در ضمن، Yovich و همکاران (1993) بیان نمودند که PX همچنین میتواند در از بین بردن رادیکالهای آزاد که معمولاً از اسپرمهای دژنره و نکروزه آزاد می شود نقش داشته باشد (10). بنظر می رسد که PX بتواند این نقش را در نمونه های TESE که معمولاً از نظر کیفی از وضع نامطلوبی برخوردارند بخوبی ایفا نماید. موارد ذکر شده همگی می توانند در نتایج باروری و تشکیل جنین نقش داشته باشند. گر چه تاثیر PX بر روی باروری و تشکیل جنین آزمایشگاهی باید بدقت مورد مطالعه قرار گیرد. آنچه در حال حاضر مسلم است اینکه PX را میتوان بدون نگرانی در نمونه های غیر نرمال مورد استفاده قرار داد بشرط اینکه از محیط بطور کامل شستشو و جدا گردد. تا خطر احتمالی سمیت آن بر روی جنین در حال رشد گردد.

تشکر و قدردانی

از کلیه پرسنل آزمایشگاه آندرولوژی مرکز ناباروری یزد، خصوصاً خانمها فخرالزمان مقیمی و حبیبه قیصری خانم کوشکی و کادر پرستاری و پذیرش مرکز صمیمانه تشکر و قدردانی می شود.

Tournaye H, Devroey P, Liu J. Microsurgical epididymal sperm aspiration and intracytoplasimc sperm injection a new effective technique in absence of the vas deferens. Fertil Steril. 1994, 61:1045-51.
Mansour R, Aboulghar M, Serous G. Intracytoplasmic sperm injection using microsurgically retrieved epididymal and testicular sperm. Fertil Steril. 1996, 65:566-72.
Pryor J, Parsons J, Goswamy R. In vitro fertilization for men with obstructive azoospermia. Lancet. 1994, 2:762.
Silber SJ, Nagy PZ, Liu J. Conventional in vitro fertilization versus intracytoplassmic sperm injection for patients requiring microsurgical sperm aspiration. Hum Reprod. 1994, 9:705-9.
Temple–Smith PD, Southwick GJ, Yates CA.Human pregnancy by in vitro fertilization using sperm aspirated from epididymis. J in Vitro Fert ET. 1985, 2:119-22.
Tournaye H, Liu J, Nagy PZ. Corerlation between testicular histology and outcome after intracytoplasmic sperm injection using testicular spermatozoa.Hum Reprod. 1996, 11: 127-32.
Tasdemir I, Tasdemir M, Tavukcuoglu S. Effect of pentoxifylline on immotile testicular spermatozoa. J Assist Reprod Genet. 1998, 15:90-2.
Yovich JM, Edirisinghe WR, Cummins JM, et al. Influence of pentoxifylline in severe male factor infertility. Fertil Steril. 1990, 53: 75-22.
World Health Organization. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple Cambridge Uni press. 1993.
Yovich JL. Pentoxifylline. actions and applications in assisted reproduction.Hum Reprod. 1993, 8:1786-91.
Ng FLH, Liu DY, Baker GH. Comparison of percoll, mini-percoll, and swim–up methods for sperm preparation from abnormal semen samples. Hum Reprod. 1993, 7:261-6.
Tesarick J, Thebault A, Testart J. Ettect of pentoxifylline on sperm movement charachteristics in normozoospermic and asthenozoospermic specimens. Hum Reprod. 1992, 7:1257-63.
Nckinney KA, Lewis M, Thompson S. Persistent effects of pentoxifylline on human sperm motility after drug removal in normozoospermic and asthenozoospermic individuals. Andrologia. 1994, 26:235-240.
Angelopoulos T, Adler A, Krey L, et al. Enhancement of initiation of testicular sperm motility by in vitro culture of testicular tissue. Fertil Steril. 1999, 71:240-3.
Khalili MA, Pourshafie MR, Saifi M, et al. Bacterial infection of urogenital of infertile men in Iran. MEFS J 2000.
Buch JP. Philips KA. Kolon T. Cropreservation of microsurgical extracted ductal sperm: Pentoxifylline enhancement of motility. Fertil Steril. 1994, 62:418-20.