شیمی‌درمانی و اشعه‌درمانی با تغییرات زیادی در دستگاه تناسلی مردان همراه است و در بین این عوامل، داروهای با خاصیت آلکیله کنندگی بیشترین اثرات سوء را روی بیضه ایجاد می‌کنند (1). امروزه به‌خصوص در کشورهای پیشرفته، درمان موفق بدخیمها و امید به زندگی در این افراد به میزان بالایی افزایش یافته است و عمده این افراد، به ویژه افراد جوان، پس از بهبودی تمایل به داشتن قدرت باروری و فرزند هستند (2). از جمله عوامل شیمی‌درمانی آلکیله کننده می‌توان بوسولفان را نام برد که به منظور درمان لوسمی مزمن، سرطان تخمدان و همچنین قبل از پیوند مغز استخوان در بیماران سرطانی استفاده می‌شود (3). بیشتر مطالعات در مورد اثرات توکسیک بوسولفان بر بیضه به طور عمده روی مدل‌های جوندگان مانند موش و رت بوده و به‌خصوص در سال‌های اخیر به منظور القاء آزواسپرمی قبل از پیوند سلولهای ژرمینال به بیضه در گونه‌های مختلف استفاده شده است (4،5). مصرف این دارو پس از یک یا دو تزریق داخل صفاقی، بخش عمده‌ای از اسپرماتوگونیها را از بین می‌برد (4،5). ضمن اینکه بهبودی باروری در موشهای تحت درمان با بوسولفان در طول زمان به‌طور خود بخود صورت نمی‌گیرد؛ زیرا، بافت بیضه و لوله‌های سمی‌نیفروس و سلولهای زایا به شدت آسیب می‌بینند (6،7).
ملاتونین که یکی از ترشحات غده اپی فیز است در تنظیم برخی پدیده‌های فیزیولوژی مؤثر می‌باشد. ملاتونین دارای عملکرد نورونی‌ـ هورمونی، تنظیم کننده تولید مثل، ایمنی و دما است. علاوه بر این موارد ملاتونین روی تکثیر و تزاید و تمایز سلولی اثر دارد (8). همچنین اثرات ضد سرطانی و ضد پیری آن نیز گزارش شده است (9). ملاتونین امکان برداشت و خنثی نمودن رادیکال‌های آزاد شامل رادیکال‌های هیدروکسیل، پراکسیل و آنیون‌های پراکسی نیترات را دارا می‌باشد (10). مصرف ملاتونین در موشهای بزرگ آزمایشگاهی، سلولها را در برابر آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌نماید و در واقع استرس‌های اکسیدان را به طرق متعددی کاهش می‌دهد (11). ضمن این که نشان داده شده که ملاتونین دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی ضعیفی روی اسپرم انسان است (12). گیرنده‌های ملاتونین روی بافت‌های مختلف از جمله پروستات، سلولهای پوشش اپیدیدیم و به میزان کمی روی اسپرم بیان می‌شوند (13).
همچنین تجویز ملاتونین در انسان آسیب‌های وارده به میتوکندری‌های اسپرم به دنبال راکتیوهای اکسیژن را کاهش می‌دهد (14). تجویز یک دوز بالا، mg/kg100 ملاتونین در موشهای بزرگ آزمایشگاهی در معرض اشعه x، مانع ایجاد آسیب‌های حاد در بیضه آنها می‌شود (14). علاوه بر این مطالعات تجویز ملاتونین در موشهای دیابتیک تحت درمان با استروپتوزوتوسین (15) و نیز موشهای تحت درمان با سیس پلاتین باعث کاهش عوارض جانبی داروهای نامبرده روی بیضه می‌شود.Reiter معتقد است که ملاتونین می‌تواند سمیت و عوارض جانبی داروها را کاهش دهد (16). در ارتباط با استفاده توام ملاتونین و بوسولفان و اثر آن روی تغییرات بیضه گزارشی در دسترس نیست. لذا هدف از مطالعه حاضر، ارزیابی اثرات محافظتی احتمالی ملاتونین، روی تغییرات هیستولوژیک اسپرماتوژنز در موشهای بالغ تحت شیمی‌درمانی با داروی بوسولفان می‌باشد.
