مقدمه

در آکروزوم اسپرم پروتئین های متعددی وجود دارد که برای برخورد اسپرم با تخمک و ورود اسپرم به داخل تخمکحائزاهمیتمی باشند.اکثراین پروتئین ها آنزیم های هیدرولیتیک بوده که خاصیت هضم کنندگی دارند. یکی از این آنزیم ها سرین پروتئازی است که آکروزین (EC 3.4.21.10) نام گرفته است. در تمامی پستانداران آکروزین شامل سه قسمت زیموژن، قسمت کاتالیتیک و قسمت انتهایی می باشد (1). قسمت انتهای آمینی (زیموژن) و قسمت کاتالیتیک در پستانداران مختلف دارای شباهت نسبی بوده و دارای توالی های اختصاصی خانواده سرین پروتئازها می باشند. قسمت انتهای کربوکسیلی (قسمت انتهایی) از لحاظ پرولین غنی بوده و دارای شباهت چندانی در پستانداران مختلف نمی باشد. این قسمت مختص آکروزین بوده و در پروتئازهای دیگر یافت نمی گردد.

آکروزین در ابتدا بصورت غیر فعال پروآکروزین تولید گردیده و در هنگام واکنش آکروزمی و آزاد شدن این آنزیم، با شکسته شدن قسمت ابتدایی آن به شکل فعال خود، آکروزین تبدیل می گردد.

برای آکروزین تا بحال چند نقش در رابطه با لقاح فرض گردیده است. از آنجا که آکروزین یک آنزیم است. یکی از نقشهای آکروزین هضم زوناپلوسیدا می باشد (2). از دیگر نقشهای اکروزین اتصال اختصاصی اسپرم به زوناپلوسیدا می باشد (2).

تا کنون چند سیستم آزمایشگاهی جهت بررسی نقش آکروزین در فرآیند لقاح راه اندازی شده است (3) یکی از این سیستم ها ایجاد موش هایی است که فاقد آکروزین باشند. در این موشها که بوسیله تکنیک هدف گیری ژنی یا نوترکیبی همگون تولید می شود ژن خاصی را بطور اختصاصی از کار انداخته (4) و با از کار انداختن آن از سنتز پروتئین مربوطه جلوگیری می نمایند. سپس با انجام آزمایشهایی در روی موشهای فاقد پروتئین فوق نقش آن پروتئین مورد بررسی قرار میگیرد.

در تحقیقات ارائه شده در این مقاله ژن آکروزین موش بوسیله هدف گیری ژنی از کار انداخته شده و نقش آکروزین در باروری مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

1- ساخت ژن نوترکیب

قطعه ای از cDNA آکروزین موش جهت جداسازی قطعات ژنومیکی مورد استفاده قرار گرفت. کلون کاسمیدی حاوی ژن آکروزین موش انتخاب و پس از هضم بوسیله آنزیمهای EcoRI/KpnI قطعه ای از ژن در وکتور بلواسکریپت کلون گردید. با استفاده از این، ژن نوترکیبی حاوی نئومایسین و تیمیدین کیناز ساخته شد (شکلA1) . در این ژن نوترکیب قسمتهایی از اکسون 5 ژن آکروزین با ژن نئومایسین مورد تعویض قرار گرفته است. این ژن نوترکیب بوسیله آنزیم NotI خطی شده و برای وارد کردن در سلولهای بنیادی مورد استفاده قرار گرفت.

2- کشت سلولهای بنیادی جنینی (ES) و تولید موشهای کایمر (Chimer)

دودمان سلولهای بنیادی جنینیR1 بعد از کشت برای وارد نمودن ژن نوترکیب PA مورد استفاده قرار گرفت (4). مقداری از این سلولها پس از تریپسینه کردن با50 میکروگرم از ژن نوترکیب PA مخلوط شده و بوسیله الکتروپوراسیون در شرایط V250 وF500 به داخل سلولهای ES وارد گردید. سلولها در یک محیط غیر انتخابی بر روی لایه ای از سلولها فیبروبلاست مقاوم در برابر G418 کشت داده شدند. بعد از کشت محلول حاوی G418 به مقدار g/ml350 و گانسی کلویر به مقدار g/ml2 به سلولها اضافه شده و سلولهایی مقاوم که در برابر G418 و حاوی ژن نوترکیب بطور همگون مورد انتخاب قرار گرفتند.

