از میان فعالیتهای متعدد متابولیک و سنتتیک سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم، سنتز و ترشح پروتئین یکی از مهمترین و شناخته شده ترین آنها می باشد(1). طی 15-10 سال گذشته مطالعات زیادی معطوف این ترشحات پروتئینی و نقش آنها در بلوغ اسپرم گردیده است (4،3،2). تعداد پروتئینهایی که درهرگونه توسط نواحی مختلف اپی دیدیم ترشح می شود به 200-150 عدد می رسد. اغلب این پروتئینها دارای مقادیر بسیار ناچیز بوده که شناسائی و سنجش آنها با استفاده از تکنیکهای معمول بسیار مشکل می باشد. بطوریکه کمتر از 10 عدد از این پروتئینها بیش از 90% پروتئینهای ترشحی راتشکیل می دهند (5). درقوچ تنها دو عدد آنها بیش از 52% پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم را تشکیل می دهند (6).
ازطرف دیگر یکی از مهمترین تغییراتی که همراه با حرکت و بلوغ اسپرم درطول اپی دیدیم مشاهده می شود تغییر در پروتئینها و گلیکوپروتئینهای سطح اسپرم و به طور کلی شاخصهای آنتی ژنی سطح اسپرم می باشد. تغییر در پروتئینهای سطح اسپرم درطول اپی دیدیم متناسب با تغییر در الگوی ترشح پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم می باشد (3،7،8). بخشی از پروتئینهای ترشحی درمجرای اپی دیدیم به سطح اسپرم متصل گردیده و به طور مستقیم یا غیر مستقیم باعث القاء تغییراتی در غشاء پلاسمائی و یا درون اسپرم می گردند (9،10) القاء چنین تغییراتی به احتمال زیاد وابسته به قدرت اتصال پروتئینهای مذکور با سطح اسپرم می باشد. برای بسیاری از این پروتئینها اتصال ناشی از گرادیان غلظت آنها در طول اپی دیدیم است. با کاهش غلظت آنها یا تغییر در قدرت یونی محتویات درون مجرا، پروتئینهای مذکور مجدداً از سطح اسپرم جدا می گردند. غالباً اتصال اختصاصی یک پروتئین به سطح اسپرم است که باعث ایجاد تغییر درغشاء و یا عملکردهای اسپرم می گردد (5،7،9،11). کاربرد روشهای ایمونوشیمیائی نیز مؤید وجود آنتی ژنهای مشترک بین سطح اسپرم بالغ ( درانتهای اپی دیدیم ) و ترشحات پروتئینی سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم می باشد (5،11،35).
بلوغ اسپرم در اپی دیدیم همراه با توسعة چند عملکرد زنده ماندن، تحرک، قدرت شناسائی واتصال به تخمک می باشد (12،3،2). نسبت دادن توسعة هریک از این عملکردها به یک یا چند پروتئین ترشحی سلولهای اپی تلیال مشکل است. زیرا عملکردهای فوق زمانی در اسپرم ظاهر می گردد که طیف وسیعی از تغییرات به طور متوالی و یاهمزمان طی عبور اسپرم از اپی دیدیم درساختمان آن ایجاد گردد (12). ولی بوسیلة کاربرد تست مهار توسط آنتی بادی، با اتصال آنتی بادی اختصاصی به هر یک از پروتئینهای سطح اسپرم و در نتیجه مهار عملکرد آنها تغییرات ایجاد شده در زنده ماندن، تحرک، قدرت شناسائی، اتصال و لقاح تخمک، به طور غیر مستقیم معرف نقش پروتئینهای مذکور در بلوغ اسپرم و فرآیند لقاح خواهد بود ( 13و9).
هدف از تحقیق اخیر شناسایی چنین پروتئینهائی در سطح اسپرم با منشاء سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم است که در فرآیند لقاح نقش داشته باشند. یافتن چنین پروتئینهائی در ترشحات اپی دیدیم منجر به درک بیشتر از فیزیولوژی و عملکرد این اندام و نیز آگاهی از وقایع مولکولی ظرفیت پذیری ، افزایش تحرک و واکنش اکروزومی اسپرم گردیده و در نهایت امکان استفاده از آنها در شناسائی و درمان ناباروری مردان با علل ناشناخته خواهد بود. چنین پروتئینهای احتمالاً دارای کاربرد بالقوه ای در مهار کوتاه مدت و قابل برگشت باروری در مردان و در نتیجه کنترل جمعیت خواهند داشت (14و15).
