Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Secretion of Vascular Endothelial Growth Factor in a Three-Dimensional Culture of Human Endometrium; an In-Vitro Model for Endometriosis

Authors
Jafar Ai 1
Navid Esfandiari 2
Robert Casper 2
1 Department of Tissue Engineering, School of Advanced Technologies in Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran; Research Center for Science and Technology in Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Teh
2 Division of Reproductive Sciences, Department of Obstetrics and Gynecology, Toronto Centre for Advanced Reproductive Technology (TCART),University of Toronto, Samuel Lunenfeld Research Institute, Toronto, Canada
Abstract
Introduction: Endometriosis is the presence of endometrial glandular and stromal cells outside the uterine cavity. The disease is prevalent in about 10% of women of reproductive age and in up to 50% of infertile women. Surgery continues to be the first line of treatment in eradicating endometriotic lesions but recurrence of the condition is seen in up to 47% of the cases. VEGF is an effective factor in the establishment of endometriosis. The aim of the present study was to determine VEGF levels in a three-dimensional (3D) fibrin matrix culture of human endometrial tissue.Materials and Methods: Endometrial biopsies were obtained from the uterine fundus of 10 ovulating (at 19th to 24th day of menstruation cycle) premenopausal women attending the Toronto Center for Advanced Reproductive Technology (TCART) for the treatment of infertility, ovarian cysts or non-endometrial complaints. Each tissue fragment was divided into ten segments for culture in a total of 100 wells. The samples were cultured on three-dimensional fibrin matrices and the supernatant fluid was collected from each endometrial sample for the assessment of VEGF levels. The endometrial samples were stained by anti-Cox-2 antibody (anti-cyclooxygenase -2) for immunohistochemical evaluation of angiogenesis.Results: VEGF levels in the supernatant fluid of wells with angiogenesis was significantly higher (p < 0.05) than wells with no signs of the phenomenon (492±3.11 and 183±13.2, respectively). The results were indicative of cell proliferation in 91% of the wells and angiogenesis was observed in 51 wells (56%) with cell proliferation.Conclusion: It seems that VEGF secretion plays an important role in promoting neovasculariza-tion and cell proliferation of endometrial cells. Therefore, VEGF secretion seems to be involved in the establishment of endometriosis. Seeking the relationship between cell proliferation and VEGF secretion rates is suggested.
Keywords
Angiogenesis
Endometriosis
Endometrium
Female infertility
Three
dimensional tissue culture
VEGF

زمینه و هدف

بیماری اندومتریوز که رشد نابجای غدد و عروق بافت اندومتریوم در خارج از حفره رحمی است (1)، اغلب با دردهای ناحیه لگن همراه می‌باشد (2،3). اولین اقدام درمانی در این بیماری، عمل جراحی می‌باشد که در حدود 47% موارد بعد از درمان، بیماری دوباره عود می‌کند (3). در حیواناتی مثل بابون (نوعی پستاندار)، بیماری اندومتریوز در مرحله ترشحی سیکل رحمی دیده می‌شود (4). اخیراً مطالعات نشان داده است که می‌توان اندومتریوز را به صورت پیوند در حیواناتی مثل موش ایجاد کرد (5). بیماری اندومتریوز شبیه به تومورها دارای دو مرحله اساسی لانه‌گزینی و رگزایی می‌باشد (6).

برگشت خون قاعدگی در لوله‌های رحم، یک پدیده فیزیولوژی است که در بعضی از زنان دیده می‌شود (7،8) و می‌تواند باعث انتقال سلول‌های اندومتریوم به منطقه پریتونئوم لگن و جایگزینی آنها در آن منطقه شده و موجب ایجاد بیماری اندومتریوز گردد. ولی در همه زنانی که برگشت خون قاعدگی در لوله رحم رخ می‌دهد، بیماری اندومتریوز دیده نمی‌شود و این بیانگر دخالت فاکتورهای دیگر در بروز این بیماری می‌باشد (9). سلول‌های بافت اندومتریوم، می‌توانند در کشت سه بعدی با ماتریکس فیبرینی، تکثیر و رشد یافته و مکانیسمی شبیه به بیماری اندومتریوز از جمله رگزایی و تکثیر سلولها را در خارج از بدن به نمایش بگذارد (11،10).

