زمینه و هدف

در طی پنجاه سال گذشته، آفت‌کشها جزء ضروری دنیای کشاورزی بوده‌اند. گرچه تقاضا برای تولید و توزیع آفت‌کش جهت افزایش بهبود کیفیت و کارایی کشاورزی محرز است؛ ولی احتمال به کارگیری نابجا و غیر معقول آنها، بسیار زیاد است. افزایش جمعیت و به دنبال آن افزایش مصرف مواد غذایی، به ویژه محصولات کشاورزی، کشاورزان را بر آن داشته است که میزان محصولات خود را افزایش دهند. افزایش کشت محصولات متعاقباً افزایش سموم آفتکش را به همراه داشته است. به دلیل بی‌توجهی کشاورزان در مصرف سموم، ریزش‌های جوی و چندین عامل دیگر سموم کشاورزی وارد آب رودخانه‌ها و دریاها می‌شوند. در این خصوص افزایش آگاهی متخصصین و به طور کلی عموم مردم از خطرات ناشی از تماس کوتاه مدت و دراز مدت، شامل سرطان‌زایی، بیماری‌های سیستم عصبی تنفسی و زادآوری و ... توجه عموم و سیاست‌گذاران را به خود جلب نموده است. امروزه آلودگی محیط زیست به صورت یک مسئله جهانی درآمده است. تماس با حشره‌کشها به عنوان یک مشکل بهداشتی در اغلب مناطق شهری و روستایی محسوب می‌گردند (1).

با توجه به اینکه هرساله زراعت‌های بهاره و در سال‌های اخیر جالیز و صیفی‌جات (هندوانه، گوجه فرنگی و خیار ...) در مناطق مختلف ایران در سطح وسیعی کشت می‌گردد و همگان به هر نحو ممکن سعی دارند در این کوتاه مدت محصول بیشتری را به ازای اراضی مورد کشت برداشت نمایند، لذا از کود‌های شیمیایی و انواع سموم شیمیائی به صورت گسترده‌ای استفاده می‌نمایند (1).

خواص فیزیکی و شیمیایی سموم آلی کلر دار و متابولیت‌های آنها، سبب می‌شود که این ترکیبات به سهولت وارد بدن موجودات شوند. حلالیت بالا در چربی و حلالیت کم در آب این ترکیبات منجر به تجمع آنها در بافت چربی می‌شود. میزان تجمع در موجودات بر حسب نوع، مدت و غلظت تماس در شرایط محیطی فرق می‌کند (2).

سموم سیکلودینها (مانند آندوسولفان) روی گیرنده‌های گابا تأثیر می‌گذارند، که این گیرنده‌ها روی غشاء اعصاب به عنوان کانال یون کلر عمل می‌کند. این نوع سموم به گیرنده گابا متصل شده و جریان یون کلر را کاهش می‌دهد. علامت شاخص در این گونه مسمومیت، تشنج است (3).

Sotoو همکاران نشان دادند که آندوسولفان خاصیت استروژنیک دارد. آندوسولفان با استرادیول در اتصال به گیرنده‌های استروژن رقابت می‌کند و از این طریق مانع عملکرد صحیح هورمونی می‌شود (4).

آندوسولفان روی سیستم تناسلی ماده موثر است و باعث تاخیر در بلوغ جنسی شده و در سنتز هورمون‌های جنسی اختلال ایجاد می‌کند (5).

Jamil و همکاران در سال 2004 عنوان کردند که آندوسولفان توانایی ایجاد تغییر در ماده ژنی به طور ویژه کروموزومها را در محیط‌های کشت سلولی دارد (5). شواهد تجربی از عوارض جانبی آندوسولفان روی سیستم تناسلی مذکر نشان دهنده تأخیر در بلوغ جنسی و تداخل با سنتز هورمون‌های جنسی دارد (6). آندوسولفان به عنوان برهم زننده تعادل سیستم اندوکرین مطرح است (4).

