Effect of human follicular fluid on implantation of mouse embryo

Nasr-Esfahani, Mohammad Hossein; Rezai, Abbas; Mardani, Mohammad; Yousefian, Elham; Khosravi, Felora

Effect of human follicular fluid on implantation of mouse embryo

Authors

Mohammad Hossein Nasr-Esfahani ¹

Abbas Rezai ²

Mohammad Mardani ³

Elham Yousefian ⁴

Felora Khosravi ⁵

¹ Isfahan Fertility and Infertility Center, Isfahan, Iran; Royan Institute, Isfahan, Iran

² Immunology Department, Faculty of Medicine, Isfahan Medical Sciences University, Isfahan, Iran

³ Anatomy Department, Faculty of Medicine, Isfahan Medical Sciences University, Isfahan, Iran

⁴ Nursing Department, Faculty of Nursing, Falavarjan Azad University, Isfahan, Iran

⁵ Anatomy Department, Faculty of Medical Sciences, Tarbiyat Modares University, Tehran, Iran

Abstract

Prevention of implantation is considered as one of the suitable methods for contraception or interception. Therefore during this study the effect of human follicular fluid (FF) on mouse implantation was evaluated. The results obtained during this study show that FF contains enzymes and upon incubation with mouse uterine tissue, results in delimitation of epithelium. This effect was inhibited by heat inactivation or addition of EDTA to FF. In vivo uterine wash with follicular fluid on days 3,4,5 and 6-post mating prevents implantation and therefore significantly reduces implantation and pregnancy rate. However uterine wash on day 7 post mating with FF had no effect on implantation and pregnancy rate. On day 3,4,5,6 and 7 with Ham’s 10 as control had no effect on implantation or pregnancy rate. Addition of EDTA also prevented the in vivo effect of FF, suggesting that the active agent present in FF is likely to be a metalloprotoinase which inactivates with heat and addition of EDTA. Taking into consideration the fact that FF does not affect the pregnancy of the next cycles, thus the FF or its active agent can be considered as good interceptive agent for prevention of pregnancy rate.

Keywords

Follicular fluid

Implantation

metalloproteinase

مقدمه

افزایش درصد بارداری‏های ناخواسته موجب ابداع روشهای مختلف جلوگیری از بارداری گشته است. با توجه به عدم اطمینان کافی و عوارض سوء جانبی روشهای پیشگیری و همچنین غیر قانونی و غیر اخلاقی بودن سقط جنین، محققین بر آن شدند که روشهایی ابداع نمایند تا بتوانند از بارداری‏های ناخواسته قبل یا در طی مرحله لانه‏گزینی جلوگیری نمایند(3-1). پس از تخمک‏گذاری و لقاح، جنین از لوله رحمی عبور نموده و با از دست دادن و خروج از جسم شفاف در مجاورت اپی‏تلیوم رحم قرار می‏گیرد. جنین که در این مرحله بلاستوسیست نامیده می‏شود با اپی‏تلیوم رحم تماس یافته و سپس تا هنگامی که لانه‏گزینی کامل شود تهاجم به داخل بافت رحمی را ادامه می‏دهد.

لازمه لانه‏گزینی همکنشی، ارتباط و دیالوگ دو طرفه بین بلاستوسیست مهاجم و آندومتر پذیرنده می‏باشد (5-4). رویدادهای فوق در محدوده کوتاهی از سیکل رحمی تحت تأثیر هورمونها، پینوپودها، مولکولهای چسبنده سلولی، سیتوکین‏ها، هورمونهای رشد، پینویودها، اینتگرین‏ها،CSF ، LI و متالوپروتئینازها می‏باشد (8-7،6،4). از جمله دیالوگ بین تروفوبلاست و آندومتر پذیرنده جنین، همکنشی IL-1 و ممانعت کننده متالوپروتئیناز ترشح شده توسط استرومای آندومتر رحم باعث لیز‏شدن پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی از جمله غشاء پایه زیر اپی‏تلیوم رحم می‏شود. جهت جلوگیری از پروتئولیز نابجای ماتریکس خارج سلولی، سلولهای استروما ممانعت کننده‏های متاپروتئیناز تولید می‎‏نمایند، اما در طی تهاجم، IL-1 تولید شده از بلاستوسیست باعث کاهش فعالیت ممانعت کننده متاپروتئینازها شده که بیانگر آن است که بلاستوسیست تهاجم خود را با جلوگیری از فعالیت فاکتورهای ممانعت‏کننده متالوپروتئیناز در محل لانه‏گزینی تحریک می‏نماید (11-10). اگر چه مایع فولیکولی محیط مناسبی جهت رشد تخمک می‏باشد، ولی سرشار از آنزیم‏های پروتئولیتیک از جمله متالوپروتئینازها مانند کلاژناز نوع IV می‏باشد که برای تحلیل غشاء پایه سلول‌های گرانولوزا ضروری است(12). در طی فرایند تخمک‏گذاری تحت تأثیر LH مقدار ممانعت کننده‌های متالوپروتئیناز تغییر‌ یافته و منجر به فعال‏شدن متالوپروتئینازها از جمله کلاژناز نوع IV می‌گردد (14-13).

