Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Effects of L-arginine on development of mouse pre-implantation embryos in culture media with high level of glucose

Authors
Iraj Amiri 1
Hasan Marzban 2
Mohammad Barbarestani 2
Seyed Noureddin Nematollahi-Mahani 3
1 Anatomy Department, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran; Anatomy Department, Faculty of Medicine, Hamedan Medical Sciences University, Tehran, Iran
2 Anatomy Department, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran
3 Professor, Anatomy Department, Faculty of Medicine, Kerman Medical Sciences University, Kerman, Iran
Abstract
It is accepted that maternal hyperglycemia causes delay in early embryonic development, spontaneous miscarriage & malformations. According to various studies, some of these problems occur in earlier stages of embryonic developmen especially pre-implantation stage. It seems that elevated glucose level of blood can have important role in this regard as potential teratogen factor. One of cases, which can be related to racousnesses resulting from glucose effects is Nitric Oxide (NO) system disorder in hyperglycemic condition. Some evidences show at first in hyperglycemic condition, L-arginine uptake of media by embryo increases and therefore leads to decrease amount of available L-arginine and since L-arginine is essential substrate for NO production, so it’s decrease inhibits NO production. To examine this hypothesis, 2-cell embryos of mice were cultured in media of high concentration of glucose (30mM) and different concentrations of L-arginine (5, 10, 20 mM) and their growth and development were assessed and at the end, embryos were stained by Hoechst 33254 color and the number of their blactocysts were counted by use a Fluorescence microscope. Comparison of embryos culture in HTF culture media with different concentration of glucose and L-arginin showed in high glucose media up to 30 mM affects growth and development of embryos totally and decrease their blactocysts numbers, but addition of 5–10 mM L-arginine to this media significantly improves this condition. On the contrary addition of L-NAME (an antagonist of L-arginine) significantly inhibits the development of pre-implantation embryos. It seems that reduction in NO production in diabetes is due to decreases in amount of available L-arginine, because increase in L-arginine concentration in high glucose media up to 10 mM partially improves high glucose embryo toxicity. Base on acquired result, it seems use of L-arginine or material which cause NO release in media, can have important role in prevention of high glucosis embryo toxicity.
Keywords
Diabetes
embryo
Glucose
L
arginine
nitric oxide
Pre
Implantation

مقدمه:

امروزه این موضوع بخوبی پذیرفته شده است که هیپرگلیسمی مادر در طول دوران بارداری موجب تأخیر در مراحل اولیه رشد و تکامل جنین و بروز ناهنجاریهای مختلف مادرزادی و افزایش خطر سقطهای خودبخودی می‏گردد (3-1). هر چند در این مادران در دوران اندام‏زایی با کنترل هیپرگلیسمی میزان ناهنجاریهای فوق کاهش می‏یابد اما همچنان میزان آن سه تاچهار برابر بیشتر از مادران سالم می‏باشد (4). بر این اساس ممکن است مشکلات فوق در مراحل ابتدائی‏تر تکامل جنین بویژه در مرحلة پیش ‏لانه‏گزینی حاصل ‏شوند (8-5) و افزایش سطح گلوکز خون بعنوان یک عامل تراتوژن بالقوه در این مورد محسوب می‏شود (11-9). بنظر می‏رسد که اختلال در سیستم نیتریک‏اکساید (NO) در ایجاد ناهنجاریهای ناشی از گلوکز در شرایط هیپرگلیسمی نقش مهمی بر عهده دارد. Couge و همکاران در سال 1998 گزارش نمودند که نیتریک‏اکساید در مرحله پیش‏لانه‏گزینی توسط جنین تولید می‏گردد و این ترکیب نقش مهمی در تکامل و لانه‏گزینی جنین برعهده دارد بطوریکه مهار تولید NOباعث ایجاد تأخیر در رشد و تکامل و جلوگیری از لانه‏گزینی جنین می‏گردد (12). نتایج برخی از مطالعات نشان می‏دهند که در بیماران دیابتی مقدار NO در بافتهای مختلف بدن کاهش می‏یابد و این امر می تواند ناشی از کاهش تولید آن در شرایط هیپرگلیسمی و یا شکستن سریع آن پس از تولید باشد (14-13).Marina و همکاران معتقدند که کاهش میزان NO در شرایط هیپرگلیسمی در بیماران دیابتی ناشی از کاهش تولید آن بدلیل کاهش میزان L-arginine قابل دسترس، می‏باشد زیرا برخی شواهد حاکی از آن است که در چنین شرایطی ابتدا برداشت L-arginineاز محیط افزایش می‏یابد و این امر متعاقباً منجر به کاهش L-arginineقابل دسترس جنین می‏گردد و از آنجائیکه L-arginine سوبسترای لازم برای تولید NO می‏باشد لذا کاهش آن منجر به کاهش تولید NO می‏گردد (15) و از آنجائیکه تولید NO نقش مهمی در تکامل جنین در مرحله پیش لانه‏گزینی دارد بنابراین می‏تواند موجب اختلال در تکامل جنین در مرحله پیش لانه‏گزینی گردد. مطالعه حاضر جهت بررسی نقش L-arginine بعنوان سوبسترای نیتریک اکساید بر روی تکامل جنین‏های موش در محیطهای کشت حاوی گلوکز زیاد طراحی و اجراء گردید.