آندوسولفان با استرادیول برای اتصال به گیرنده‌های استروژن رقابت می‌کند و ممکن است فعالیت هورمونی را متوقف کند (7). قدرت استروژنی آندوسولفان در حضور سایر ارگانوکلره‌های استروژنیک افزایش می‌یابد (8). آندوسولفان همچنین به سیستم تولید مثل آسیب می‌رساند و با اثر روی کیفیت منی، تعداد اسپرم، سلول‌های اسپرماتوگونی، شکل اسپرم می‌گردد و همچنین باعث آسیب به هورمون‌های جنسی مردانه می‌شود (9).

با توجه به استفاده زیاد سم آندوسولفان توسط کشاورزان در کشور و به دلیل مصرف این سم در محصولات جالیزی به نظر می‌رسد که این سم به علت قرار گرفتن در بین سموم پرخطر کلره باعث تغیرات فیزیولوژیک در بخش‌های مختلف بدن از جمله دستگاه تولید مثل جنس نر می‌گردد. با در نظر گرفتن اثرات جانبی ناخواسته و درجه سمیت بالا، هدف این تحقیق تاثیر سم آندوسولفان روی فیزیولوژی تولیدمثل جنس نر در موش‌های آزمایشگاهی بود.

روش بررسی

در این تحقیق از موش‌های رت نر بالغ استفاده شد. نمونه‌ها به پنج گروه تیماری تقسیم شدند. گروه کنترل هیچ ماده‌ای دریافت نکرد. گروه دارونما محلول نمکی 9/0% و گروه تجربی 1، 2 و 3 به ترتیب آندوسولفان با دوز mg/kg5، 10 و20 هر سه روز یکبار به مدت 21 روز از طریق تزریق دهانی دریافت کردند.

جامعه آماری و گروه‌های مطالعه: جهت انجام تحقیق تعداد 40 موش نر صحرایی بالغ (حدود دو ماه سن و وزن g200-180) از نژاد اسپراگ داولی از موسسه سرم سازی رازی خریداری و به 5 گروه هشت تائی شامل گروه کنترل، دارونما (0) و 3 گروه تیمار (1-2-3) تقسیم شدند.

گروه کنترل: هیچ ماده‌ای دریافت نکرد.

گروه دارونما: فقط محلول نمکی 9/0% خورانده شد.

گروه تجربی 1: سم آندوسولفان با دوز kg/mg5 دریافت کردند.

گروه تجربی 2: سم آندوسولفان با دوز kg/mg10 دریافت کردند.

گروه تجربی 3: سم آندوسولفان با دوز kg/mg20 دریافت کردند.

مقدار LD50 آندوسولفان برای حیوانات آزمایشگاهی به صورت خوراکی mg/kg110-50 اندازه‌گیری شده است (9).

شرایط نگهداری نمونه‌ها: نمونه‌ها در دمای C25-17 و شرایط نور طبیعی و دسترسی آزاد به آب و غذا (به صورت حبه از شرکت دام و طیور پارس) به مدت دو هفته برای سازگاری با محیط نگهداری شدند. این شرایط در طول آزمایش نیز برقرار گردید.

روش خوراندن از طریق لوله گوارش: تیمارها به روش تزریق درون دهانی دوزهای مختلف آندوسولفان را دریافت کردند. از مزایای این روش جذب سریع و ورود به دستگاه گردش خون است. از آنجا که نحوه اثر این سم گوارشی و تماسی است؛ لذا روش خوراندن از طریق لوله گوارش انتخاب شد. ابتدا موشها به دقت توزین و بعد از انجام محاسبات لازم مقدار آندوسولفان خوراکی تعیین گردید.

خونگیری: خونگیری پنج روز پس از آخرین تجویز انجام پذیرفت. جهت انجام عمل خون‌گیری حیوان مورد نظر با کلرو فرم بیهوش شد و سپس با خواباندن حیوان به پشت با نوک انگشتان محل قلب مشخص و با سرنگ‌های ml5 یا 10 به طور مستقیم از قلب حیوان خونگیری انجام شد. برای سنجش هورمون‌های تستوسترون، LH، FSH، سرم تهیه و به آزمایشگاه منتقل شد تا با تکنیکImmuno radiometric assay توسط کیت‌های گاما ساخت کشور آلمان سنجش هورمون صورت بگیرد. پس از مشخص شدن هر کدام، میزان اثرات سم آندوسولفان در گروه‌های آزمایش و کنترل از نظر آماری مورد ارزیابی قرار گرفت.