کشت سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم rat و بررسی فعالیت سنتزی وترشحی سلولها در محیط in vitro و جمع آوری محیط کشت حاوی پروتئینهای ترشحی نشاندار مطابق ماخذ شماره 35 انجام گرفت.
تهیه آنتی سرم بر علیه پروتئینهای ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم
از آنجا که تخلیص بیش از 10 پروتئین ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم باخصوصیات فیزیکوشیمیائی مختلف از محیط کشت حاوی پروتئینهای FCS ( سرم جنین گوساله) کاری مشکل بوده و در صورت تخلیص فراکسیونهای حاصل حاوی بیش از یک پروتئین خواهد بود. برای بدست آوردن هر پروتئین به طور کاملاً خالص، از روش Preparative Electrophoresis با کاربرد ژل با ضخامت بیشتر و شانة دارای چاهکهای بزرگتر، حجم زیادی از محیط کشت حاوی پروتئینهای ترشحی نشاندار تحت الکتروفورز قرار گرفت. پس از رنگ آمیزی ژل توسط رنگ کوماسی بلو و حذف جزیی رنگ اضافی زمینه، برای جلوگیری از خروج پروتئینها از ژل، طی یکساعت انکوباسیون ژل درگلوتارآلدئید 2% پروتئینها به طریق کووالان به یکدیگر و احتمالاً به ژل متصل می شوند. سپس رنگ زدائی تا حذف کامل رنگ زمینه ژل ادامه می یابد. برای تشخیص باندهای حاوی پروتئین نشاندار، نوار باریکی از کناره ژل را بریده و به قطعاتی با عرض5 میلی متر تقسیم می شود. برای محلول نمودن ژل و خروج پروتئین نشاندار از آن، قطعات ژل برای مدت یکساعت در آب اکسیژنه 15% در بن ماری جوش قرار گرفته، پس از حل شدن ژل با افزودنml5 مایع سنتیلاسیون، بهl 100 محلول حاصل شمارش تابش برای تمامی قطعات تعیین می شود. با مقایسه میزان شمارش تابش ، باندهای حاوی پروتئین نشاندار مشخص و با تکرار اندازه گیری بر روی نوار دیگری از کنارة ژل نتایج حاصل تائید می گردد.
برای جدا کردن باندهای حاوی پروتئینهای نشاندار، گلوتارآلدئید و اسید استیک ژل با شستشوی مکرر کاملاً حذف می شود. سپس باندهای مشخص شده با دقت جدا و باحذف کامل آب، قطعات ژل تبدیل به پودر می شود. (ترجیحاً توسط روش لیوفیلیزاسیون). پس از تهیه میزان کافی از هر ایمونوژن برای تمامی تزریقات و ایمونیزاسیون کامل هر حیوان، تعداد 10 خرگوش نربا سن 4-3 ماه با وزن حدود kg2 از نژاد NZW (انستیتوپاستور ایران) تهیه گردید. ایمونیزاسیون و خونگیری از حیوانات مطابق ماخذ شماره 16 انجام گرفت.
سنجش تیتر آنتی سرم پروتئینهای ترشحی
برای سنجش تیترآنتی سرم پروتئینهای ترشحی از محیط کشت حاوی پروتئینهای ترشحی غیر نشاندار به عنوان آنتی ژنهای هدف در روش الایزا (ELISA) استفاده گردید. برای این منظور l 100 از محیط کشت حاوی پروتئینهای ترشحی به چاهکهای پلیت 96 خانه الایزا اضافه کرده و پلیت برای مدت 12 ساعت ( در طول شب) در دمای C 4 انکوبه می گردد. پس از تخلیه، برای اشباع جایگاههای فعال کف پلیت، مقدار l100 محلول BSA (آلبومین سرم گاو) 5% به هر چاهک افزوده و پس از یکساعت انکوباسیون چاهکها سه بار بوسیله l 300 TPBS ( محلول 05/0% Tween در PBS ) شستشو می گردد. در مرحله بعد l100 از رقتهای سریال تا هر آنتی سرم به چاهکهای یک ردیف اضافه کرده وچاهک انتهای هر ردیف به عنوان بلانک فقط حاوی PBS می باشد. در یک ردیف نیز رقتهای سریال سرم خرگوش قبل از ایمونیزاسیون به عنوان کنترل منفی اضافه می گردد. پس از یکساعت انکوباسیون در دمای C 37 و شستشو مطابق مرحله قبل، به تمامی چاهکها l100 از رقت 1:2000 آنتی بادی کونژوگه(HRP-Conjugated Coat Anti-Rabbit-IgG DAKO A/S) اضافه کرده وپلیت برای یکساعت در دمای C37 انکوبه می گردد. در پایان این مرحله، شستشوی کامل چاهکها از کونژوگه اضافی، مانع از گسترش رنگ زمینه بویژه در چاهکهای بلانک می گردد. برای مشاهده میزان اتصال آنتی بادی کونژوگه به هر چاهک l100 سوبسترای mM, TMB)HRP 42/0 در بافر سیترات- استات M1/0 با 9/4 pH= حاوی005/0% H2O2 ) اضافه می گردد. طی 15-10 دقیقه رنگ آبی چاهکها ظاهر می گردد. با افزودن l 50 HCl (1 نرمال)، جذب نوری چاهکها سریعاً توسط دستگاه ELISA Reader در طول موج nm450 قرائت می گردد. با مقایسه میزان جذب نوری چاهکهای هر ردیف، بهترین رقت آنتی سرم به عنوان تیتر تعیین می گردد. در تمامی مراحل ایمونیزاسیون برای تعیین میزان تحریک سیستم ایمنی حیوان و تولید آنتی بادی از این روش استفاده می گردد.