رگزایی به عنوان اصلی‌ترین عامل ایجاد بیماری اندومتریوز شمرده می‌شود (12). VEGF یکی از مهمترین فاکتورها در اندومتریوم می‌باشد که باعث رگزایی می‌شود (13). سطح بالای VEGF بعنوان عامل اصلی در رگزایی پاتولوژی از جمله رشد تومورهای بدخیم و تخریب عضلات شناخته شده است (14).

Yoo و همکاران اظهار نمودند که VEGF بهترین فاکتور جهت تنظیم آنژیوژنز می‌باشد و فاکتورهای Anti-VEGF را به عنوان مهار کننده‌های آنژیوژنز مطرح کردند (15). همچنینLieb و همکاران نشان دادند که افزایش سطح VEGF، باعث افزایش سطح آنژیوژنز در مفاصل می‌شود (16).

هدف از مطالعه حاضر، کشت بافت اندومتریوم در محیط کشت سه بعدی با ماتریکس فیبرینی جهت تکثیر سلول‌های بافت اندومتریوم و ایجاد رگزایی، به عنوان مدل اندومتریوز در خارج از بدن و اندازه‌گیری سطح VEGF و بررسی نقش این فاکتور در ایجاد بیماری اندمتریوز می‌باشد.

روش بررسی

نمونه‌های اندومتریوم، از 10 بیمار مراجعه کننده جهت درمان ناباروری، کیست تخمدانی، فیبریوم، میوم و سایر علل ناباروری به مرکز تکنولوژی نوین تولیدمثل تورنتو تهیه شد. این بیماران فاقد بیماری‌هایی از قبیل سرطان رحم و یا پولیپ بوده و در سه ماه قبل از نمونه‌برداری، از داروهای هورمونی استفاده نکرده بودند. قبل از نمونه‌برداری از بیماران فرم مربوط به کمیته اخلاق پزشکی اخذ شد که در آن فرم توضیحات لازم جهت تحقیق حاضر به اطلاع آنها رسیده بود. بیماران شرکت کننده در پژوهش در روزهای 24-19 سیکل رحمی قرار داشتند و تاریخ سیکل رحمی بیماران بر اساس آخرین روز خونروش آنها محاسبه گردید.

کشت سه بعدی بافت: هر نمونه بافت اندومتریوم به 10 قطعه یک میلی‌متری تقسیم (جمعاً 100 قطعه) و با محلول Hanks حاوی آنتی‌بیوتیک (Sigma, USA) شستشو داده شد. سپس قطعات بافتی در ظروف کشت دارای 24 چاهک (Nunclon, USA) کشت داده شدند. لازم به ذکر است که جهت کشت نمونه‌ها، یک لایه ژل فیبرینی در زیر و یک لایه ژل فیبرینی در روی آن قرار داده شد (مدل ساندویچی). جهت تهیه ژل فیبرین، از ml5/0 محلول فیبرینوژن (Sigma, USA) استفاده شد و برای تهیه محلول فیبرینوژن از محیط کشت M199 حاوی mg/ml3 فیبرینوژن (GIBCO, USA) و l10 ترومبین با غلظت M15/0 (Sigma, USA) استفاده گردید. سپس ظروف کشت برای مدت چهار هفته در انکوبانور (Memmert Company) با حرارت C37 و دی اکسید کربن 5% و رطوبت 95% قرار داده شد. کشتها هر سه روز یکبار توسط میکروسکوپ معکوس Olympus, USA)) مورد مطالعه قرار می‌گرفتند و همچنین مایع رویی هر چاهک (جمعاً 100 چاهک) تعویض و جهت اندازه‌گیری میزان VEGF مورد استفاده قرار گرفت.