بررسی تغیرات وزن بیضه نسبت به وزن بدن: برای بررسی اثرات احتمالی سم آندوسولفان بر وزن بیضه‌ها هر دو بیضه حیوان خارج، چربی‌های اضافی و زاید اطراف بیضه‌ها و مجاری دفران و اپیدیدیم جدا و از محیط خارج شدند و سپس وزن بیضه، توسط ترازوی دیجیتالی با حساسیت 001/0 گرم (Bllzos, Germany) اندازه‌گیری شد.

روش جمع آوری و ارزیابی اسپرم: پس از خونگیری، موش‌های صحرایی هر سه گروه آزمایش، دارونما و کنترل بیهوش شدند و بعد از باز نمودن شکم حیوان، لوله‌های اپیدیدیم جداسازی شده پس از شستشو در سرم فیزیولوژی، در حجم ml5 محلول رینگر به قطعات بسیار کوچک تقسیم و به مدت 5 دقیقه به آرامی تکان داده شد تا محلول یکنواخت و همگنی ایجاد شود. از این سوسپانسیون آماده شده، یک قطره برداشته و بلافاصله با میکروسکوپ نوری (Ziess, Germany) و بزرگنمایی 40× میزان درصد اسپرماتوزوئیدهای متحرک بررسی گردید. جهت شمارش میکروسکوپی اسپرم از یک پیپت رقیق کننده و لام نئوبار استفاده شد.

روش تجزیه و تحلیل آماری: برای آنالیز داده‌ها از نرم افزارSPSS11 استفاده و نتایج مربوط به اندازه‌گیری میزان تستوسترون، FSH، LH، شاخص‌های مورفولوژیک اسپرم و وزن بیضه‌ها محاسبه شد و میانگین گروهها با روش آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تعقیبی ارزیابی گردید. برای آزمایشها، سطح معنی‌دار (05/0p<) در نظر گرفته شد تا وجود یا عدم وجود اختلاف آماری معنی‌دار بین نمونه‌ها مشخص گردد.

نتایج

نتایج سنجش هورمونها: میانگین تستوسترون سرم با افزایش دوز سم آندوسولفان کاهش یافته و بین میانگین گروه تجربی 1 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 5 سم آندو-سولفان) و 2 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 10 سم آندو-سولفان) و3 (تیمار با دوز تجربی mg/kg20 سم آندوسولفان) با گروه کنترل کاهش معنی‌داری مشاهده می‌شود (جدول 1).

بین گروه‌های تجربی2 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 10 سم آندوسولفان) و3 (تیمار با دوز تجربی mg/kg20 سم آندوسولفان) FSH با گروه کنترل افزایش معنی‌دار نشان می‌دهد. اما بین گروه تجربی 1 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 5 سم آندوسولفان) و گروه Placebo با گروه کنترل تفاوت معنی‌داری وجود نداشت.

در بررسی میانگین LH سرم بین گروه‌های تجربی3 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 20 سم آندوسولفان) با گروه کنترل افزایش معنی‌دار مشاهده شد. اما بین گروه‌های تجربی 1 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 5 سم آندوسولفان) و2 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 10 سم آندوسولفان) و گروه Placebo با گروه کنترل تفاوت معنی‌داری وجود نداشت (جدول 1).

اثرات آندوسولفان بر اسپرم

تعداد: میانگین تعداد اسپرمها بین گروه‌های تجربی 1 (تیمار با دوز تجربی mg/kg5 سم آندوسولفان) و تجربی 2 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 10 سم آندوسولفان) و تجربی 3 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 20 سم آندوسولفان) با گروه کنترل کاهش معنی‌داری مشاهده می‌شود.

حرکت: همانطور که در جدول 1 مشاهده می‌شود میانگین درصد اسپرم‌های متحرک بین گروه‌های تجربی 2 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 10 سم آندوسولفان) و3 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 20 سم آندوسولفان) با گروه کنترل کاهش معنی‌داری مشاهده می‌شود. اما بین گروه‌های تجربی 1 (تیمار با دوز تجربی mg/kg5 سم آندوسولفان) و گروه Placebo با گروه کنترل تفاوت معنی‌داری وجود ندارد.