بررسی وجود پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم در سطح اسپرم
پس از تولید آنتی سرم برای 8 پروتئین ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم، برای بررسی وجود هر یک از آنها در سطح اسپرم بالغ از روش الایزا استفاده گردید. واکنش هر آنتی سرم با آنتی ژنهای سطح اسپرم معرف وجود پروتئین آن و یا پروتئینی با شاخصهای آنتی ژنی یکسان در سطح اسپرم است. برای این منظور اسپرم کامل rat به عنوان آنتی ژنهای هدف در کف چاهکهای پلیت متصل گردید.
ناحیه cauda اپی دیدیم rat پس از برش و برداشت در لوله حاوی محیط کشت گرم قرار داده شد. طی یک ساعت انکوباسیون در دمای C 37 اسپرمها از درون مجرا خارج شده و در محیط کشت متحرک می گردند. اسپرمها پس از جداسازی از قطعات بافت، بایستی چندین بار با PBS شستشو داده شود تا پروتئینهای با اتصال سست در سطح اسپرم و محتویات مجرای اپی دیدیم در ناحیه Cauda کاملاً شسته شود. پس از شستشو با افزودن PBS و شمارش میکروسکوپی غلظت در حد6 10 اسپرم در میلی لیتر تنظیم می گردد. به هر چاهک پلیت l100 از مخلوط فوق حاوی 105 اسپرم اضافه می شود. طی 12 ساعت انکوباسیون در دمای C 4 ، با اتصال اسپرمها کف و جدار پلیت از اسپرم پوشیده می شود. سایر مراحل الایزا مطابق سنجش تیترآنتی سرمها انجام می شود. پس از گسترش رنگ چاهکها، آنتی سرمهائی که پروتئین آنها در سطح اسپرم باشد. شدت رنگ حاصل بیش از رنگ زمینه و چاهکهای سرم کنترل منفی می باشد.
از آنجا که هدف، سنجش میانکنش آنتی سرم با پروتئینهای سطح اسپرم می باشد، بایستی طی مراحل الایزا شرایط و محلولها به گونه ای انتخاب شود که مانع تخریب اسپرم و آزاد شدن محتویات درون سلول گردد.
بررسی اثر پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم بر روی میزان لقاح
از هشت آنتی سرم تولید شده بر علیه پروتئینهای ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم در این بخش به بررسی اثر سه آنتی سرم 20و24و72 کیلودالتون خواهیم پرداخت زیرا آنتی سرمهای فوق با سطح اسپرم واکنش رنگی مثبت داده که دلیل بر وجود آنها در سطح اسپرم می باشد. لقاح خارج رحمی (IVF) در rat در محیط mKRB انجام شد (17). برای تهیه سوسپانسیون اسپرم بخش ابتدای ناحیه cauda به طور استریل برداشت و در محیط گرم mKRB قرار داده می شود. طی یک ساعت درانکوباتورCO2 اسپرمهای متحرک ازاپی دیدیم خارج و در محیط کشت شناور میگردند. با برداشت اسپرمهای متحرک و انتقال به محیط لقاح تازه، طی 3-2 ساعت انکوباسیون مجدد در انکوباتور CO2 ظرفیت پذیری اسپرمها در محیط لقاح حاوی BSA کامل می گردد.