برای بررسی بهتر این سلولها، بعد از تخلیص DNA، این DNA با آنزیم EcoRI مورد هضم قرار گرفت و پس از الکتروفورز بر روی غشای نیتروسلولز منتقل شدند. این بلات با قطعه ای از DNA آکروزین نشاندار بوسیله 32P (شکل A1) جفت (hybrid) شدند و پس از گذاشتن فیلم بر روی این غشاء و ظاهر نمودن آن سلولهایی که دارای ژن نوترکیب بصورت همگون بودند دارای دوباند و بقیه دارای یک باند بودند (شکل B1).

از این سلولها پس از تزریق به بلاستوسیست جهت تولید موشهای کایمر استفاده شد. موشهای کایمر بعد از جفت گیری با موشهای معمولی برای تولید موشهای هتروزیگوت و موشهای هتروزیگوت برای تولید موشهای هموزیگوت مورد استفاده قرار گرفتند موشهای فاقد آکروزین در هر دو آلل PRR-/- نام گرفتند.

3- آنالیز (Northern Blot)RNA

برای تخلیص RNA از کیت RNA NOW (ITC Biotechnology) استفاده شد. RNA تخلیص شده از بیضه موشهای هموزیگوت پس از جداسازی در ژل آگارز حاوی فرمالدئید بر روی غشاء نایلون منتقل شدند. این غشا برای هیبریدیزاسیون بایک قطعه cDNA نشاندار شده آکروزین مورد استفاده قرار گرفت.

4- تست باروری

پنج موش مذکر که فاقد آکروزین بودند با 5 موش ماده معمولی جفت زده شدند بعد از حاملگی و تولد نوزادان، تعداد موشها مورد شمارش قرارگرفتند. برای لقاح خارج رحمی (IVF) از موشهای فاقد آکروزین استفاده شد پس از جداسازی اسپرم از ناحیه دم (cauda) اپی دیدیم اسپرمها در محیط آزمایشگاهی در تخمکهای معمولی قرارگرفتند. لقاح پس از زمانهای مشخص با شستن تخمکها در محلول M16 متوقف شده و حضور پیش هسته های پدری و مادری (PN) 6 ساعت بعد از توقف لقاح مورد بررسی قرار میگرفت روز بعد نیز تعداد دوسلولی ها مورد شمارش قرار می گرفت.

5- سخت نمودن لایه زوناپلوسیدا

برای سخت نمودن زوناپلوسیدا، سلولهای تخمک به مدت 30 دقیقه در معرض DMSO به غلظت های 6/0، 8/0، 1 و 2/1 مولار قرار گرفتند. این تخمکها سپس برای لقاح خارج رحمی مورد استفاده قرار گرفتند. برخی از تخمکها نیز به مدتهای متفاوت بعد از تزریق HCG کشت داده شدند و سپس برای لقاح خارج رحمی مورد استفاده قرار گرفتند.

نتایج و بحث

در تحقیق حاضر ژن آکروزین موش بوسیله روش هدفگیری ژنی از کار انداخته شد و وظیفه آکروزین در باروری در این موشها مورد مطالعه قرار گرفت. DNA تخلیص شده از یک بانک ژنومیک موش 129/Sv جهت ساخت ژن همجوش مورد استفاده قرار گرفت، ابتدا ژن نئومایسین در اگزون 5 جاگذاری شده و سپس ژن تیمیدین کیناز (TK) هرپس سیمپلکس در قسمت انتهای 5 ژن همجوش قرار داده شد. این ژن همجوش (PA) جهت هدفگیری ژنی در سلولهای بنیادی جنینی (R1)بکار گرفته شد. اتصال هدفدار به داخل ژنوم بوسیله DNA قسمت انتهای 3 در ساترن بلات مورد بررسی قرار گرفت. در صورت هضم DNA بوسیله آنزیم EcoR1 ، لوکوس طبیعی kb 5/13 و لوکوس نوترکیب kb 2/15 می باشند (شکل B1). سه کلون بطور نوترکیبی همگون، ژن همجوش در آنها متصل گردید. این کلونها برای تزریق در بلاستوسیست مورد استفاده قرار گرفت از این تزریق 2 موش کایمر بدست آمد که هر دو ژن نوترکیب مورد نظر را به نسل بعد انتقال می دادند. از جفتگیری این دو موش با موشهای طبیعی موشهای هتروزیگوت تولید شدند (B1). از جفتگیری موشهای هتروزیگوت با هم، موشهای هموزیگوت تولید شدند. موشهای هتروزیگوت و هموزیگوت نر و ماده هیچگونه اختلالی را نشان نداده و بطور طبیعی بارور بودند. جهت بررسی بیان ژن آکروزین در بیضه موشهای هتروزیگوت و هموزیگوت ، از بیضه این موشها RNA کل تخلیص گردید و در نورترن بلات مورد تحلیل و بررسی قرار گرفت. در موشهای طبیعی ((+/+ آکروزین بصورت عادی و در موشهای هتروزیگوت (+/-) بصورت کاهش یافته بیان می گردید. موشهای هموزیگوت (-/-) که ژن آکروزین در آنها از کار افتاده است، فاقد بیان ژن آکروزین در بیضه می باشند (شکل 1C). جهت بررسی دقیقتر بیان ژن آکروزین نتیجه حاصل از نورترن بلات در RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. بیان ژن آکروزین در موشهای هموزیگوت (-/-) مشاهده نگردید. این نتایج نشان می دهد که موشهای هموزیگوت فاقد mRNA برای آکروزین می باشند.