با توجه به این که ساختار غشاء پایه در تمام بافت‌های بدن مشابه می‌باشند، بر آن شدیم که در این تحقیق تأثیر مایع فولیکولی انسانی را بر بافت رحم موش و نیز تأثیر آن‏را بر روند باروری مطالعه نماییم.

مواد و روشها

تهیه مایع فولیکولی: مایع فولیکولی از بیماران مراجعه کننده به مرکز باروری و ناباروری شهر اصفهان تهیه گردید. جهت سیکل‌های IVF و ایجاد سوپر اولاسیون از HMG (Organon, Holand, FSH= 75 IU, LH= 75 IU) استفاده شد و پس از بررسی رشد فولیکول‌ها توسط سونوگرافی واژینال، فرایند تخمک‏گذاری توسط 000/10 واحد HCG (Organon, Holand LIF) القاء شد. سپس فولیکولهای بالغ قبل از تخمک‏گذاری (36-34 ساعت بعد از تزریق HCG) توسط سوزن‌های پانکچر (CCD, France) تحت سونوگرافی واژینال تخلیه شد. پس از جدا شدن تخمک از مایع فولیکولی تخلیه شده (حتی الامکان بدون خون )، مایع فولیکولی جمع‌آوری شده و در لوله‌های فالکون (ml5) سانتریفوژ گردید و مایع رویی (فاقد سلول) بداخل لوله فالکون جدید منتقل و جهت بررسیهای بعدی استفاده گردید. مایع فولیکولی بیماران مبتلا به مشکلات تخمدانی یا آندومتریوز‌ از مطالعه حذف گردید.

بررسی تأثیر مایع فولیکولی انسان بر روی ساختار رحم موشIn vitro)): پس از نخاعی کردن موش سوری شاخهای رحم بطور استریل خارج گردید و در داخل دیش‌های فالکون (ml5) حاوی بافرفسفات (PBS) استریل انتقال داده و سپس شاخهای رحمی به قطعات کوچک مساوی تقسیم گردید، سپس قطعات رحمی به لـولـه‌های فالکون ml5 حاوی محیط‌های زیر منتقل شد.

لـولـه1 مایع فولیکولی تازه، لوله2 حاوی مایع فولیکولی فیلتر شده (μ nm Millipore 22/0) ، لوله3مایع فولیکولی غیرفعال شده در 56 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه، لوله4 محیط Ham’s–F10 دارای 4/7pH= و اسمولاریته mosmol/L285 که در انکوباتور حاوی 5% Co2 به تعادل رسیده است، لوله 5 PBS حاوی 10% فرمالین و نهایتاً لوله 6 مایع فولیکولی تازه دارایEDTA (M02/0).