در این مطالعه از 32 موش بالغ نر 8-6 هفته، نژاد NMRI استفاده گردید. حیوانات از موسسه رازی خریداری و به منظور تطابق با محیط 2 هفته در قفس‌های خود با دسترسی آزادانه به آب و غذا و شرایط محیطی استاندارد نگهداری شدند. پس از آن حیوانات به 4 گروه (هر گروه شامل 8 حیوان) تقسیم شدند.
1- گروه کنترل: به میزان ml5/0 دی‌متیل‌سولفواکساید (Sigma, USA) 2 درصد (حلال بوسولفان) مطابق udagawa (3) به‌صورت تک دوز داخل صفاقی دریافت نمودند.
2- گروه تحت درمان با بوسولفان: به میزان mg/kg20، بوسولفان (Sigma, USA)، به صورت داخل صفاقی و تک دوز دریافت نمودند.
3- گروه تحت درمان با ملاتونین: که به مدت 5 روز روزانه mg/kg10 ملاتونین (Sigma, USA) به صورت داخل صفاقی دریافت نمودند. جهت حلالیت ملاتونین مطابق Ateşşahin (15) از اتانول 1% استفاده می‌شد.
4- گروه تحت درمان ترکیبی: ابتدا یک تک دوز mg/kg20، بوسولفان دریافت می‌کردند و پس از آن به مدت 5 روز، روزانه mg/kg10 ملاتونین دریافت نمودند.
35 روز پس از شروع درمان، همه حیوانات به طریقه جابجایی نخاع، کشته و بیضه آنها از حفره شکم خارج شد. به منظور ثبوت بافتی، بیضه‌ها به داخل محلول فیکساتیو فرمالدئید بافری 10 درصد به مدت 72 ساعت در دمای اتاق غوطه‌ور می‌شدند.
ارزیابی لوله‌های سمی‌نیفروس
پس از گذشت سه روز از ثابت نمودن و اطمینان از ثبوت بافتی بیضه‌ها، نمونه‌ها با میکروسکوپ نوری پاساژ بافتی شدند. به منظور مطالعه با پاساژ از اتانول با درجات صعودی، گزیلن و پارافین مذاب استفاده شد. برای به حداکثر رساندن تعداد برش‌های مناسب لوله‌های سمی‌نیفروس در مقطع عرضی، بیضه‌ها در جهت محور طولی در پارافین قالب‌گیری شدند. سپس با استفاده از دستگاه میکروتوم دوار (Leitz, Germany) مقاطعی به ضخامت 5 تهیه شد. از هر بیضه 4 تا 5 اسلاید تهیه و به طریقه هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی و با میکروسکوپ نوری (Olampus, Japan) و با درشت نمایی ×400 مورد مطالعه قرار می‌گرفتند. به منظور مطالعه بلوغ و کیفیت لوله‌های سمی‌نیفروس از روش جانسون استفاده می‌شد (17). جدول جانسون بلوغ و به عبارتی دیگر کیفیت لوله‌ها را نشان می‌دهد. این جدول دارای نمره‌بندی 10-1 است. براساس معیارهای زیر به هر مقطع عرضی لوله سمی‌نیفروس داده می‌شود:
10: اسپرماتوژنز کامل، تعداد زیادی سراسپرم که در حاشیه لومن گرد و منظم قرار دارند.
9: تعداد زیادی اسپرم وجود دارد ولی لومن گرد و منظم دیده نمی‌شود.
8: تعداد اسپرم خیلی کم است.
7: اسپرم دیده نمی‌شود ولی تعداد زیادی اسپرماتید گرد دیده می‌شود.
6: تعداد کمی اسپرماتید گرد دیده می‌شود.
5: هیچ اسپرم و اسپرماتید گردی دیده نمی‌شود. تعداد زیادی اسپرماتوسیت اولیه دیده می‌شود.
4: تعداد خیلی کمی اسپرماتوسیت اولیه دیده می‌شود.
3: هیچ اسپرماتوسیت اولیه دیده نمی‌شود. فقط اسپرماتوگونی دیده می‌شود.
2: هیچ سلول زایا وجود ندارد. فقط سلول سرتولی دیده می‌شود.
1: نه سلول زایا و نه سلول سرتولی دیده می‌شود و لوله‌ها آتروفیک هستند.
