التهاب حاد، طی چند ساعت پس از عفونت یا آسیب یک بافت ایجاد می‌شود. تحت تأثیر اینترلوکین 1، هپاتوسیتها سنتز تعداد زیادی از پروتئین‌های خود را افزایش می‌دهند. به دنبال تهاجم و آسیب بافتی غلظت پروتئین واکنشگر C (CRP) با وزن مولکولی 000/120-000/110 دالتون، تا هزار برابر میزان طبیعی افزایش یافته و ضمن فعال نمودن کمپلمان، می‌تواند به لنفوسیت‌های فعال شده، ارگانیسم‌های مهاجم و بافت‌های آسیب‌دیده متصل گردیده و به عنوان یک اپسونین غیراختصاصی، موجب افزایش فاگوسیتوز و حذف سلول‌های آسیب دیده و ارگانیسمها، تقویت ایمنی ذاتی و محافظت در مقابل آسیب نسجی شود. بنابراین CRP با افزایش سرعت ترمیم بافت‌های آسیب‌دیده، می‌تواند موجب تسریع التیام روند ترمیم بافت آسیب دیده شود. این پروتئین یک مارکر حساس واکنشهای التهابی در افراد سالم بوده که پس از تحریک هورمونی افزایش می‌یابد (1). افزایش این پروتئین به عنوان یک فاکتور حساس التهابی در خون بند ناف با کاهش وزن جنین (2) (SGA) و زایمان زودرس (3) در بارداری همراه است. افزایش CRP قبل از 30 هفتگی، باعث افزایش شانس بروز پره‌اکلامپسی می‌شود (4). استرس با افزایش سیتوکین‌های التهابی مانند IL-6 و IL-1β و CRP همراه است که این به نوبه خود با افزایش عوارض بارداری همراه است (5). همچنین ارتباط التهاب و افزایش این پروتئین با آترواسکلروز دیده شده است (2). مطالعات نشان داده که HRT (هورمون درمانی با استروژن و پروژسترون) باعث افزایشCRP می‌شود (6). این پروتئین تغییرات روزانه ندارد (7) اما تحریک تخمک‌گذاری کنترل شده تخمدان و به‌خصوص پانکچر تخمدانها در سیکل‌های IVF/ICSI، احتمالاً با درجاتی از آسیب بافتی و تغییراتی در غلظتCRP همراه است که این تغییرات در مراحل مختلف سیکل، ممکن است روی موفقیت IVF/ICSI و میزان لانه‌گزینی و بارداری مؤثر باشد. همچنین تزریق hCG صرف نظر از میزان پاسخ تخمدان، باعث فعالیت سلول‌های اندوتلیال و نوتروفیل می‌شود (8). هدف از این تحقیق، بررسی منحنی تغییرات CRP به عنوان یک فاکتور التهاب سیستمیک در مراحل مختلف سیکل IVF/ICSI در بیماران تحت درمان و ارتباط نوع تغییرات آن با میزان لانه‌گزینی و بارداری بعدی می‌باشد.
بیماران تحت مطالعه: این مطالعه از نوع مشاهده‌ای، توصیفی‌ـ تحلیلی بود و روی بیماران 38-24 ساله نابارور داوطلب IVF/ICSI طی سال‌های 86-1385 در مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا، انجام شد. پس از ثبت تاریخچه بیماری و معاینات و بررسی‌های معمول رادیولوژی (هیستروگرافی) و آزمایشگاهی زنان، و بررسی اسپرموگرام شوهران ایشان و حذف بیماران با مقادیر افزایش CRP و ناباروری ناشی از فاکتور مردانه شدید؛ 70 بیمار انتخاب شدند. کلیه بیماران تحت تحریک تخمک‌گذاری با پروتکل استاندارد طولانی مدت قرار گرفتند.