هر یک از لـولـه‌های فوق در دمای 37 درجه در انکوباتور حاوی5%CO2 به مدت20 ساعت نگهداری شد. سپس جهت مشاهده تغییرات بافتی احتمالی و مقایسه آنها با کنترل، بافت‌ها در فرمالین 10% به مدت 24 ساعت فیکس شد و سپس اعمال تدارکات بافتی ، برش و رنگ‌آمیزی با H&E ،PAS و Gomori مورد مطالعه قرار گرفت. آزمایشات فوق با 5 بار تکرار انجام شد. شستشوی شاخ‌های رحم موش: جهت شستشوی شاخ‌های رحمی موش از Cut Dwon Tube شماره 4 استفاده شد به این ترتیب که یک انتهای Cut Dwon Tube به سرنگ حاوی محلول مورد نظر متصل و انتهای دیگر آن از طریق واژینال به سمت ورودی شاخ‌های رحم هدایت ‌شد، سپس به تدریج ml2/0-1/0 از ماده محتوی سرنگ به آرامی به داخل رحم تزریق گردید. لازم به ذکر است جهت پیشگیری از ورود صدمه یا تروما به حیوان، موش به گونه‌ای در یک دست به طور وارونه ثابت نگهداری می‌شد که در طی تزریق نتواند هیچگونه حرکتی داشته باشد. پس از تزریق، موش در این وضعیت به مدت 3 تا 5 دقیقه نگه داشته می‌شد.

بررسی تأثیر مایع فولیکولی بر ادامه باروری در موش‌: به منظور بررسی تأثیر مایع فولیکولی بر درصد باروری در موش،700 سر موش سوری آزمایشگاهی ماده بین 3-2 ماهه از حیوانخانه دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی اصفهان تهیه شد. سپس موشهای ماده به نسبت 2 به 1 با موشهای نر بالغ هم نژاد خود در یک قفس نگهداری شده تا جفت‏گیری نمایند. سپس با رویت پلاک واژینال در صبح روز بعد هر موش در قفس‌های جداگانه نگهداری و به هر یک از آنها کد داده شد و روز یکم بارداری، روز مشاهده پلاک، به عنوان روز یکم بارداری ثبت گردید. سپس موشها بر اساس روزهای بارداری پس از رؤیت پلاک واژن به پنج گروه تقسیم شدند. روز 3، 4، 5، 6 و 7 به ترتیب در هر گروه 111، 114، 158، 109 و 108 سر موش قرار گرفت.

در هر یک از گروههای فوق موشها به سه زیر گروه مختلف دسته‏بندی شدند. شامل: گروه کنترل که تحت هیچگونه درمانی قرار نگرفته، گروه شاهد که رحم آنها با مایعی از Ham’s-F10 تحت شستشو قرار گرفت که به مدت24 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه و 5% CO2 ،4/7pH= و اسمولاریته mosmol/L285 قرار گرفت و گروه تیمار که خود به دو زیر گروه تقسیم شده و یک زیر گروه تحت شستشوی رحمی با مایع فولیکولی تازه فیلتر شده و گروه دیگر با مایع فولیکولی تازه بدون فیلتراسیون قرار گرفتند.

موش‌های روز پنجم به 4 زیر گروه تقسیم شدند که علاوه بر 3 زیر گروه فوق، زیر گروه چهارم دارای موشهایی بود که تحت شستشوی رحمی با مایع فولیکولی فیلتر شده حاوی EDTA (M02/0) قرار گرفته بودند.

تأثیر شستشوی شاخهای رحم بر باروری در سیکلهای بعد: شاخ‌های رحمی تعداد 15، 17، 13 و 18 موش از گروههای پنجگانه فوق که بین روز 7-3 با مایع فولیکولی فیلتر شده شستشو داده شده بودند و تا 25 روز بعد آثار بارداری و زایمان در آنها رؤیت نشد، در قفسهای جداگانه بر اساس روز تزریق نگهداری شدند و سپس این موشها با موش‏های نر بالغ هم نژاد خود در یک قفس نگهداری شدند تا جفت‏گیری کنند و موشهای ماده بعد از مشاهده پلاک واژینال در محل از هم جدا در قفس جداگانه نگهداری شدند. سپس درصد بارداری موشها در هر گروه مشخص گردید.