نسبت وزن بیضه به وزن بدن: نتایج حاصل از توزین بیضه‌ها نشان می‌دهد که میانگین وزن بیضه‌ها در گروه‌های آزمایش نسبت به گروه کنترل کاهش یافته و این کاهش فقط در گروه 3 (تیمار با دوز تجربیmg/kg 20 سم آندوسولفان) معنی‌دار می‌باشد (جدول 1).

بحث

به دلیل حجم بالای سموم آفت کش مصرفی، مواجهه انسان با اینگونه سموم تقریباً غیرقابل اجتناب بوده و می‌تواند به صورت غیرعمدی و تصادفی و متعاقب استفاده از سموم آفتکش و باقی ماندن آنها در محیط زیست و نیز اشیاء موجود در محیط اتفاق افتد. آندوسولفان خاصیت حشره کشی خوبی دارد و ویژگی تبخیری ندارد و در برابر نور کاملاً پایدار است و برای انسان و دام خطرناک است (10). آندوسولفان بسیار سمی است و در صورت استنشاق، خوردن یا جذب از طریق پوست می‌تواند کشنده باشد. مصرف خوراکی آن اثرات وسیع‌تری نسبت به تماس پوستی دارد (11). میزان جذب و سمیت در حضور محلول‌هایی مثل الکل و حلال‌های آرماتیک افزایش می‌یابد (9).

آندوسولفان می‌تواند بیوسنتز آندروژن‌های بیضه‌ای را در حیوانات آزمایشگاهی مهار و آسیب واضحی را به کلیه و بیضه وارد کند (1)، لذا آندوسولفان می‌تواند بر روی سیستم تولید مثل موش صحرایی موثر باشد (10). تغییرات رفتاری و عصبی نیز مورد توجه بوده است (11). آسیب به فولیکول‌های تیروئید در موش نیز دیده شده است (11). آندوسولفان به طور شناخته شده‌ای به سیستم اندوکرین نیز صدمه می‌زند (6).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که عمل سموم شیمیایی به سطح دوز آنها بستگی دارد با افزایش دوز سم شدت اثرات آن افزایش می‌یابد؛ لذا به نظر می‌رسد اگر این گونه سموم به مدت طولانی وارد بدن شوند، ممکن است علاوه بر آسیب به دستگاه‌های مختلف بدن بر سیستم تناسلی نیز تاثیر بگذارند.

این مطالعه نشان داد که مصرف خوراکی سم آندوسولفان در رت بر غلظت هورمون‌های جنسی و روند اسپرماتوژنز، کاهش سلول‌های اسپرماتوژنیک موثر است. این نتیجه تاثیرگذاری عوارض ناشی از آندوسولفان را مورد تاکید قرار می‌دهد و استفاده از دوزmg/kg 20 در این مطالعه باعث تغیرات زیادی بر بسیاری از پارامترها در بیضه گردید. به نظر می‌رسد آندوسولفان، با اثر سمی خود باعث کاهش تعداد و حرکت اسپرمها می‌گردند.

سم آندوسولفان با اثرات سمی خود باعث افزایش میزان LH و FSH و کاهش تستوسترون، تعداد و حرکت اسپرم و وزن بیضه‌ها نسبت به گروه کنترل می‌شود.

کاهش هورمون تستوسترون در گروه‌های تجربی می‌تواند براساس فرضیه‌های زیر باشد:

1- سم آندوسولفان باعث آتروفی و کاهش سلول‌های لایدیک تولید کننده هورمون تستوسترون می‌شود. اثرات طولانی مدت این سم باعث تخریب بافت بیضه و کاهش سطح تستوسترون می‌شود (10).

2- سم آندوسولفان به طور مستقیم روی بافتها و سلول‌های جنسی اثر گذاشته و سبب آسیب‌های مختلفی بر روی ساختار بیضه و رده‌های مختلف سلولی در فرآیند اسپرماتوژنز و اختلالات هورمونی می‌شود.