پروتکل تحریک تخمک‌گذاری: کلیه بیماران از روز 21 سیکل قبل از تحریک، تحت درمان با GnRH-a (Aventis Pharma, Germany) قرار گرفتند و سپس از روز دوم تا سوم سیکل تحریک، تحت درمان با Merional HMG؛ (IBSA, Switzerland) به میزان (150-300 واحد در روز) قرار گرفتند. پس از رسیدن اندازه حداقل 3 فولیکول غالب به mm18-16، hCG
به میزان 10000 واحد تزریق و 36-34 ساعت بعد، پانکچر تخمدانها انجام شد. پس از انجام مراحل IVF/ICSI در بخش جنین‌شناسی مرکز، جنین‌های حاصل بعد از 72-48 ساعت به داخل رحم منتقل شدند. استرادیول سرم، روز تزریق hCG اندازه‌گیری شد.
نمونه‌گیری از بیماران: سرم بیماران داوطلب IVF/ICSI، در طی سیکل COH در چهار نوبت جمعآوری شد: روز شروع تحریک تخمک‌گذاری ، روز تزریق hCG ، روز دریافت تخمک و روز انتقال جنین . همچنین در روز دریافت تخمک، یک نمونه مایع فولیکولی (FF) شفاف (بدون آلودگی به خون) جمعآوری شد. همه نمونه‌ها در g1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی تا زمان انجام آزمایشات نهایی در C20- فریز نگهداری شد و میزان CRP در نمونه‌های جمعآوری شده با روش الایزای رقابتی، مورد ارزیابی قرار گرفت.
روش کار: µl50 از آنتی‌ژن (CRP خالص شده در آزمایشگاه گروه معرف‌های تشخیص طبی) به غلظتµg/ml 10 در چاهک پلیت الایزا به مدت 2 ساعت در C37 انکوبه شد. سپس سه بار و به مدت سه دقیقه با بافر شستشو، چاهکها شستشو شد. جهت بلاک نمودن، µl150 از 1% پروتئین آلبومین سرم گاوی (BSA) به هر چاهک اضافه و به مدت 45 دقیقه در C37 قرار گرفت. شستشو مجدداً در سه مرحله انجام شد. از آنتی‌بادی خالص شده علیه CRP، رقت 1:80 تهیه کرده و به میزان µl25 به هر چاهک افزوده، آنگاه رقت سریال از غلظت µg/ml62 از پروتئین CRP تهیه و به چاهکها اضافه شد. برای کنترل منفی در یک چاهک تنها CRP با میزان µg/ml62 بدون آنتی CRP و برای کنترل مثبت در یک چاهک تنها آنتی‌بادی اختصاصی CRP با رقت 1:80 در نظر گرفته شد. برای اندازه‌گیری غلظت CRP موجود در نمونه‌های تهیه شده از بیماران، l25 از نمونه با l25 از آنتی‌بادی 1:80 به چاهک‌های پلیت الایزا اضافه و پس از مخلوط کردن و به مدت یک ساعت در C37 انکوبه شد. پس از شستشو، مقدار µl50 کونژوگه 1:1500 HRP Sheep anti human- به هر چاهک افزوده و به مدت 45 دقیقه در C37 انکوبه شد. پس از شستشوی مجدد، µl50 سوبسترای آنزیم HRP به هر چاهک اضافه و به مدت 15 دقیقه در C37 انکوبه شد. واکنش آنزیمی با افزودن µl15 اسید سولفوریک 20% متوقف و سپس جذب نوری چاهکها در طول موج nm492 توسط ELISA Reader (Anthouse, Austria) اندازه‌گیری شد. با کمک رقت سریالی تهیه شده از CRP، منحنی استاندارد تغییرات غلظت CRP به دست آمد، که بر این اساس میزان CRP در نمونه‌ها تعیین شد.
برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از آزمون‌های t زوجی، من‌ـ ویتنی، ویلکسون، فریدمن و ضریب همبستگی پیرسن نرم‌افزار SPSS ویرایش 5/11 استفاده گردید و سطح معنی‌داری 05/0p< در نظر گرفته شد.