بررسی بافت شناسی شاخ‌های رحم موش پس از شستشوی آنها با مایع فولیکولی: پس از رؤیت پلاک شاخ‌های رحمی 10موش در روز پنجم ، توسط مایع فولیکولی شستشو داده شد. 2، 4، 8 و 16 ساعت بعد از شستشو شاخ‌های رحمی خارج و جهت مشاهده تغییرات بافتی احتمالی و مقایسه آنها با موش باردار پنج روزه که فقط با محیط Ham’s-F10 (طبق شرایط فوق) و 4 موش باردار 5 روزه که تحت هیچگونه تیماری قرار نگرفته بود مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی آماری: جهت تعیین درصد بارداری، تعداد موش باردار در هر گروه مشخص و سپس تقسیم بر تعداد کل موشها در آن گروه گردید. جهت مقایسه اختلاف درصد بارداری در گروهها از روش آزمون مجذور کای (Chi-Square) استفاده گردید. جهت تعیین درصد لانه‏گزینی نسبت به تعداد موش‌های باردار شده و تعیین تعداد جنین در هر شاخ رحمی در هر گروه پس از قطع نخاعی نمودن موشها بین روز 13-10 شاخ‌های رحمی خارج شد و تعداد جنین در هر شاخ ثبت گردید و تقسیم بر تعداد موش‌های باردار گردید و از آزمون آماری آنالیز واریانس یکطرفه (t-Test) جهت مقایسه میانگین تعداد جنین استفاده شد.

نتایج

بررسی تأثیر مایع فولیکولی انسان بر روی رحم موش در شرایط in vitro : 1- در نمونه‌های کنترل که رحم‌ها بطور مستقیم در PBS حاوی فرمالین فیکس شده بود به ترتیب لایه پریمتر ، میومتر و اندومتر به آسانی قابل مشاهده بود، بخش آندومتر از دو قسمت اپی‏تلیوم منشور ساده و استروما تشکیل شده بود. در رنگ آمیزی PAS و نقره‌ گوموری غشاء پایه و داربست آندومتر کاملاً قابل تشخیص بود.

2- قطعات رحم‌هایی که در مجاورت مایع فولیکولی تازه فیلتر شده و مایع فیلتر نشده قرار گرفته بودند غشاء پایه و اپی‏تلیوم کاملاً جدا (Delaminate) شده (شکل b -1) و سلولهای آن در داخل فضای حفره رحمی قابل مشاهده بود. در سایر لایه‌های بافتی رحم، از هم گسیختگی بافت همبند و منهدم شدن غدد آندومتری قابل رؤیت بود.

3- در تیمارهایی که قطعات رحم در مجاورت مایع فولیکولی غیر فعال شده، مایع فولیکولی به اضافه EDTA و محیط Ham’s -F10 قرار گرفته بودند. در مقایسه با گروه مستقیماً فیکس شده در فرمالین تغییرات مشخصی، دیده نشد و تقریباً بافت رحم در همه تکرارها سالم و مشابه بافت طبیعی در گروه کنترل بود(شکل a -1).

بررسی تأثیر مایع فولیکولی بر ادامه بارداری موشهای سوری: نتایج حاصله از تأثیر شستشوی رحم توسط مایع فولیکولی فیلتر شده و نشده و شستشو با Ham’s- F10 (گروه شاهد) و گروه کنترل در روزهای سوم تا هفتم در نمودار1 مشخص شده است. درصد بارداری در موشهای گروه کنترل که تحت هیچگونه تیماری قرار نگرفته‌اند در روزهای سوم تا هفتم حدود 90% تا100% بود، ولی در گروه شاهد که در آنها شاخ‌های رحم توسط محیط Ham’s-F10 شستشو داده شده بود، درصد بارداری به 90%-80% رسید که تفاوت معنی‏داری را با گروه کنترل نشان داد. در گروهی که شاخ‌های رحمی با مایع فولیکولی فیلتر شده شستشو داده شده بود، درصد بارداری بین روزهای سوم و پنجم به کمتر از 20% و در گروهی که با مایع فولیکولی فیلتر نشده تیمار شده بودند، بارداری به کمتر از 25% کاهش یافت که تفاوت چشمگیری را با گروه شاهد و کنترل نشان می‌دهد، اما تفاوت چشمگیری بین گروه فیلتر شده و فیلتر نشده دیده نشد ولی درصد بارداری درروزهای ششم بطرف گروه شاهد و کنترل افزایش می‌یابد و در روز هفتم درصد بارداری بین هیچ یک از گروهها تفاوت چشمگیری را نشان نداد( نمودار1). در روز پنجم با اضافه نمودن EDTA به مایع فولیکولی درصد بارداری، مشابه گروه کنترل بود. درصد لانه‏گزینی نسبت به تعداد موشهای باردار تحت درمان Ham’s- F10 در گروه کنترل بین 4/9%-6/7% و در گروه شاهد 8/7%-4/6% بین روزهای سوم تا هفتم بود که در این دو گروه تفاوت چشمگیری مشاهده شد، ولی این درصدها در گروههای تحت تیمار با مایع فولیکولی فیلتر شده و فیلتر نشده به حداقل 6/0بین روزهای سوم و پنجم کاهش یافت که با گروه کنترل تفاوت چشمگیری داشت ولی میزان لانه‏گزینی مانند میزان بارداری در روز پنجم تا روز هفتم افزایش یافته و به 3/8% رسید که در مقایسه با گروه کنترل و شاهد تفاوت معنی‏داری دیده نشد(نمودار2).