برای تهیه تخمک، تعداد مورد نیاز rat ماده با سن حدود 2 ماه از نژاد Wistar (انستیتو پاستور ایران) تهیه گردید. برای انطباق با شرایط جدید (14 ساعت روشنائی، 10 ساعت تاریکی و شروع روشنائی 6 صبح ، دمایC 25-20 ، رطوبت (75-50 درصد)) حداقل 2 هفته در حیوانخانه نگهداری می شوند. تحریک تخمک گذاری بوسیله تزریق گنادوتروپینها انجام گرفت. برای این منظوربه هرحیوانIU 20 PMSG (Folligon,Invert,Holland) در ساعت AM 00/8 به صورت IP تزریق گردید. 58-56 ساعت بعد، بین ساعت PM 4-2 ، IU20 hCG (Organon,Holland) به صورت IP تزریق شده و 18-16 ساعت بعد در ساعت AM10-8 با کشتن حیوانات ، بخش ابتدای لوله های فالوپ حاوی تخمکهای آزاده شده به صورت استریل برداشت و به قطرات حاوی l400 محیط لقاح منتقل می شود. با پاره کردن لوله های فالوپ تخمکها بداخل محیط لقاح آزاد می شوند. تودة کومولوس حاوی 20-15 تخمک به قطرات حاوی محیط تازه منتقل شده و به ازاء هر تخمک 104 × 5 اسپرم ظرفیت یافته به قطرات اضافه می شود. طی 5-4 ساعت عمل لقاح تخمکها کامل می گردد، با انتقال تخمکها به قطرات جدید 18-16 ساعت پس از افزودن اسپرمها، پیش هسته های پدری و مادری (PN) و پس از 24 ساعت جنین دو سلولی قابل مشاهده خواهد بود.
چون در rat مشاهده PN با استفاده از استرئومیکروسکوپ مشکل می باشد، بایستی با استفاده از بزرگنمائی بالا در زیر میکروسکوپ، پیش هسته ها را مشاهده نمود. برای جلوگیری از پاره شدن جنین یا اووسیت در زیر لامل، ابتدا بوسیله پارافین یک حلقه مسدود حاوی محیط کشت ایجاد نموده و جنینها را در داخل آن قرار می دهیم. وجود دم اسپرم در فضای previtilline و یا مشاهده PN نشانه لقاح تخمک می باشد. در مواردی که مشاهده PN به راحتی امکان پذیر نباشد با استفاده از رنگ آمیزی اختصاصی (Locomid) و یا رنگهای فلورسانس واکنش دهنده با DNA (اتیدیوم بروماید) هسته جنین و تخمکها را رنگ آمیزی کرده و بوسیله میکروسکوپ فلورسانس مشاهده می شود. جلوگیری از پاره شدن جنین در زیر لامل بسیار مهم است، زیرا هسته فاقد غشاء بوده و باعث پراکنده شدن کروموزومهای فلورسانس در داخل و خارج سلول شده، در نتیجه تشخیص جنین از تخمک لقاح نیافته بسیار مشکل خواهد بود.
نتایج حاصل از این بخش با استفاده از تست آماری فیشر مورد مقایسه قرار گرفت.
کشت موفق سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم rat و بررسی فعالیت سنتزی آنها با استفاده از روش فلوروگرافی انجام گرفت. جمع آوری محیط کشت پس از اتصال و پوشش تمامی کف پلیت توسط سلولهای اپی تلیال در پایان هفته اول کشت انجام و پس از حذف سلولها و زوائد سلولی شناور در C 20- ذخیره گردید. تمامی کشتها پس از یک هفته جمع آوری محیط کشت، درپایان هفته دوم حذف می گردید. با انجام کشتهای متوالی طی یک دوره زمانی از هر یک از محیطهای کشت حاوی پروتئینهای نشاندار و غیر نشاندار بیش از ml100 جمع آوری گردید.
تهیه آنتی سرم بر علیه پروتئینهای ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم
از میان تعداد 10 پروتئین ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم که به خرگوشها تزریق گردید. برای دو پروتئین 32 و 58 کیلودالتون به علت عفونت محل تزریق آنتی سرم تولید نشد. با تزریق مجدد باقیمانده دوایمونوژن در دو خرگوش جدید نیز آنتی سرم تولید نگردید، که احتمالاً بایستی ناشی از عدم حذف کامل گلوتارآلدئید و اسیداستیک موجود در ژل باشد. برای 8 پروتئین دیگر پس 3 تزریق متوالی ایمونوژنها و در صورت باقی ماندن ایمونوژن، تزریق چهارم (20،24 ،44 ،72 کیلودالتون) تیترافزایندة آنتی سرم مشاهده گردید. بطوریکه تیترآنتی سرمهای حاصل از رقت تا بیش از متفاوت بود. شکل -1 منحنی تیتراسیون آنتی سرمهای فوق را نشان میدهد.