ارزیابی کمی پارامترهای لوله سمی‌نیفروس
جهت ارزیابی کمی پارامترهای لوله سمی‌نیفروس، از گریدهای مدرج خطی بر لنز چشمی میکروسکوپ استفاده شد. در هر حیوان به طور تصادفی 20 لوله سمی‌نیفروس در مقطع عرضی گرد و یا تقریباً گرد انتخاب و مطالعه شد. لوله‌هایی که بیضوی بودند یا برش مایل داشتند مطالعه نشدند. با بزرگنمایی ×400 اقطار لوله‌های سمی‌نیفروس یعنی از غشاء پایه یکطرف لوله تا غشاء پایه طرف دیگر براساس میکرومتر محاسبه گردید. ابتدا دو قطر عمود بر هم محاسبه و سپس میانگین اقطار در هر لوله محاسبه شد. همچنین به طریق مشابه، میانگین قطر مجرای داخل لوله سمی‌نیفروس و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال براساس میکرومتر محاسبه شد (14).
محاسبه حجم سلولهای لیدیگ
با کمک گرید خطی و با بزرگنمایی ×1000، حجم هسته سلولهای لیدیگ محاسبه شد. بدین ترتیب که در هر حیوان 20 سلول مطالعه گردید. ابتدا از فرمول D1/2× D2√R= شعاع به‌دست آمد. که در این فرمول R معادل شعاع و D1 وD2 به ترتیب اقطار کوچک و بزرگ سلول است. همچنین برای مطالعه حجم از فرمولV=4/3 π R3 استفاده شد. 14/3=π عدد ثابت بود (18).
شمارش سلولهای زایا
براساس ریخت‌شناسی هر سلول، سلولهای اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید گرد و اسپرماتوزوا در مقطع عرضی 20 لوله سمی‌نیفروس در هر حیوان شمارش شد. فقط لوله‌های گرد مورد شمارش قرار گرفتند و لوله‌هایی که مایل و یا بیضوی بودند و یا حاوی سلولهای ریزش یافته به داخل لومن بودند مورد شمارش سلولی قرار نگرفتند.
آنالیز آماری: نتایج ریخت‌شناسی میکروسکوپ نوری در نمونه‌های مورد مطالعه با هم مقایسه و بلوغ اسپرماتوژنز و همچنین کلیه پارامترهای کمی محاسبه شده با استفاده از برنامه آماری SPSS و آزمون واریانس یک طرفه تحلیل شدند. یافته‌ها به صورت میانگین و انحراف معیار بیان و مقادیر 05/0p≤ معنیدار تلقی گشت. همچنین جهت ارزیابی تفاوت معنیدار بین گروه‌ها از تست توکی استفاده شد.
در مطالعه بافت‌شناسی، در گروه کنترل اسپرماتوژنز فعال در لوله‌های سمی‌نیفروس در مراحل مختلف همراه با اسپرم‌های اسپرم‌های بالغ یا در حال بلوغ مشاهده شد. در این لوله‌ها اپیتلیوم ژرمینال از ضخامت قابل توجهی برخوردار بود و انواع سلولهای زایا شامل اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتوسیت ثانویه، اسپرماتیدهای جوان گرد و اسپرماتیدهای بالغ دراز یا اسپرماتوزوئید و همچنین سلولهای سرتولی مشاهده شدند. در بافت بینابینی، بافت همبندی سست همراه با عروق خونی، اعصاب، سلولهای بافت همبندی و همچنین سلولهای اسیدوفیل لیدیگ به‌صورت تکی و یا تجمعات سلولی با هسته گرد قابل مشاهده بودند (شکل A -1).
در گروه تحت درمان با mg/kg20 بوسولفان، تخریب اسپرماتوژنز به وضوح قابل مشاهده است. در اغلب لوله‌ها تعداد زیادی از سلولهای زایا از بین رفته بودند و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال به‌طور معنی‌داری کاهش داشت. در ضخامت اپیتلیوم ژرمینال واکوئلها مشهود بودند. تعداد زیادی از لوله‌ها فاقد اسپرماتید گرد و اسپرماتید دراز بودند. عمده لوله‌ها دارای اسپرماتوگونی و تعدادی کم اسپرماتوسیت اولیه بودند. هرچند که بندرت هنوز برخی لوله‌ها دارای اسپرماتید نیز بودند. کلیه عناصر تشریحی موجود در بافت بینابینی همراه با سلولهای لیدیگ در فاصله بین لوله‌های سمی‌نیفروس دیده شد (شکل -B1).