مواد و روشها:

تهیه جنین های 2 سلولی موش: تحریک تخمک گذاری در موشهای سوری ماده نژادNMRI با سن 10-6 هفته با تزریق داخل صفاتی 10 واحدPMSG و 48 ساعت بعد 10 واحد HCG انجام گرفت و بلافاصله پس از تزریق HCG هر حیوان ماده در کنار یک موش نر بالغ از همان نژاد قرار گرفته و صبح روز پس از تزریق HCG موشها از نظرپلاک واژینال مورد معاینه قرار گرفتند. 48 ساعت پس از تزریق HCG موشهای پلاک مثبت به روش نخاعی کردن گردن کشته و اویداکت آنها از بدنشان خارج و داخل یک قطره 100- 50 میکرولیتری از محیط کشتHEPES-HTF حاوی 4 mg/ml آلبومین سرم گاوی (Sigma, BSA, Fraction, V Free fatty acid, A8806) قرار داده شد. سپس با تزریق محیط کشت فوق از ناحیه اینفاندیبولوم به داخل اویداکت، جنین‏ها از سوی دیگر اویداکت‏ خارج شدند (عمل فلاشینگ ) تمام جنین‏های 2 سلولی با ظاهری سالم، پس از شستشوی پی در پی در چند قطرة تمیز از محیط کشت فوق، سرانجام در یک قطره جمع‏آوری شده و به طور تصادفی به تعداد 20-15 عدد در گروههای مورد مطالعه تقسیم می‏شدند.

محیطهای کشت:در این پژوهش از محیط کشت HTF (نخستین بار در سال 1985 بر اساس آنالیز ترکیبات مایع لوله رحم انسان توسطQuinn و همکارانش ساخته شد) بعنوان محیط کنترل استفاده گردید(16). غلظت گلوکز در محیط فوق mM 87/2 بود که با توجه به اهداف پژوهش با تغییر غلظت گلوکز و افزودن غلظتهای مختلفی از L-arginine و یا L-NAME محیطهای مورد نظر برای کشت جنین در گروههای مختلف این مطالعه به شرح زیر ساخته شد:

1- محیط کنترل،جهت کنترل از همان محیط HTF معمولی استفاده شد.

2- محیط HG ، جهت ساخت این محیط،غلظت گلوکز محیطHTF تا mM 30 افزایش داده شد.

3- محیط HG-5LA، برای ساخت این محیط به محیط HG مقدار mM 5، L-arginine اضافه گردید.

4- محیط HG-10LA، برای ساخت این محیط HG مقدار mM10، L-arginine اضافه گردید.

5- محیط HG-20LA، برای ساخت این محیط به محیط HG مقدار mM 20، L-arginine اضافه گردید.