1- اندازه‌گیری VEGF: جهت اندازه‌گیری میزان VEGF در مایع رویی هر چاهک به روش ساندویچی الایزا از کیت VEGF (RayBio, USA) و دستگاه الایزا (R&D System, USA) استفاده شد. در این آزمایش از چاهک‌‌های میکروپلیت پوشیده شده توسط آنتی‌بادی ضد VEGF استفاده شد. در ابتدا l200 مایع رویی هر چاهک کشت به هر کدام از چاهک‌‌های میکروپلیت اضافه شد و به مدت min20 در دمای اتاق نگهداری شد تا واکنش اتصال VEGF به آنتی‌بادی اختصاصی آن انجام شود. سپس حفره‌های میکروپلیت با استفاده از بافر شستشو PBS (Sigma, USA) حاوی تووین 20 ، سه بار شستشو گردیدند و به هر حفره ml100 آنتی بادی اختصاصی VEGF نشاندار با پراکسیداز اضافه گردید و به مدت یکساعت در دمای اتاق نگهداری شد و سپس حفره‌های میکروپلیت با استفاده از بافر شستشو، سه بار شستشو گردیدند و به هر حفره به میزان ml100 محلول سوبسترا حاوی ارتوفنیل دی آمین و H2O2 اضافه گردید و در درجه حرارت اتاق به مدت 10 دقیقه قرارداده شد و با بکار بردنMicroplate Reader (Berthold, USA) جذب نوری چاهکها در طول موج nm450 خوانده شدند.

رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی: پس از پایان آزمایش، نمونه‌های اندومتریوم کشت داده شده از چاهکها خارج گردیده و در فرمالین بافر 4% تثبیت شدند، پس از انجام مراحل آماده‌سازی بافت و قالب‌گیری، برش‌هایی به ضخامت m5 تهیه و با استفاده از آنتی‌بادی Anti-Cox2 (آنتی‌بادی جهت شناسایی رگزایی) (Sigma, USA) با روش ایمونوهیستوشیمی مطابق روش ارائه شده در مطالعه قبلی این گروه (10) مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز آماری: داده‌های مربوط به درصد تکثیر سلولها و درصد رگزایی، با استفاده از نرم‌افزاری SPSS و مطابق روش ارائه شده در مطالعه قبلی این گروه آزمون آماری 2 و داده‌های مربوط به میزان ترشح VEGF، با استفاده از آزمون t داده‌پردازی شدند.

نتایج

در طول هفته اول کشت سه بعدی بافت اندومتریوم در ماتریکس فیبرینی، تهاجم سلول‌های استروما در زمینه‌ فیبرینی مشاهده گردید (شکل 1- الف). بعد از هفته دوم و سوم، ساختارهای مویرگ مانند که حاکی از پدیده رگزایی بود در چاهک‌‌های پلیت کشت مشاهده گردید (شکل 1- ب،2- الف وب).

تکثیر سلولها در 91 چاهکها (91%) و رگزایی در 51 چاهکها نشان دهنده تکثیر سلولها مشاهده گردید (56%) (شکل 2). میزان سطح VEGF در مایع رویی کشت سه بعدی موجود در چاهک‌‌هایی که رگ‌زایی در آنها دیده شده بود (11/3±492)، افزایش معنی‌داری (05/0p<) را نسبت به چاهک‌هایی فاقد رگ‌زایی (13/2±183) نشان داد.

بحث

در این تحقیق میزان ترشح VEGF و تکثیر سلول‌های استرومای اندومتریوم و ایجاد رگزایی، در کشت سه بعدی بافت اندومتریوم در زمینه فیبرینی مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه ایجاد و بازسازی بیماری اندومتریوز در خارج از بدن را نیز امکان‌پذیر ساخت.

رگزایی وابسته به فاکتورهای آزاد شده از سلولها و چندین فاکتور رشد پپتیدی شامل FGF-a، FGF-b، PD-ECGE و VEGF، تحریک کننده سلول‌های اندوتلیال جهت رگزایی می‌باشند که در این بین VEGF اساسی‌ترین فاکتور رگزایی در اندومتریوم رحم می‌باشد (17).

در مطالعات محققین، اثبات شده است که پاتوژنز بیماری اندومتریوز وابسته به شدت رگزایی آن می‌باشد؛ بطوریکه در درجات مختلف بیماری اندومتریوز، غلظت‌های متفاوتی از ترشح VEGF دیده می‌شود (18).

Cosin و همکاران اعلام کردند که بافت‌های اندومتریوم و مایع پریتونتال در بیماران اندومتریوز دارای مقدار بالایی از VEGF هستند و VEGF می‌تواند در تکامل و پیشروی اندومتریوز نقش داشته باشد که نتایج تحقیق فوق با نتایج تحقیق حاضر مبتنی بر تاثیر VEGF در رگزایی و در نتیجه پیشروی اندومتریوز، مطابقت دارد (19).