شکل 1 : منحنی تیتراسیون آنتی سرمهای تولید شده برای پروتئینهای ترشحی اپی تلیال اپی دیدیم، فلشهای روی منحنی بالاترین و پایین ترین رقت اپتیمم را نشان می دهد.
بررسی وجود پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم درسطح اسپرم
بررسی میانکنش 8 آنتی سرم فوق با سطح اسپرم rat به روش الایزا نشان داد که آنتی سرمهای تولید شده برای پروتئینهای 20و24و72 کیلودالتون با سطح اسپرم واکنش میدهند. وجود پروتنیهای20 و24 کیلودالتون در سطح اسپرم طی تکرارهای متوالی تأیید گردید. ولی آنتی سرم پروتئینkD 72 در طی 5 تکرار متوالی، دوبار واکنش رنگی مثبت بود. ولی در 3 بار دیگر واکنش رنگی مشابه کنترل منفی مشاهده گردید. برای 5 آنتی سرم دیگر شامل 34و44و52و98و135 کیلودالتون طی تکرارهای متوالی اتصال به سطح اسپرم و واکنش رنگی مشابه و در حد سرم کنترل منفی بود.
بررسی اثر پروتئینهای ترشحی اپی دیدیم بر روی میزان لقاح
فرآیند لقاح در پستانداران روندی فوق العاده پیچیده و همراه با دخالت و اتصال بین طیف وسیعی از شاخصهای آنتی ژنی پروتئینی و گلیکوپروتئینی و گلیکولیپیدی در سطح اسپرم و تخمک هر گونه می باشد (18) . در صورت عدم وجود یک شاخص آنتی ژنی خاص در سطح اسپرم یا تخمک بعید به نظر می رسد که افزودن آنتی سرم آن به محیط لقاح در مقایسه با گروههای کنترل باعث کاهش معنی داری در میزان لقاح در محیط in vitro گردد. در صورت مشاهده کاهش احتمالی در میزان لقاح، این کاهش بایستی ناشی از اتصال غیر اختصاصی آنتی سرم با پروتئینها و گلیکوپروتئینهای اصلی در سطح گامتها و در نتیجه مهار عملکرد آنها باشد. بدین دلیل در این تحقیق، تنها اثر آنتی سرمهائی که در روش الایزا با سطح اسپرم واکنش نشان دادند، شامل آنتی سرمهای 20و24و72 کیلودالتون مورد بررسی قرار گرفت. برای هر آنتی سرم بررسی در چهار گروه مختلف انجام و نتایج هر گروه حداقل 3 بار تکرار گردید. شکل 2 نتایج حاصل از این گروهها و تکرارها برای سه آنتی سرم فوق را نشان می دهد.
آنتی سرم پروتئین kD20 در مقایسه با گروههای کنترل (M+S) و(M ) باعث کاهش معنی داری در میزان لقاح می گردد. در انکوباسیون اسپرمها با آنتی سرم فوق (M+ ( A ) ) میزان لقاح بیشتر از افزودن مستقیم
آنتی سرم به محیط لقاح (M+A) بود ( 35% در مقابل 28% ). علت احتمالی آن شستشوی اسپرمها پس از انکوباسیون با آنتی سرم و جداشدن برخی از آنتی بادیها از سطح اسپرم می باشد. برای دو آنتی سرم پروتئینهای24و72 کیلودالتون نتایج کلی حاصل از سه تکرار اختلاف معنی داری در میزان لقاح در مقایسه با گروههای کنترل نشان نمی دهد. ولی دربعضی از تکرارهای دو آنتی سرم فوق، اختلاف مشاهده شده با گروههای کنترل معنی دار بود (05/0 < p ) ( تکرار اول آنتی سرم پروتئین kD72 و تکرار دوم آنتی سرم پروتئین kD24 ) اختلافات فوق هر چند معنی دار است، ولی میزان P value بسیار نزدیک به 05/0 می باشد درصورتی که برای تمامی تکرارهای آنتی سرم پروتئین kD20 که باعث مهار لقاح می شود مقدار P value کمتر از 001/0 می باشد. به احتمال زیاد اختلاف فوق بایستی ناشی از تغییر عوامل محیطی شامل دما, ترکیب و pH محیط لقاح و یاعدم ظرفیت پذیری اسپرمها باشد زیرا اسپرم rat به شرایط محیطی فوق العاده حساس است. نتیجه کلی از سه تکرار نشان دهنده عدم اثر آنتی سرمهای فوق برروی میزان لقاح در rat است. برای آنتی سرمهای فوق دوگروه کنترل استفاده گردید، در گروه کنترلی که فقط حاوی محیط لقاح بود (M)، میزان لقاح بیشتر از گروه کنترل محیط لقاح حاوی سرم خرگوش غیر ایمن (M+S ) بود، ولی این اختلاف معنیدار نبود (05/0 p ) در بررسی برای یافتن تیتر مناسب آنتی سرمها و سرم خرگوش غیر ایمن برای افزودن به محیط لقاح ، افزودن سرم خرگوش غیر ایمن با رقت کمتر از باعث کاهش معنی داری در میزان لقاح در مقایسه با گروه کنترل (محیط لقاح بدون هیچ افزودنی ، M ) می گردد. ولی در رقتهای بالاتر، هرچند کاهش ناچیزی مشاهده می شود ولی این اختلاف از نظر آماری معنی دار نیست (05/0 p ). در مطالعه فوق از رقت آنتی سرمها و سرم خرگوش استفاده گردید.