6- محیطHG-L-NAME ، برای ساخت این محیط به محیط HG مقدار mM 1، L-NAME اضافه گردید. به هرکدام از محیطهای فوق قبل از استفاده mg/ml 4 آلبومین سرم گاوی (BSA) نیز اضافه شد. 24 ساعت قبل از کشت از هر کدام از محیطهای فوق قطرات 50 میکرولیتری درداخل دیش 35 میلی‏متری (Falcon 3001) تهیه و با روغن مخصوص کشت جنین (Sigma، Oil، Mineral) پوشیده شدند و به منظور ایجاد تعادل دما و گاز درداخل انکوباتور در دمای oc37 و5% گاز CO2 قرار گرفتند.جنین های 2 سلولی در گروههای 20-15 عددی به مدت 96 ساعت در قطرات فوق کشت داده شدند. آزمایش فوق برای هر گروه 10 بار تکرار گردید.

ارزیابی تکامل جنین ها:

ارزیابی جنین‏ها در فواصل 24 ساعته و به مدت 4 روز با میکروسکوپ اینورت انجام شد و جنین‏ها بر اساس موارد زیر دسته‏بندی شدند: جنین‏های 4- 2 سلولی، جنین‏ های 8 سلولی (که جنین‏های 8-4 سلولی را هم شامل می‏شدند)، مورولای متراکم ، بلاستوسیست ، هچینگ بلاستوسیست .

شمارش بلاستومرها: پس از اتمام کشت، جنین‏ها جمع‏آوری و پس از 2 بار شستشو در PBS به مدت ساعت در پارافرمالدئید 4% فیکس شدند. سپس به روی لام میکروسکوپی انتقال یافته و لامها به مدت 24 ساعت در دمای اطاق نگهداری شدند تا خشک شوند. سپس لامهای فوق دو بار با PBS شسته شده و مجدداً 2 ساعت در دمای اطاق نگهداری شدند تا خشک شوند. پس از خشک شدن لامها، ‏یک‏ قطره از مخلوط رنگ Hochest 33254 (w/v) 5% در DABCO (1,4-diazobi cyclo-2,2,2-octete-sigma) حاوی (90%) گلسیرول و (10%) Na2HP0032./ مول به روی لامها ریخته و نمونه‏ها به آرامی بوسیله یک لامل پوشیده شدند. در پایان اسلایدهای تهیه شده با کمک یک میکروسکوپ فلورسانس (Olympus Japan) و با استفاده از فیلترExitation با طول موج nm380-330 و فیلتر Barrier با طول موج nm 420 بررسی شدند. در این روش هستة سلولهای جنینی با Hochest رنگ آبی به خود گرفته و تعداد آنها قابل شمارش می‏باشد.

آنالیز آماری:

میزان تکامل جنین‏های گروههای مختلف و تعداد متوسط بلاستومرها در گروههای مختلف با استفاده از آزمون ANOVA یکطرفه و با کمک نرم‏افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج:

مقایسه تکامل جنین‏‏های موش طی 96 ساعت کشت در گروههای مختلف در جدول 1 آمده است. مقایسه میزان مورولاهای متراکم در 24 ساعت اول کشت نشان داد در حالی که بیش از (65/2±)95% جنین‏های گروه کنترل به مرحله مورولای متراکم رسیده بودند این میزان در گروه HG(52/5±)9/89% و در گروههایHG-5LA وHG-10LA به ترتیب (6±) 9/93% و (43/4±)42/95% بود که هیچ تفاوت معنی‏داری بین آنها وجود نداشت اما تنها (25/7±)46/62% از جنینهای گروهHG-20LA و (82/3±)99/16% از گروه HG-L-NAME به مورولای متراکم تبدیل شدند که اختلاف آن با گروه کنترل معنی‏دار است. بررسی میزان بلاستوسیستها طی 72 ساعت پس از کشت نشان داد در حالیکه بیش از (1/8±)6/74% از جنین‏های گروه کنترل به مرحله بلاستوسیت رسیده بودند (شکل 1)، این میزان در گروه HG تنها (5/5±)9/36% میباشد (جدول 1). میزان بلاستوسیت ها درگروههای HG-5LA و HG-10LA به ترتیب (5±)76/61% و (6/7±)25/62% که هم نسبت به گروه کنترل و هم گروه HG افزایش واضح و معنی‏داری را نشان می‏داد (0001/0‍P<). درگروه HG-20LA نیز تنها (16±)8/27% از جنینها به مرحله بلاستوسیست رسیدند و در گروه HG-L-NAME هیچ جنینی به بلاستوسیست نرسیده و تمامی جنینها فراگمنته شدند. میزان بلاستوسیستها 72 ساعت پس از کشت نیز در گروه کنترل (5±)82/79% گروه HG (5/5±)43% و گروههای HG-5LA ،HG-10LA و HG-20LA به ترتیب (4/5±)67%، (7±)5/69% و (16±)5/27% بود. 96 ساعت پس از کشت درحالیکه 4±32% از جنین‏های گروه کنترل در مرحلة هچینگ بودند فقط 7±10% از جنین‏های گروه HG هچینگ داشتند و در گروههای 5، 10 و20 میلی‏مولار L-arginine نیز به ترتیب 7/7±7/20،6/6±33/25و3/6±3/10 درصد بود. بر اساس نتایج فوق تکامل جنین‏ها درگروه و HG-10LA, HG-5LA بطور معنی‏داری با گروه HG تفاوت دارد (0001/0P<). این تفاوت معنی‏دار در مقایسه با گروه کنترل نیز مشاهده می شود.