گزارشاتی دال بر وجود رابطه بین بیماری اندومتریوز و افزایش سطح سرمی پرولاکتین ارائه شده است که علت آن می‌تواند ترشح زیاد پرولاکتین و متعاقب آن، ترشح زیاد VEGF و در نتیجه افزایش رگزایی و ایجاد اندومتریوز باشد که نتایج این گزارشات نیز با نتایج مطالعه حاضر مطابقت دارد (20). در ضمن بررسی رابطه بین میزان تکثیر سلولها و ترشح VEGF یکی از محدودیت‌های این تحقیق محسوب می‌شود که انجام آن می‌تواند در روشن‌تر شدن نتایج کمک کننده باشد. نارسایی‌های ترشح پرولاکتین که منجر به نارسایی‌های ترشح VEGF می‌شود را می‌توان به عنوان یکی از علل ناباروری در بیماران اندومتریوز دانست (21). Ferté و همکاران اظهار نمودند که VEGF باعث رگزایی می‌شود و این رگزایی می‌تواند در بهبود زخمها مؤثر باشد (22)؛ همچنین اسفندیاری و همکاران ثابت کردند علت رگزایی در اندومتریوز، سلول‌های استروما هستند (23).

Fujii و همکاران نشان دادند، افرادی که دارای بیماری اندومتریوز هستند، نسبت به افرادی که مبتلا به این بیماری نیستند دارای سطح بالاتری از VEGF در سرم خون، مایع فولیکولی و مایع پریتونتال می‌باشند (24) که نتایج این مطالعه نیز با نتایج تحقیق حاضر مبتنی بر تأثیر VEGFدر رگزایی مطابقت دارد.

در تحقیق حاضر، میزان ترشح VEGF از سلول‌های استرومای موجود در بافت‌های اندومتریوم کشت داده شده در چاهک‌‌هایی که رگزایی در آنها دیده شده، دارای افزایش معنی‌داری (05/0p<) نسبت به میزان ترشح VEGF از سلول‌های استرومای موجود در بافت‌های اندومتریوم کشت داده شده در چاهک‌‌هایی بود که رگزایی در آنها دیده نشد.

نتیجه گیری

مطالعه حاضر، مبین ایجاد یک مدل اندومتریوز در محیط کشت سه بعدی با ماتریکس فیبرینی در خارج بدن بوده؛ همچنین مبین ازدیاد ترشح VEGF در چاهک‌‌های کشت همراه با رگزایی می‌باشد؛ به طوریکه می‌توان گفت، یکی از دلایل اصلی ایجاد اندومتریوز، تکثیر سلول‌های استروما و ایجاد رگ‌زایی به‌دلیل ترشح VEGF است. در نتیجه با مهار VEGF، شاید بتوان بیماری اندومتریوز را کنترل کرد. در ضمن پیشنهاد می‌گردد رابطه بین تکثیر سلولها و میزان ترشح VEGF نیز توسط محققان دیگر مورد بررسی قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله نهایت تشکر خود را از سرکار خانم نجمه صدق‌کردار بخاطر ویرایش مقاله اعلام می‌دارند.