در گروهی که میزان mg/kg10 ملاتونین مصرف کرده بود تغییرات ریخت‌شناسی خاصی در مقایسه با کنترل دیده نشد (شکل C -1). در گروه تحت درمان ترکیبی، لوله‌ها دارای انواع متنوع سلولهای زایا بودند و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال به‌صورت قابل توجه بیشتر از گروه دوم و در ضخامت آن، واکوئل خیلی کمتر دیده می‌شد. در اغلب لوله‌ها اسپرماتوژنز فعال دیده می‌شد هرچند که هنوز برخی از آنها فعال نشده بودند (شکل D -1).
میانگین نمره‌بندی جانسون، درصد لوله‌های بالغ سمی‌نیفروس و همچنین تعداد سلولهای زایا در گروه‌های مورد مطالعه در جدول 1 بیان شده است. در گروه کنترل میانگین نمره‌بندی جانسون در آنها 43/0±51/9 بود. در حالیکه در گروه تحت درمان با بوسولفان نمره‌بندی جانسون 64/0±10/3 بود که به‌صورت معنیدار(001/0P<) کاهش داشت (جدول 1). همانطور که در جدول مشخص است تعداد کلیه سلولهای زایا نیز در گروه تحت بوسولفان به‌صورت معنیدار(001/0P<) در مقایسه با کنترل کاهش دارند. در گروهی که فقط ملاتونین مصرف نموده بود، میانگین جانسون /1±58/9 بود که در مقایسه با کنترل تغییری نشان نداد. ضمن این که تعداد کلیه سلولهای زایا نیز در مقایسه با کنترل تفاوتی نشان نداد. در حالیکه مصرف بوسولفان توام با ملاتونین، میانگین جانسون را به 27/1±4/7 افزایش داد که در مقایسه با گروه تحت درمان با بوسولفان معنیدار (001/0P<) بود. علاوه بر آن، تعداد کلیه سلولهای زایا در مقایسه با گروه تحت درمان با بوسولفان افزایش یافت.
به عبارتی دیگر مصرف ملاتونین باعث افزایش بلوغ و کمیت سلولهای لوله سمی‌نیفروس در گروه تحت
شیمی‌درمانی شد.
میانگین تغییرات کمی اقطار لوله‌های سمی‌نیفروس و سلولهای لیدیگ در گروه‌های مورد مطالعه در جدول 2 بیان شده است. مصرف بوسولفان نه تنها ضخامت اپیتلیوم ژرمینال را m85/3±50/28 در مقایسه با کنترل m2/4±00/65 کاهش داد بلکه باعث کاهش معنیدار (05/0P<) در قطر لوله‌های سمی‌نیفروس نیز شد (جدول 2). در گروهی که فقط ملاتونین دریافت کرده بود هرچند که از نظر ریخت‌شناسی تفاوت خاصی با کنترل دیده نشد؛ ولی ضخامت اپیتلیوم ژرمینال به‌صورت معنیدار m63/6±00/61 در مقایسه با کنترل m2/4±00/65 کاهش نشان داد؛ که شاید ناشی از اثرات ملاتونین بر روی محور هیپوتالاموسی هیپوفیزی- گنادی باشد.
مصرف تک دوز mg/kg20 بوسولفان کاهش معنی‌داری در عمده پارامترهای لوله سمی‌نیفروس شامل: قطر لوله‌ها و ضخامت اپیتلیوم ژرمینال ایجاد نمود هرچند که به دلیل کاهش پارامترهای نامبرده، ضخامت مجرای داخلی لوله‌ها افزایش معنیدار نشان می‌داد. حجم هسته سلولهای لیدیگ در گروه تحت درمان با بوسولفان m395/5±37/85 بود که در مقایسه با کنترل m31/2±91/111 کاهش معنیدار داشت (05/0P< ) (جدول 2). مصرف ملاتونین در گروه تحت درمان ترکیبی نه تنها باعث افزایش ضخامت اپیتلیوم ژرمینال و اقطار لوله‌ها شد؛ بلکه حجم هسته سلولهای لیدیگ را m381/3±00/103 به‌صورت معنیدار(05/0P< ) در مقایسه با گروه تحت درمان با بوسولفان m395/5±37/85 افزایش داد.