Vittozzi و همکاران در سال 2001 اثر بقاء سموم کشاورزی را بر میزان سلامت و سطح خونی کشاورزان مورد ارزیابی قرار دادند و دریافتند که اثرات طولانی مدت سم باعث تخریب بافت‌های کبد، کلیه و بیضه (9) و کاهش چشمگیری در سطح تستوسترون می‌شود (3،5).

یکی از دلایل افزایش LH این است که آندوسولفان مسیر فیدبک منفی LH را مهار می‌کند و با جلوگیری از مهار برگشتی، هورمون LH را افزایش می‌دهد. از طرفی کاهش هورمون تستوسترون باعث افزایش LH می‌گردد. همزمان با افزایش LH هورمون FSH نیز افزایش می‌یابد (2). محققین نشان دادند که حشره کش آندوسولفان بیوسنتز آندروژن‌های بیضه‌ای را در رت‌های بالغ محدود می‌کند. در بررسی تأثیر آندوسولفان روی تستوسترون و گنادوترپینهای پلاسما و تستوسترون بیضه‌ای و سرمی دریافتند که آندوسولفان باعث کاهش در سطح تستوسترون سرم می‌گردد (2) و این نتایج با نتیجه حاصل از تحقیق حاضر همخوانی دارد.

حشره کش‌های ارگانوکلره از جمله DDT، دی آلدرین، متوکسی کلر و آندوسولفان با وجود تمایلات متفاوت اتصالی به گیرنده اختصاصی خود که شباهت زیادی به رسپتورهای استروژنی دارد، با سیستم آندوکرین واکنش نشان داده و باعث گسیختگی این سیستم می‌گردند (5،11). در مطالعه دیگری روی موش ثابت شد که افزایش در پاکسازی آندروژن با کاهش در سطوح سرمی تستوسترون مرتبط است که خود حاصل از آلودگی با آندوسولفان است (7،12). بر اساس مطالعات انجام شده، آفت کش‌های دیگر از جمله لیندان، رانداپ با گسیختگی بیان ژن پروتئین star (تنظیمی حاد استروژنیک)، استروئیدوژنز را محدود می‌کنند (4). این پروتئین در انتقال کلسترول غشای داخلی میتوکندری، جائیکه آنزیم سیتوکروم p450 سنتز تمامی هورمون‌های استروئیدی را آغاز می‌کند، نقش دارد (1).

یکی از دلایل کاهش وزن بیضه‌ها کاهش تعداد رده‌های مختلف سلول‌های اسپرماتوژنیک و قطر لوله‌های اسپرم ساز منجر به کاهش وزن بیضه می شود این کاهش را می‌توان ناشی از کم شدن جمعیت سلولی موجود در لوله‌های اسپرم ساز بیضه یا کاهش سلول‌های بینابینی لوله‌های اسپرم ساز داشت (3،5). به نظر می‌رسد که این سم با توقف تقسیمات میتوز و القایی مرگ سلولی باعث کاهش سلول‌های ژرمینال شوند. این سلولها در فرآیند اسپرماتوژنز بسیار ضروری هستند و کاهش این سلولها لزوماَ رده‌های سلولی مثل اسپرماتوسیتها را تحت تأثیر قرار می‌دهند که در نهایت منجر به کاهش اسپرم خواهد گردید.

نتیجه گیری

نتایج تحقیق حاضر در تأیید مطالعات قبلی دلالت بر این دارد که سم آندوسولفان با اثر وابسته به دوز می‌تواند اثرات نامطلوب قابل ملاحظه‌ای بر شاخص‌های تولید مثلی داشته و با تغییر در میزان هورمون‌های جنسی نر و روند اسپرماتوژنز عامل کاهش سلول‌های اسپرماتوژنیک و در عین حال از درصد اسپرم‌های متحرک بکاهد. تمامی این موارد می‌تواند باعث آسیب‌جدی در سیستم تولید مثلی گردیده و سبب ناباروری ‌شود.

تشکر و قدردانی

از همکاران معاونت امور دام جهاد کشاورزی استان همدان که در انجام این طرح ما را یاری نموده‌اند قدردانی می‌گردد