بلوغ کامل اسپرم در دستگاه تناسلی نر شامل وقایع مولکولی پیچیده و دقیقی است که درنهایت اسپرم را قادر به عبور از مجاری تناسلی ماده، رسیدن به جایگاه تخمک، ظرفیت پذیری، اتصال به زونا پلوسیدا، انجام واکنش آکروزومی، عبور از زونا، اتصال باغشاء پلاسمائی تخمک، ادغام دوگامت و درنهایت ایجاد جنین می سازد. بلوغ اسپرم از محل تولید آن در بیضه شروع شده و طی عبور اسپرم از مجاری تناسلی نر وحتی پس از تخلیه در دستگاه تناسلی ماده تارسیدن به تخمک ادامه می یابد(2.3.19). اپی دیدیم به عنوان بخشی از مجاری تناسلی نربا طول بیش از چند متر آن، بواسطه عملکرد جذبی و ترشحی سلولهای اپی تلیال داخل مجرا، محیط لازم برای بلوغ اسپرم را فراهم می سازد(20). بلوغ اسپرم دراین اندام شامل وقایع مولکولی گسترده ای است که تمامی آنها برای عملکرد نهائی اسپرم یعنی فرآیند لقاح ضروری می باشند. یکی از این روندهای بلوغی ظهور آنتی ژنهای پروتئینی و گلیکوپروتئینی و گلیکولیپیدی در سطح اسپرم می باشد(21). از آنجا که فرآیند لقاح بواسطه حضور و عملکرد و اتصال بین مولکولهای پروتئینی، گلیکوپروتئینی و گلیکولیپیدی سطح اسپرم و تخمک می باشد. درنتیجه برخی از این شاخصهای آنتی ژنی با منشاء اپی دیدیم برای انجام موفقیت آمیز مراحل نهائی لقاح یعنی اتصال اسپرم به زوناپلوسیدا و غشاء تخمک ضروری می باشند. مهار یا حذف عملکرد هریک ازاین مولکولها بایستی منجر به اختلال در فرآیند لقاح گردد(24,23,22).
از میان 200-150 پروتئینی که تصور می رود توسط اپی تلیوم اپی دیدیم پستانداران ترشح شود(5)، ما تنها قادر به تشخیص و شناسائی 30-20 عدد آنها توسط روش فلوروگرافی بودیم. از این میان حدود 10 پروتئین دارای مقادیری بودند که باند متراکم و پررنگی را در فلوروگرام ایجاد کنند(35). برای تولید آنتی سرم اختصاصی برعلیه هریک از این پروتئینها، روش مطلوب تخلیص هریک از این پروتئینها به صورت یک فراکسیون کاملاً خالص درحد میلی گرم و تزریق پروتئین خالص به حیوان است(25). ولی به علت افزودن FCS به محیط کشت سلولها و مقادیر کم پروتئینهای ترشحی، بخش عمده آنها طی روشهای کروماتوگرافی از دست رفته و به علت تعداد زیاد پروتئینهای محیط کشت، فراکسیون نهائی کاملاً خالص نمی باشد. ازطرف دیگر به علت عدم سمیت ژل پلی اکریل آمید برای حیوان، قدرت جداسازی بسیار عالی روش SDS - PAGE و امکان انجام جداسازی برروی حجم زیاد نمونه محیط کشت حاوی پروتئینهای ترشحی نشاندار(Preparative Electrophoresis)، جداسازی پروتئینها بدین روش انجام شد(26). هرچند مقادیر پروتئینهای ترشحی ناچیزاست ولی به علت حجم زیادی از محیط کشت که تحت الکتروفورز قرار می گیرد، باندهای قابل روئیتی راپس از رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو ایجاد می کنند. برای اطمینان و تائید ترشحی بودن پروتئین باندهای تعیین شده، میزان