میانگین تعداد کل بلاستومرها در جنین‏های گروههای مختلف پس از 96 ساعت کشت در نمودار 1 نشان داده شده است. مقایسة میانگین تعداد بلاستومرها (شکل 2) در گروههای مختلف نشان می‏دهد که بطور متوسط تعداد بلاستومرها در بلاستوسیست‏های گروه کنترل (43/17±)14/129 عدد بود در حالیکه این رقم در گروه HG، (73/16±)66/95 بود که با افزودن L-arginine به محیط کشت تعداد بلاستومرها افزایش یافته و در گرو‏ههای HG-5LA ،HG-10LA و HG-20LA به ترتیب (73/19)± 119 و (7/15)±120 و (11)±92 عدد بود که اختلاف معنی‏داری بین گروه کنترل با گروه HG، HG-20LA و HG-10LA وجود دارد (0001/0P<)، اما بین گروه کنترل و گروههای HG-5LA، HG-10LA این اختلاف بطور معنی‏داری کاهش می‏یابد. بدلیل آنکه تکوین جنین‏های گروههایHG-L-NAME در مرحلة قبل از مورولا متوقف می‏گردید، جنین‏های فوق از برنامه شمارش بلاستومرها حذف گردیدند.

بحث

مقایسة کشت جنین‏ها در محیطهای کشت HTF با غلظتهای مختلف گلوکز و L-arginineنشان داد که افزایش غلظت گلوکز تا mM30 کاملاً بر روی تکامل جنین اثر گذاشته و باعث تأخیر در رشد و کاهش تعداد بلاستومرها در بلاستوسیست ‏می‏گردد. با مقایسه نتایج بدست آمده از این پژوهش با نتایج بدست آمده توسط محققین دیگر مشاهده می‏شود که تشابهات و در عین حال تفاوتهایی وجود دارد. به عنوان مثال Wercheral و همکاران در سال 1998 گزارش نمودند (2) که تنها 20% از جنین‏هایی که 96 ساعت پس از تزریق HCG ازموشهای دیابتی جمع‏آوری شدند به مرحلة بلاستوسیست می‏رسند درحالیکه این رقم در مورد گروه کنترل در حدود 90% می‏باشد. در مطالعه حاضر نیز دیده شد که 72 ساعت پس از کشت در حدود 77% از جنین‏های گروه کنترل به مرحلة بلاستوسیست می‏رسند در حالیکه این رقم در گروه HG در حدود 48% بود که افزایش سطح L-arginine در محیط کشت HG به میزان mM5 و mM10 این میزان را بطور معنی‏داری افزایش داده بود. در حالیکه با افزایش میزان L-arginine تا mM20 از میزان جنینهای رسیده به مرحله بلاستوسیست کاسته می‏شود واین امر نشان می‏دهد که افزایش بیش از اندازه L-arginine در محیط کشت اثر منفی بر رشد و تکامل جنین‏ها بر جای می‏گذارد. همچنین در این مطالعه مشاهده گردید که افزایش غلظت گلوکز تا mM 30 تأثیر چندانی در تکامل جنین تا مرحله مورولای متراکم ندارد در حالیکه افزودن یک مادة مهار کننده NO بنام L-NAME به میزان mM 1 باعث مهار شدید تکامل جنین در مرحله فوق شده و از تشکیل مورولای متراکم تا حدود زیادی جلوگیری می‏کند. از طرف دیگر افزایش سطح گلوکز محیط کشت، تبدیل مورولای متراکم به بلاستوسیست را شدیداً تحت تأثیر قرار داده و موجب