خصوصیات بیماران تحت بررسی در جدول 1 آمده است. میانگین سنی بیماران تحت بررسی، 39/396/30 سال و میانگین مدت ناباروری، 87/261/8 سال بود. علت ناباروری در 9/28% ناشی از مشکلات تخمک‌گذاری در 5/31% علت مردانه؛ در 4/13% لوله‌ای و صفاقی. در 8/11% آندومتریوز و در 4/14% با علت نامشخص بود. با بررسی انجام گرفته روی نتایج الایزا (جدول 2) می‌توان مشاهده کرد که در تمام بیماران تحت COH، میزان CRP در روز تزریق hCG نسبت به روز شروع تحریک تخمک‌گذاری بطور معنی‌داری (001/0p<) افزایش می‌یابد (g/ml00/194/4 در مقابل g/ml92/197/3). این افزایش تا روز OPU (g/ml26/254/5) بطور معنی‌داری (001/0p<) ادامه دارد. متوسط CRP در روز انتقال جنین، g/ml16/461/6 بوده و علیرغم افزایش معنی‌دار آن (01/0p<) نسبت به روز OPU، بررسی‌های بیشتر نشان می‌دهد که این افزایش تنها در 3/54% بیماران وجود داشته و در بقیه شاهد کاهش CRP نیز بوده‌ایم. علیرغم هم بسته بودن میزان CRP در روز OPU با میزان آن در مایع فولیکولی (87r= و 001/0p<)، بررسیها نشان می‌دهد میزان CRP در مایع فولیکولی بطور معنی‌داری کمتر از آن در روز OPU است (به ترتیب g/ml18/217/4 و g/ml26/254/5).
جهت بررسی روند تغییرات میزان CRP، از آزمون فریدمن استفاده شد و در نتیجه ملاحظه شده که در کل نیز روند افزایش معنی‌داری در میزان CRP وجود داشت (001/0p<). همچنین نسبت CRP در هر مرحله به مراحل قبلی، محاسبه و ارتباط آن با میزان استرادیول سرم در روز تزریق hCG، سنجیده شد و در نتیجه ملاحظه شده علیرغم وجود یک ارتباط معکوس (افزایش استرادیول همراه با کاهش میزان تغییرات CRP) در تمام موارد، این ارتباط از نظر آماری معنی‌دار نبوده است.
CRP یک مارکر حساس در واکنشهای التهابی به شمار می‌رود. افزایش این پروتئین با وقوع آتروترومبوز (6)، زایمان زودرس (3)، کاهش وزن جنین (3)، پره‌اکلامپسی (4) ارتباط دارد. همچنین نشان داده شد که استرس روانی با افزایش پروتئین‌های التهابی مثل CRP همراه بوده که می‌تواند منجر به عوارض و پیش‌آگهی بد در بارداری شود (5). مطالعات نشان می‌دهد CRP با سن ارتباط داشته و در خانمها بالاتر از آقایان می‌باشد. همچنین اختلاف معنی‌داری بین میزان CRP در افراد نابارور و بارور غیر باردار گزارش نشده است (9). Störk و همکارانش نشان دادند که استفاده از استروژن در خانم‌های یائسه، با افزایش CRP در سرم همراه است (10). همچنین تجویز استروژن اگزوژن، منجر به افزایش و پروژسترون اگزوژن، با کاهش CRP همراه است؛ این در حالی است که افزایش استروژن و پروژسترون اندوژن در سیکل‌های قاعدگی به میزان 10 برابر، به ترتیب با کاهش 29% و افزایش 23% در مقدار CRP سرم همراه است (11). در مطالعه حاضر، CRP با استفاده از روش الایزای رقابتی اندازه‌گیری شد که نسبت به روش لاتکس، دقیق‌تر بوده و کمی است. مطالعه ما نشان داد که میزان CRP در طول سیکل تحریک تخمک‌گذاری با پروتکل طولانی مدت افزایش می‌یابد و این افزایش، تا