به عبارتی دیگر تجویز ملاتونین به میزان mg/kg10 به مدت 5 روز در گروه تحت شیمی‌درمانی با mg/kg20 بوسولفان، منجر به کاهش عوارض ناشی از مصرف بوسولفان بر روی بیضه شد.
مطالعه حاضر اثرات بوسولفان و ملاتونین را روی تغییرات کمی، کیفی و بلوغ اسپرماتوژنز بررسی می‌نماید که مارکرهای مهمی برای کیفیت اسپرماتوژنز هستند و این پارامترها می‌توانند اطلاعات مفیدی در ارتباط با پتانسیل باروری حیوانات ارائه دهند.
در این مطالعه تجویز تک دوز mg/kg20 بوسولفان، باعث کاهش بلوغ اسپرماتوژنز و عمده پارامترهای کمی بیضه شد. مصرف بوسولفان باعث از بین رفتن کلیه سلولهای زایای بیضه شد که این اثر ناشی از خاصیت آلکیله کنندگی بوسولفان است که دارای اثرات مخرب روی سلولهای در حال تکثیر می‌باشد (19). هرچند که عده‌ایی دیگر نیز بر این عقیده‌اند که مصرف بوسولفان می‌تواند باعث توقف تقسیم سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی و یا مرگ آنها گردد (20). این مطلب خود می‌تواند با کاهش بلوغ اسپرماتوزنز همراه باشد. هرچند که تعداد زیادی از سلولهای زایا از بین رفته بودند؛ ولی در داخل لوله‌ها و بر روی غشاء پایه هنوز اسپرماتوگونیها دیده شدند. احتمالاً باقی ماندن اسپرماتوگونیها می‌تواند دلیلی بر این باشد که این سلولها بتوانند پس از مدتی با تقسیم خود سلولهای زایایی را در لوله سمی‌نیفروس ایجاد بنمایند. نشان داده شده که در موشها به‌دنبال تجویز بوسولفان، سلولهای اسپرماتوگونی باقیمانده می‌توانند مجموعه‌ایی از سلولها را تشکیل دهند؛ هرچند که این سلولها نمی‌توانند متمایز شوند (21).
در مطالعه حاضر در ضخامت اپیتلیوم ژرمینال واکوئل‌هایی دیده می‌شود که این واکوئلها می‌توانند در نتیجه از بین رفتن سلولهای زایا باشند. در واقع این واکوئلها می‌توانند نشان‌دهنده از دست دادن اتصالات سلولی و یا کاهش مولکول‌های چسبنده مانند کادهرینها باشند و می‌توانند به‌عنوان یکی از علائم پره‌آپوپتوز مطرح باشند (22). ضمن این که براساس مطالعات قبلی تجویز تک دوز mg/kg40 و همچنین mg/kg20 بوسولفان در موشها می‌تواند تغییرات آپوپتوتیک را در سلولهای زایای بیضه القاء نماید (24،23).