تأخیر در آن می‏گردد و افزایش L-arginine تا میزان mM 10 در محیط کشت تا حدودی می‏تواند این روند را بهبود بخشد. لیکن هرگاه میزان L-arginine تا میزان mM20 افزایش یابد، بطور معنی‏داری از میزان جنینهای مرحلة بلاستوسیستها کاسته می‏شود. چنین تأثیری در مورد میزان هچینگ نیز مشاهده گردید. همچنین در این تحقیق مشاهده شد که اگر چه تعداد بلاستومرها در بلاستوسیستهای گروه HG نسبت به گروه کنترل بیش از 30% کاهش نشان می‏دهند که تقریباً معادل نتایج گزارشات دیگر می‏باشد (5-1) لیکن افزودن L-arginine به محیط تا حدود mM 10 کاملاً باعث بهبود این وضعیت می‏گردد و بنظر می‏رسد که L-arginine تأثیر کاملاً مثبتی بر روی سیکل سلولی بر جای می گذارد. مقایسه نتایج بدست آمده از این مطالعه با مطالعات مشابه دیگری که برروی انواع سلولها و بافتهای دیگر در شرایط مشابه انجام گرفته نشان می‏دهد که همانند سلولها و بافتهای دیگر، تولید نیتریک اکساید که نقش مهمی در تکامل جنین دارد(17) در محیط HG مختل شده و این نتایج معرف اثرات زیانبار گلوکز بر روی تکامل جنین در مراحل اولیه می‏باشد. بطور مشابهی Trachtman و همکاران در سال 1997 نشان دادند که کشت سلولهایMesangial در محیطهای حاوی mM 33 گلوکز باعث ایجاد اختلال در سیستم نیتریک اکساید و کاهش میزان نیتریت تولید شده توسط سلولهای فوق گشته و نهایتاً باعث افزایش مرگ و میر در سلولهای فوق می‏گردد، لیکن افزودن L-arginine به میزان mM 20-10 به محیط کشت باعث بهبود روند فوق شده و از عوارض HG برروی سلولهای فوق ممانعت بعمل آورد (18) وهمچنین Ho و همکاران نیز در سال 1999 نشان دادند که نیتریک اکساید می‏تواند از آپوپتوزیس سلولهای اندوتلیال عروق در محیطهای کشت حاوی گلوکز زیاد جلوگیری بعمل آورد(19). مطالعات انجام شده درمورد تکامل جنین و لانه‏گزینی آن نیز حاکی از اهمیت نیتریک اکساید در این مورد می‏باشند بطوریکه Gouge و همکارانش در سال 1998 گزارش نمودند که جنین در مرحله قبل از لانه‏گزینی نیتریک اکساید تولید می‏نماید و این امر نقش مهمی در تکامل و لانه‏گزینی آن را برعهده دارد، بطوریکه مهار تولید NO باعث تأخیر در رشد و جلوگیری از لانه‏گزینی جنین می‏گردد (12). همچنین Navaro و همکارانش در سال 1997 گزارش نمودند که در طی مرحلة پیش لانه‏گزینی نیتریک اکساید توسط رحم و لوله‏ای رحمی مادر ساخته شده و این امر نقش مهمی در تکامل جنین و آماده سازی رحم جهت لانه‏گزینی دارد(20). علی‏رغم موارد فوق، گزارشات متضادی نیز دیده می‏شود بطور مثال Joo و همکارانش در سال 1997 گزارش نمودند که افزودن ماده‏ای نظیر SNP که باعث آزاد سازی نیتریک اکساید بصورت