  1. Strathy JH, Molgaard CA, Coulam CB, Melton LJ 3rd. Endometriosis and infertility: a laparoscopic study of endometriosis among fertile and infertile women. Fertil Steril. 1982;38(6):667-72.
  2. Adamson GD, Nelson HP. Surgical treatment of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997; 24(2):375-409. Review.
  3. Kettel LM, Hummel WP. Modern medical management of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):361-73. Review.
  4. Rogers PA, Abberton KM, Susil B. Endothelial cell migratory signal produced by human endometrium during the menstrual cycle. Hum Reprod. 1992;7(8): 1061-6.
  5. Lebovic DI, Bentzien F, Chao VA, Garrett EN, Meng YG, Taylor RN. Induction of an angiogenic phenotype in endometriotic stromal cell cultures by interleukin-1beta. Mol Hum Reprod. 2000;6(3):269-75.
  6. Fasciani A, Bocci G, Xu J, Bielecki R, Greenblatt E,Leyland N, et al. Three-dimensional in vitro culture of endometrial explants mimics the early stages of endometriosis. Fertil Steril. 2003;80(5):1137-43.
  7. Halme J, Hammond MG, Hulka JF, Raj SG, Talbert LM. Retrograde menstruation in healthy women and in patients with endometriosis. Obstet Gynecol. 1984;64 (2):151-4.
  8. Oral E, Arici A. Pathogenesis of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):219-33. Review.
  9. Lamb K, Hoffmann RG, Nichols TR. Family trait analysis: a case-control study of 43 women with endometriosis and their best friends. Am J Obstet Gynecol. 1986;154(3):596-601.
  10. Esfandiari N, Ai J, Nazemian Z, Javed MH, Gotlieb L, Casper RF. Expression of glycodelin and cyclo-oxygenase-2 in human endometrial tissue following three-dimensional culture. Am J Reprod Immunol. 2007;57(1):49-54.
  11. Esfandiari N, Khazaei M, Ai J, Bielecki R, Gotlieb L, Ryan E, et al. Effect of a statin on an in vitro model of endometriosis. Fertil Steril. 2007;87(2):257-62.
  12. Becker CM, Bartley J, Mechsner S, Ebert AD. [Angiogenesis and endometriose] Zentralbl Gynakol. 2004;126(4):252-8. German.
  13. Ferrara N, Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev. 1997;18(1):4-25. Review.
  14. Kieser A, Weich HA, Brandner G, Marmé D, Kolch W. Mutant p53 potentiates protein kinase C induction of vascular endothelial growth factor expression. Oncogene. 1994;9(3):963-9.
  15. Yoo SA, Kwok SK, Kim WU. Proinflammatory role of vascular endothelial growth factor in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: prospects for therapeutic intervention. Mediators Inflamm. 2008; 2008:129873. Review.
  16. Lieb W, Safa R, Benjamin EJ, Xanthakis V, Yin X, Sullivan LM, et al. Vascular endothelial growth factor, its soluble receptor, and hepatocyte growth factor: clinical and genetic correlates and association with vascular function. Eur Heart J. 2009;30(9):1121-7.
  17. Donnez J, Smoes P, Gillerot S, Casanas-Roux F, Nisolle M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. Hum Reprod. 1998;13(6):1686-90.
  18. Rogers PA, Donoghue JF, Walter LM, Girling JE. Endometrial angiogenesis, vascular maturation, and lymphangiogenesis. Reprod Sci. 2009;16(2):147-51.
  19. Cosin R, Gilabert-Estelles J, Ramon LA, Espana F, Gilabert J, Romeu A, et al. Vascular endothelial growth factor polymorphisms (-460C/T, +405G/C, and 936C/T) and endometriosis: their influence on vascular endothelial growth factor expression. Fertil Steril. 2008 Oct 16. [Epub ahead of print].
  20. Godo G, Sas M, Falkay G. Bromocryptine therapy in luteal insufficiency. Acta Med Acad Sci Hung. 1980;37 (3):283-8.
  21. Cunha-Filho JS, Gross JL, Lemos NA, Brandelli A, Castillos M, Passos EP. Hyperprolactinemia and luteal insufficiency in infertile patients with mild and minimal endometriosis. Horm Metab Res. 2001;33(4): 216-20.
  22. Ferté C, Massard C, Moldovan C, Desruennes E, Loriot Y, Soria JC. Wound healing delay after central venous access following DCF/VEGF-trap therapy. Invest New Drugs. 2009 Feb 17. [Epub ahead of print].
  23. Esfandiari N, Ai J, Khazaei M, Nazemian Z, Jolly A, Casper RF .Angiogenesis following three-dimensional culture of isolated human endometrial stromal cells. Int J Fertil Steril. 2008;2(1):19-22.
  24. Fujii EY, Nakayama M, Nakagawa A. Concentra-tions of receptor for advanced glycation end products, VEGF and CML in plasma, follicular fluid, and peritoneal fluid in women with and without endometriosis. Reprod Sci. 2008;15(10):1066-74.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 10, Issue 2
Summer 2009
Pages 95-100