علاوه بر این بوسولفان نه تنها تغییرات ریخت‌شناسی فراساختاری را در سلولهای زایا بلکه در سلولهای سوماتیک بیضه شامل سلولهای لیدیگ، سرتولی و میوئید نیز القاء می‌کند که می‌تواند باعث تغییرات زیادی در بیضه و اسپرماتوژنز شوند. ضمن این که اسپرماتوژنز نتیجه اثرگذاری سلولهای زایا و سوماتیک بر یکدیگر است (25). به عبارت دیگر کاهش بلوغ اسپرماتوژنز، تعداد سلولهای زایا و پارامترهای کمی لوله سمی‌نیفروس در گروه تحت شیمی‌درمانی می‌تواند ناشی از تغییرات توأم سلولهای زایا و سوماتیک باشد. ضمن این که در مطالعه کنونی اقطار و حجم هسته و سلول لیدیگ نیز کاهش نشان داد. در تایید این یافته نشان داده شده که شیمی‌درمانی به‌طور غیرمستقیم روی کارکرد سلولهای لیدیگ اثر دارد و باعث اختلال کارکردی این سلولها می‌شود (26). ضمن این که در بررسی با میکروسکوپ الکترونی نیز اندازه و ارگانل‌های موجود در سلولهای لیدیگ تحت درمان با mg/kg20 بوسولفان، مانند شبکه آندوپلاسمی صاف، میتوکندری و همچنین قطرات چربی کاهش می‌یابد (25). به طور کلی در بسیاری حیوانات شبکه آندوپلاسمی صاف و میتوکندری در سلولهای استروئید ساز، مانند لیدیگ فراوانند. به دنبال هیپوفیزکتومی (27) و کریپتورکیدیسم (28) نیز حجم پارامترهای سلول لیدیگ کاهش می‌یابد. این نتایج پیشنهاد کننده این مطلب است که احتمالاً، فعالیت سنتزی سلولهای لیدیگ در گروه تحت درمان با بوسولفان کاهش یافته است. ضمن این که ثابت شده است که بین حجم سلولهای لیدیگ و مقدار شبکه آندوپلاسمی و ظرفیت ترشحی سلول لیدیگ ارتباط مستقیم وجود دارد؛ به عبارت دیگر، سلولهای لیدیگ فعالتر دارای حجم بالاتری هستند (29). پس احتمالاً در این مطالعه میزان آندروژن تولیدی توسط سلولهای لیدیگ کاهش یافته است؛ هرچند که محققان مطالعه حاضر مطالعه‌ای در این زمینه انجام ندادند. ضمن این که در مطالعه Chatterjee روی بیماران مبتلا به لنفوم و تحت شیمی‌درمانی سطح تستوسترون سرم به طور معنی‌داری کاهش یافته بود (30).
در مطالعه حاضر اثر تجویز ملاتونین به تنهایی و به صورت توأم با بوسولفان روی اسپرماتوژنز نیز مورد بررسی قرار گرفت. ملاتونین به عنوان مهم‌ترین ترشح غده اپی فیز آنتی‌اکسیدانتی بسیار مؤثر و خنثی کننده رادیکال‌های آزاد است (8). ملاتونین به دلیل داشتن اندازه کوچک و خاصیت چربی دوستی زیاد به راحتی از غشاء سلول عبور می‌کند و در کل سلول پخش می‌شود. غلظت آن در هسته سلول بسیار بالا است و DNA را در برابر عوامل مخرب حفظ می‌نماید (8). مطالعه حاضر نشان داد که مصرف mg/kg10 ملاتونین برای مدت 5 روز، به صورت توأم با بوسولفان، اثرات سوء بوسولفان را روی اسپرماتوژنز کاهش می‌دهد. بنابراین به نظر می‌رسد که بهبودی روند اسپرماتوژنز در گروه آخر تحت درمان ترکیبی، ناشی از خاصیت آنتی‌اکسیدانتی ملاتونین باشد. به طور مشابه با مطالعه حاضر، مصرف ملاتونین در رت‌های تحت درمان با سیس پلاتین (15) و همچنین رت‌های دیابتیک تحت درمان با استرپتوزوتوسین آسیب وارده به بیضه را کاهش می‌دهد (14). بنابراین به نظر می‌رسد که ملاتونین در مطالعه حاضر نیز سمیت و عوارض جانبی بوسولفان را کاهش داده است (16). دوز مصرفی ملاتونین در مطالعه حاضر مشابه مطالعه Guneli و Atessahin بود (15،14).
در مطالعه حاضر از بوسولفان استفاده شد؛ چرا که این دارو می‌تواند سلولهای زایا را در مراحل اولیه تقسیم (اسپرماتوگونی) به میزان شدیدتری در مقایسه با سایر داروهای گنادوتوکسیک دیگر تخریب نماید (3). بنابراین، باید که بهبودی اسپرماتوزنز به‌دنبال بوسولفان مشکل‌تر از دیگر داروهای گنادوتوکسیک و یا ضد سرطان باشد (3). مصرف تک دوز بوسولفان در دوز mg40 تا mg50 به ازاء کیلوگرم در موشها، با آزواسپرمی همراه است (5،4). هرچند که دوز القاء کننده آزواسپرمی با کمک بوسولفان وابسته به گونه است و در حیوانات مختلف متفاوت است (31). بنابراین مطالعه کنونی نشان داد که دوز mg/kg20، بوسولفان در موش، با القاء ازواسپرمی همراه نمی‌باشد. هرچند که موجب تخریب شدید اسپرماتوژنز و اولیگواسپرمی می‌شود.