مرحله تزریق hCG و همچنین مرحله پانکچر و سپس انتقال جنین، ادامه دارد. مطالعه Wunder و همکارانش نشان داد که لپتین و CRP در طی سیکل تحریک تخمک‌گذاری، تا روز پانکچر افزایش می‌یابد. همچنین نشان داده شد که هیچ ارتباط معنی‌داری بین میزان استرادیول و میزان CRP وجود ندارد (12). Orvieto و همکارانش نیز نشان دادند که تحریک تخمک‌گذاری با افزایش میزانCRP در سیکل همراه است. این افزایش از شروع القاء تحریک تخمک‌گذاری تا زمان پانکچر به میزان 60% بوده و با افزایش میزان استرادیول سرم ارتباط دارد (8). در مطالعه حاضر، ارتباط CRP با میزان استرادیول نشان داد که علیرغم وجود یک ارتباط معکوس (افزایش استرادیول همراه با کاهش میزان تغییرات CRP) در تمام موارد، این ارتباط از نظر آماری معنی‌دار نبود. همچنین در این مطالعه نشان داده شد که علیرغم وابستگی میزان CRP در روز OPU با میزان آن در مایع فولیکولی، میزان CRP در مایع فولیکولی به طور معنی‌داری نسبت به خون کمتر می‌باشد. این در حالی است که در مطالعه Orvieto و همکاران، اختلاف معنی‌داری بین میزان این متغیر در خون و مایع فولیکولی دیده نمی‌شود (8). به نظر می‌رسد این افزایش CRP، وابسته به تحریک و فعالیت سلول‌های اندوتلیال و نوتروفیلها در جریان یک التهاب سیستمیک می‌باشد (13). بررسی Levin و همکارانش نشان داد که متوسط میزان CRP در بیماران دچار سندرم تحریک بیش از حد تخمدان (OHSS) در سیکل‌های IVF/ICSI بطور معنی‌داری نسبت به بیماران تحت تحریک تخمک‌گذاری که تحریک بیش از حد تخمدان نشده‌اند و همچنین نسبت به بیماران گروه کنترل بالاتر بوده است (14). در بیماران تحت مطالعه حاضر، بین بروز تحریک بیش از حد تخمدان (دو مورد تحریک بیش از حد متوسط و یک مورد شدید) و تغییرات CRP، ارتباط معنی‌داری ملاحظه نشد. کلیه بیماران مورد مطالعه، تحت پروتکل استاندارد طولانی مدت قرار گرفته و جهت رسیدگی نهایی فولیکول ازhCG استفاده شد. بررسیها نشان می‌دهد که در سیکل‌های تحریک تخمک‌گذاری برای IVF، استفاده از GnRH-a (آگونیست GnRH) بجای hCG جهت رسیدگی نهایی فولیکول با سطح التهاب کمتری همراه بوده و با استفاده از آگونیست GnRH در مقایسه با hCG، میزان افزایش CRP در طول سیکل در این بیماران 96% کاهش می‌یابد (11).
مطالعه حاضر نشان داد که تحریک تخمک‌گذاری با افزایش سطح CRP در سرم همراه بوده و روند این افزایش تا زمان پانکچر تخمدانها و انتقال جنین ادامه دارد. همچنین نشان داده شد که تغییرات CRP با میزان استرادیول زمان تزریق hCG ارتباط معنی‌داری ندارد. ارتباط تغییرات CRP و میزان بارداری در سیکل IVF/ICSI بایستی در مطالعات بعدی بررسی شود.
بدینوسیله از حمایت‌های مالی و معنوی پژوهشگاه فن‌آوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی ابن‌سینا و همچنین از زحمات کلیه پرسنل زحمتکش و محترم مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا خصوصاً مدیریت محترم آن مرکز قدردانی می‌گردد.