اگزوژن در محیط کشت می‏گردد، منجر به مهار تکامل جنین‏ها در مرحلة پیش لانه‏گزینی می‏گردد (21). لیکن به نظر می‏رسد که NO اندوژن نقش مهمی در تکامل جنین بازی می‏کند. امروزه مشخص شده است که بسیاری از فعالیتهای بیولوژیک NO بواسطة فعال نمودن آنزیم بوده و NOممکن است در کنترل مسیرهای انتقال پیام وابسته به cGMP در تنظیم فیزیولوژی طبیعی سلول نقش داشته باشد و گزارشات مختلف نیز تقریباً مشخص نموده‏اند که NO وcGMP نقش بسیار مهمی در کنترل سیکل سلولی و روند آپوپتوزیس دارند (22-21، 12). در واقع NO برای تکمیل سیکل سلولی ضروری بوده و کاهش و یا حتی افزایش مقدار NO باعث اختلال در سیکل طبیعی سلول می‏گردد (23-22) لیکن رابطه دقیق بین آشفتگی در سیکل سلولی و ایجاد آپوپتوزیس پس از حذف NO، مشخص نگردیده است و ممکن است مهار یا یک توقف در روند سیکل سلولی تحریک کننده آغاز آپوپتوزیس از طریق فعال نمودن ژنهای مربوطه باشد. از طرف دیگر مطالعات مختلف نشان داده‏اند که شرایط دیابتی باعث افزایش استرس‏های اکسیداتیو شده و به دنبال آن تولید ROS در بدن افزایش می‏یابد (25-24). امروزه مشخص شده است که NO یک فاکتور مهم در محافظت سلولها در برابر اثرات زیانبار ROS می‏باشد و همواره در بدن یک تعادل بحرانی بین ROS و NO وجود دارد و ممکن است که تعادل فوق یک نقش اساسی در فرآیند سیکل سلولی و حیات آن بعهده داشته باشد (25-24، 22). کاهش تولید NO در دیابت می‏تواند ناشی از کاهش L-arginine در دسترس باشد زیرا در افراد دیابتی برداشت L-arginine افزایش یافته و متعاقباً باعث کاهش مقدار در دسترس آن می‏گردد (15). این مطالعه نشان داد که احتمالاً مسئله فوق در مورد تکامل جنین در مرحلة قبل از لانه‏گزینی نیز صادق می‏باشد، زیرا افزایش غلظت L-arginine در محیطهای HG تا mM 10 باعث بهبود نسبی عوارض ناشی از High Glucose می‏گردد. باتوجه به نتایج حاصل از این مطالعه بنظر می‏رسد که استفاده از L-arginine و یا مواردی که باعث آزاد سازی NO در محیط می‏گردند دارای نقش مهمی در جلوگیری از برخی از عوارض هیپرگلیسمی بر روی جنین داشته باشد لیکن جهت اظهار نظر دقیق در این مورد و یافتن راههای کاربردی در این مورد انجام مطالعات بیشتر بصورت In vivo ضروری می‏باشد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از گروه زنان و زایمان دانشکده پزشکی دانشگاه یاماگاتا ژاپن که در انجام این طرح با ما کمال همکاری را نمودند سپاسگزاریم. همچنین از آقای دکتر محمد اکبری مدیر محترم گروه آناتومی دانشگاه علوم پزشکی تهران و آقای دکتر عظیمی سبحانی سرپرست محترم آزمایشگاه جنین‏شناسی تشکر و قدردانی بعمل می‏آید.