نتایج مطالعه کمی در گروه تحت درمان ترکیبی، با افزایش بلوغ اسپرماتوژنز در این گروه مطابقت دارد. احتمالاً این تغییرات و روند حفظ اسپرماتوژنز با بلوغ بهتر در گروه چهارم نسبت به گروه دوم می‌تواند ناشی از چند مکانیسم باشد:
الف- خاصیت آنتی اکسیدانی قوی ملاتونین، چرا که ملاتونین می‌تواند فعالیت و یا بروز ژن‌های آنزیم‌های آنتی اکسیدان مانند: سوپر اکسید دیس موتاز، گلوتاتیون ردوکتاز و گلوتاتیون پر اکسیداز را تحریک نماید (8).
ب- خواص آنتی‌آپوپتوتیک ملاتونین، که با مهار روند آپوپتوز سلولهای زایا مانع تخریب اسپرماتوژنز شده است (15). در تایید این مطلب، اثرات آنتی آپوپتوتیک ملاتونین بر روی بافت‌های مختلف در چندین آزمایش دیگر نشان داده شده است (15).
ج- خواص آنتی‌پرولیفراتیو ملاتونین، شاید ملاتونین با مهار روند تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی، روند تمایز آنها را به اسپرماتوسیت مهار می‌نماید. در تایید این مطلب Glode و همکاران برای اولین بار پیشنهاد نمودند که هر عاملی که بتواند باعث کاهش ترشح FSH و LH شود و بتواند محور هیپوفیزی- هیپوتالاموس-گنادی را مهار کند احتمالاً می‌تواند باعث مهار تقسیم سلولهای اسپرماتوگونی در طی شیمی‌درمانی شود. Glode و همکاران ثابت نمودند که درمان با آنالوگ هورمون آزاد کننده گنادوتروپین GnRHa قبل و در طی مصرف سیکلوفسفاماید، باعث حفظ روند اسپرماتوژنز در موش می‌شود (32). به‌طور مشابهی تجویز لوپرلاید استات (25،3)، بوسرلین (33)، تستوسترون (34) و همچنین هورمون‌های استروژن و FSH (35) باعث حفظ اسپرماتوژنز در موش تحت شیمی‌درمانی با بوسولفان می‌شود؛ که خود این عوامل نیز به نوعی باعث مهار محور هیپوفیزی- هیپوتالاموسی می‌شوند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که بین ملاتونین و گیرنده‌های GnRH در موشها رابطه معکوس وجود دارد و ملاتونین ترشح FSH و LH را کاهش می‌دهد (36). ضمن این که گزارش‌های قبلی نشان‌دهنده این است که ملاتونین دارای خاصیت ضدتکثیری هم روی سلولهای زایا (37) و هم روی سایر سلولهای دیگر است (38،39). هرچند که مکانیسم‌های فوق، ثابت شده نمی‌باشند و برای اثبات آنها مطالعات بیشتری در زمینه سلولی، مولکولی و ایمونوهیستوشیمی و همچنین آندوکرینولوژی مورد نیاز می‌باشد.
به‌طور خلاصه نتایج مطالعه حاضر نشان داد که تجویز mg/kg20 بوسولفان، باعث کاهش اسپرماتوژنز و بلوغ سلولهای ژرمینال و همچنین تغییرات کمی پارامترهای بیضه می‌شود. تجویز ملاتونین به میزان mg/kg10، به مدت 5 روز از شروع شیمی‌درمانی به میزان قابل توجهی، تغییرات سوء شیمی‌درمانی بر اسپرماتوزنز را کاهش می‌دهد و نقش حفاظتی خوبی روی بیضه دارد. این مطالعه پیشنهاد می‌کند که ملاتونین ممکن است نقش مفید و مهمی برای کاربردهای کلینیکی اختلالات کارکردی بیضه به‌دنبال مصرف داروهای ضد سرطان داشته باشد.
با تشکر از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی گیلان جهت حمایت مالی این مطالعه و با سپاس از سرکار خانم مژگان بشیری کارشناس آزمایشگاه بافت‌شناسی دانشکده پزشکی، جهت همکاری صمیمانه در زمینه برش، رنگ‌آمیزی و تهیه اسلایدهای بافت‌شناسی.