در بررسی قسمت باروری، تمامی این موشها بارور بوده و هیچگونه اختلالی را نشان نمی دادند. بدین جهت برای بررسی دقیق تر اسپرم موشهای حاصل از روش لقاح خارج رحمی (IVF) استفاده گردید. همانطور که شکل (2) نشان می دهد اسپرم موشهای فاقد آکروزین (PRR-/-) 3 ساعت پس از افزودن اسپرم بطور معنی داری تعداد کمتری از تخمکها را بارور می کنند.(05/0P<) این تغییر پس از 4 ساعت بسیار کمتر گردید. این نتایج نشان می دهد که اسپرمهای فاقد آکروزین بطور آهسته تری تخمک را بارور می نمایند.

علاوه بر این پس از سخت شدن زوناپلوسیدا بوسیله DMSO اسپرمهای فاقد آکروزین تعداد کمتری از تخمکها را بارور می نمایند (05/0P<) (شکل 3). تخمکهایی که بیشتر در محیط آزمایشگاهی کشت داده شدند به میزان کمتری توسط اسپرمهای فاقد آکروزین بارور می شوند (05/0P<) (شکل 4). بررسی بافت شناسی بیضه و مورفولوژیک اسپرم موشهای فاقد آکروزین نشانگر این مطلب است که بیضه و اسپرم این موشها تفاوتی نسبت به موشهای طبیعی نشان نمی دهند. نتایج مذکور نشان میدهد که آکروزین به تنهایی در باروری تخمک دارای نقش اساسی نمی باشد. البته این اسپرمها در لقاح خارج رحمی تاخیر نشان می دهند. اگر اسپرمهای دارای آکروزین با اسپرمهای فاقد آکروزین با یکدیگر مخلوط گردند و در لقاح خارج رحمی (IVF) بکارگرفته شوند، تنها اسپرمهای دارای آکروزین قادرند تخمک را بارور نمایند. این مطلب ناشی از تاخیری است که اسپرمهای فاقد آکروزین از خود نشان میدهند.در این حالت اسپرمهای طبیعی تخمک را بارور نموده و مانع بارور شدن تخمک بوسیله اسپرمهای فاقد آکروزین می گردند.

البته در انسان در برخی مطالعات در انسان نشان می دهد که کمبود آکروزین باعث ناباروری می گردد (7-5). در مواردی نیز کمبود آکروزین ناباروری ایجاد نمی کند. این مطلب نشانگر این است که کمبود آکروزین همراه با فاکتورهای دیگر می تواند ایجاد ناباروری نماید. بر اساس یافته های تحقیق حاضر سخت شدن زوناپلوسیدا همراه با کمبود آکروزین می تواند ایجاد ناباروری نسبی نماید. در انسان نیز برخی تخمکها که دارای زوناپلوسیدای سخت یا قطورتر از زونای معمولی می باشند، در لقاح خارج رحمی دارای میزان باروری کمتری می باشند (10-8). البته احتمال دارد که در غیاب آکروزین آنزیم های دیگری در آکروزوم نقش آنرا بر عهده گرفته ودرنتیجه تاثیری در باروری دیده نمی شود.

بر اساس این نتایج آکروزین همراه با فاکتورهای دیگر در باروری موثر بوده و کمبود یا اختلال عملکرد آن می تواند ایجاد ناباروری ترکیبی نماید.

تشکر و قدردانی

پروژه حاضر در انستیتو ژنتیک انسانی گوتینگن وابسته به دانشکده پزشکی شهر گوتینگن و با همکاری پژوهشکده ابن سینا انجام گرفته است. مخارج پروژه از طرف سازمان پژوهشهای آلمان بوسیله طرح ویژه شماره 271 (SFB271) تامین گشته است.