  1. Richard G., Mccrecken E.J. Disturbed development of the pre implantation embryos in the insulin–depedent diabetic BB/E rats. Diabetes. 1996; 1463-70.
  2. Wercheval M., Hertogh R. Experimental diabetes rat embryo development during the pre-implantation period. Diabetologia. 1990; 33: 187-91.
  3. Pamfer S., Hertogh R., Vanderhyden I. Increased inner cell mass proportion in blastocyst diabetes. 1990; (39): 471-976.
  4. Mill S. Lack of relation of increased malformation in infants of diabetic mother to glycemic control during organogenesis. New Eng J Med. 1998; 318: 671-9.
  5. Hertogh R., Vercheval M., Pamfer S. Experimental diabetes interference with the early development of rat embryo in the pre-implantation period. Diabetologia. 1989; 32: 480A.
  6. Moley K.H., Chi M.Y., Knudson C.M. Hyperglycemia induces apoptosis in pre-implantation embryos through call death effector pathways. Nature Med. 1998; 4(12): 1421-4.
  7. Pamfer S., Vsnderhyden I., Mccracken E.J. Increased cell death in rat blastocysts exposed to maternal diabetes in utero and high glucose or tumor necrosis factor in vitro. Dev. 1997; 124: 4827-36.
  8. Beebe I., Kaye P. Maternal diabetes and retarded pre-implantation development of mice.Diabetes. 1991; 40: 457-61.
  9. Gardner D.K., Leese H.J. Concentration of nutrients in mouse oviduct fluid and their
  10. Hertogh R., Vanderheyden I., Pamfer S. Stimulatory and inhibitory effects of glucose and insulin on rat blastocysts development in vitro. Diabetes. 1991; 40: 641-7.
  11. Xialin Y., Hakanborg L., Eriksson J. Altered mitochondria morphology of rat embryos in diabetic pregnancy. Anat Rec. 1995; 241: 255-67.
  12. Gouge R., Marshburn P., Gordon B., et al. Nitric oxide as a regulatory of embryonic development. Biol Reprod. 1998; 58: 875-9.
  13. Lindsay R.M. In vivo and in vitro evidence of altered Nitric oxide metabolisms in the spountaneusly diabetic insulin BB/E rat. Br J Pharmacol. 1997; 120:1-6.
  14. Karabatus L.,Fabiano L., Bruno D. Inhabitation of Nitric oxide generation: normalization of in vitro insulin secretion in mice. Metab. 1996; 45(8): 940-6.
  15. Marina L., Morrison P. Nitric oxide availability in diabetes mellitus. Diabetes Metab Rev. 1998; 14; 241-9.
  16. Quinn P., Kerin J., Warnes G.M. Improved pregnancy rats in human in vitro fertilization with the use of a media based on the composition of human tubal fluid. Fertil Steril. 1985; 44: 493-8.
  17. Huei W.C., Wen S.J., Chii R.T. Nitric oxide as a regulator in pre-implantation embryo development and apoptosis. Fertil Steril. 2001; 75 (6): 1163-71.
  18. Trachtman H., Futrweit S., Crimmins D. High glucose inhibits nitric oxide production in cultured rat mesangial cells. J Am Soc Nephrol. 1997; 8(8): 1276-82.
  19. Ho F., Liau C.S., Liu S.H., et al. Nitric oxide prevents apoptosis of human endothelial cells from high glucose exposure during early stage. J Cell Biochem. 1999; 75(2): 258-63.
  20. Novaro V., Gonzalez E. Nitric oxide synthasa regulation during embryonic implantation. Reprod Fertil. 1997; 9: 557-64.
  21. Joo B., Park S.H., Park S.J., et al. The effect of nitric oxide on sperm cell function and embryo development. Am J Reprod Immun. 1997; 42(6): 327-34.
  22. David A., Wink J., Cook A. Nitric oxide protects against cellular damage by ROS. Toxicol Lett. 1995; 82-3: 221-6.
  23. Yvonne E., Janssen M.W. Depletion of Nitric oxide causes cell alteration, apoptosis and oxidative stress. Am Phys Soc. 1998; 1100-8.
  24. Ornoy A., Kimyagarov D., Yaffee P., et al. Role of reactive oxygen species in diabetic induced embryo toxicity: studies on pre-implantation mouse embryos cultured in serum from diabetic pregnant women. Isr J Med Sci. 1999; 32(11): 1066-73.
  25. Oraly V. Nitric oxide and oxygen radicals: a question of balance. FEBS Letter. 1995; 396: 131-5.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 2, Issue 3
Summer 2001
Pages 4-12