شمارش تابش باندهای پروتئینی تعیین ودرمقایسه با الگوی فلوروگرام، 10 پروتئین مورد نظر انتخاب گردید. از آنجا که تولید آنتی سرم برای یک ایمونوژن به عوامل زیادی وابسته بوده و یک پدیده صددرصد نمی باشد. برای دو پروتئین 58,32 کیلودالتون آنتی سرمی تولید نگردید. از 8 آنتی سرم تولید شده تنها 3 آنتی سرم با سطح اسپرم واکنش رنگی دادند. بدین ترتیب 5 پروتئین دیگر، درسطح اسپرم نبوده، ولی دارای عملکردهای دیگری در روند بلوغ اسپرم می باشد. اثبات وجود دو پروتئین 24،20 کیلودالتون درسطح اسپرم ممکن است این فکر را ایجاد کند که این دو پروتئین در مقایسه با 5 یا 6 پروتئین دیگر نقش مهمتر و ضروری تری در بلوغ اسپرم و فرآیند لقاح دارند. ولی این ایده واقعیت ندارد. بطوریکه بسیاری از مطالعات نیز موید این مطلب است. آنزیم GGT (گاماگلوتامیل ترانسپپتیداز) توسط اپی تلیوم اپی دیدیم ترشح شده و نقش اصلی آن حذف گونه های فعال اکسیژن (ROS) و محافظت اسپرم دربرابر رادیکال های آزاد اکسیژن می باشد. آنزیم فوق درسطح اسپرم وجود ندارد ولی به میزان زیاد در مجرای اپی دیدیم یافت می شود. اختلال در ژن و یا عدم بیان آن منجر به ناباروری جنس نر می گردد(27). برخلاف آن آکروزین (28) و گالاکتوزیل ترانسفراز (29) دو پروتئین موجود در سطح اسپرم بوده و نقش مهمی در عملکرد اسپرم دارند. اختلال در بیان دو ژن فوق اختلالی در باروری جنسی نر ایجاد نخواهد کرد. نتایج حاصل از این مطالعه نیز موید تحقیقات فوق است. آنتی سرم پروتئین kD24 با سطح اسپرم واکنش داده، که معرف وجود آن در سطح اسپرم بالغ انتهای اپی دیدیم می باشد. افزودن آنتی سرم اختصاصی آن به محیط لقاح و یا انکوباسیون اسپرم با آنتی سرم باعث اتصال پروتئین با آنتی بادیهای اختصاصی خود شده واحتمالاً عملکردآن مهار می گردد. ولی نتایج حاصل از لقاح خارج رحمی اختلاف معنی داری را با گروه کنترل نشان نمی دهد. این نتیجه گیری ممکن است این سوال را برانگیزد پس چرا تنها اثر آنتی سرمهای واکنش دهنده با سطح اسپرم مورد بررسی قرارگرفت؟
عدم وجود پروتئینهای فوق درسطح اسپرم، معرف عملکرد آنها درطول اپی دیدیم برای فراهم آوردن محیط لازم برای بلوغ اسپرم می باشد(همانند GGT). هرگاه هدف بررسی عملکرد آنها باشد، بایستی با مهار بیان ژن آنها در محیط in vivo و عدم ترشح پروتئینها مذکور اثر تک تک آنها مورد بررسی قرارگیرد و یاروش ساده، ولی با دقت کمتر، هم کشتی سلولهای اپی تلیال اپی دیدیم با اسپرمهای نابالغ بیضه و یا اسپرمهای ابتدای اپیدیدیم درحضور و عدم حضور آنتی سرم هریک از پروتئینهای مذکور می باشد. دراین مطالعه اسپرمی که از انتهای اپیدیدیم برداشت می شود تمامی مراحل بلوغ خود را در مجاورت این فاکتورها در محیط in vivo ( اپی دیدیم حیوان ) طی کرده است و افزودن آنتی سرم آنها موجب برگشت مراحل بلوغ اسپرم نخواهد گردید.
یافته های ما در مورد کاهش میزان لقاح توسط آنتی سرم پروتئین kD20 نیز کلی و خام است. زیرا مجاورت اسپرم و تخمک و انجام عمل لقاح شامل مراحل پیچیده و متعددی است که پروتئین فوق دریکی از مراحل نقش دارد. با انجام هریک از این مراحل ظرفیت پذیری و واکنش آکروزومی، اتصال به زوناپلوسیدا به طور جداگانه درمحیط in vitro درحضور یا غیاب آنتی سرم ویژه آن، نقش پروتئین مذکور مشخص تر خواهد گردید. علاوه براین، بررسی اثر آنتی سرم فوق برروی سطح اسپرم ومیزان لقاح درسایر پستانداران اطلاعات مفیدی از احتمال اشتراک پروتئین مذکور بین انواع پستانداران در اختیار قرار خواهد داد. زیرا پروتئینهایی با وزن مولکولیkD20 و خاصیت اتصال به سطح اسپرم و تاثیر برروی فرآیند لقاح، در سایر پستانداران شناسائی گردیده که شاید با این پروتئین یکسان باشند. درخرگوش پروتئین BE-20 توسط اپی تلیوم اپی دیدیم ترشح(30) و آنتی بادی اختصاصی آن باعث کاهش میزان لقاح می گردد (31). پروتئینهای R2 , R1 , EP20 نیز با همین وزن مولکولی در خرگوش شناسائی شده است(32). نکته دیگر اینکه، نبایستی پروتئین مشابه آن درسایر پستانداران حتماً دارای وزن مولکولی برابر با هم باشد. زیرا هر پروتئین پس از ترشح دچار تغییرات پروتئولیتیک زیادی می گردد و ممکن است وزن مولکولی آن درابتدا بیشتر از kD20 باشد. نمونه آن پروتئین REP38 با وزن مولکولیkD38 در ترشحات اپیتلیال اپی دیدیم خرگوش میباشد(33).
تعیین دقیق ماهیت فیزیکوشیمیائی پروتئین فوق نیازمند تخلیص آن توسط روش HPLC ویا کروماتوگرافی ایمونوافینیتی به صورت یک فراکسیون کاملاً خالص می باشد. عملکرد دقیق آن نیز نیازمند بررسی آنتی سرم آن برروی تک تک روندهای موثر در لقاح به صورت منفرد می باشد. بررسی اثر آنتی سرم فوق برروی اسپرم و مراحل لقاح در سایر پستانداران باعث شناسائی پروتئینهای مشترک و جلوگیری از کارهای اضافی انجام شده خواهد گردید. امروزه با پیشرفت تکنیکهای بیولوژی مولکولی و شناسائی ژنهای بیان شده در اپی دیدیم، مشخص گردیده که بسیاری از پروتئینهای شناسائی شده با نام و وزن مولکولی متفاوت درگونه های مختلف پستانداران و حتی در نواحی مختلف اپی دیدیم یک گونه، تماماً محصول یک ژن منفرد می باشند و اختلافات موجود ناشی از تغییرات پروتئین درطول اپی دیدیم و نمونه برداری از نقاط متفاوت ویاناشی از اشکالات تکنیکی می باشد(34,32,4).
درنهایت اینکه، در شناسائی پروتئینهای مشترک بین سطح اسپرم و ترشحات اپی تلیال اپی دیدیم rat , چهار پروتئین 54,24,20و58 کیلودالتون شناسائی گردید(35) که سه پروتئین 58,24,20 کیلودالتون آن جزء 10 پروتئین برداشت شده از ژل پلی آکریل آمید بودند ولی متاسفانه برای پروتئین kD58 آنتی سرمی تهیه نگردید. با توجه به اتصال آنتی سرم پروتئینهای 20 , 24 کیلودالتون با سطح اسپرم، دو پروتئین 58,54 کیلو دالتون نیز بایستی از ترشحات اپی دیدیم تخلیص و باتولید آنتی سرم برای هرکدام، نقش و عملکرد آنها مورد بررسی قرارگیرد. از آنجا که بیان ژن در اپیدیدیم اکثر پستانداران دارای الگوی مشابه ای می باشد یافتن چنین پروتئینهایی با نقش اساسی در قدرت باروری حیوانات آزمایشگاهی، منجر به تحقیقات جهتداری برای یافتن پروتئینهای مشابه در انسان و آگاهی از نقش آنها در قدرت باروری و نهایتاً کاربرد آنها در درمان موارد ناباروری مردان با علت ناشناخته خواهد گردید.
از مسئولین جهاد دانشگاهی، واحد علوم پزشکی ایران به جهت تأمین بخش عمدهای از هزینة مواد مصرفی و غیر مصرفی این تحقیق و نیز پرسنل بخش تحقیقات پژوهشکده رویان بویژه جناب آقای بهاروند و سرکار خانم افشاریان، بخاطر همکاری و مساعدت فراوان ایشان در انجام این تحقیق تشکر و قدردانی میگردد.