تأثیر شستشوی شاخ‌های رحمی بر بارداری در سیکل‌های بعدی: میزان بارداری در سیکلهای بعدی در موشهای گروه آزمایش( که بین روزهای سوم تا هفتم رحم آنها در سیکل قبلی با مایع فولیکولی شستشو داده شده بودند) به100%-2/88% رسید که با گروه کنترل تفاوت معنی‏داری را نشان نداد و در روزهای سوم تا هفتم نتایج آن با گروه‌ کنترل (نمودار1) تفاوت‌ معنی‌داری را نشان‌ نداد (نمودار2).

بررسی بافت شناسی شاخ‌های رحم موش پس از شستشوی آنها با مایع فولیکولی فیلتر شده: بر خلاف نتایج آزمایشات in vitro شستشوی شاخ‌های رحم موش در محیط in vivo برای کوتاه مدت تأثیر چشمگیری بر روی ساختمان بافتی رحم در مقایسه با گروه کنترل نداشت و به ندرت صدمات بافتی و آسیبهای ناچیزی در بعضی از قسمتها دیده می‌شد که آن نیز می‌تواند به روش اجرا مربوط باشد.

بحث

نتایج حاصل از تأثیر مایع فولیکولی انسان برروی ساختار رحمی موش در محیط خارج از بدن بیانگر آن است که مایع فولیکولی حاوی آنزیمهایی است که قادرند غشاء پایه سلولهای اپی‏تلیال رحم را تخریب نموده و همچنین بر ساختار خارج سلولی نیز تأثیر گذارند. با توجه به این که این تأثیر در صورت غیرفعال نمودن مایع فولیکولی در دمای 56 درجه سانتیگراد از بین می‌رود بیانگر فعالیتهای آنزیمی در مایع فولیکولی می‌باشد. از آنجایی که مایع فولیکولی حاوی آنزیمهای متالوپروتئیناز می‌باشد و با توجه به اینکه EDTA قادر به غیر فعال نمودن این نوع آنزیمها است، احتمال می‌رود که دلامیناسیون (تحلیل اپی‏تلیوم و غشاء پایه) توسط مایع فولکیولی از طریق این گونه متالوپروتئینازها اتفاق می‏افتاد (15).

نتایج تأثیر مایع فولیکولی بر روند بارداری نیز مشابه اثر مایع فولیکولی بر ساختار بافت رحمی می‌باشد و همانطور که نمودار1، نشان می‌دهد مایع فولیکولی حداکثر تأثیر خود را بر روی جلوگیری از بارداری و کاهش لانه‏گزینی بین روزهای سوم و پنجم دارد و بعد از روز پنجم تأثیر منفی مایع فولیکولی بر ادامه روند بارداری کاهش می‌یابد.

جالب توجه است که تأثیر آن حداکثر تا حدود زمان لانه‏گزینی می‌باشد. مقایسه نتایج گروه شاهد و کنترل کاملاً مؤید این مطلب است که نتایج حاصل از مایع فولیکولی به علت روش کار یا آلودگی سلولی و غیره نمی‌باشد. شاید تصور شود که در طی شستشوی شاخ‌های رحمی با مایع فولیکولی قبل از لانه‏گزینی منجر به شسته شدن جنین‌ها شود. در صورتی که چنین توجیهی صحیح باشد همین اشکال نیز باید در شستشوی شاخ‌های رحمی با محیط Ham’s-F10 اتفاق افتاد. ولی همانطور که نمودار 1 نشان می‌دهد شستشوی شاخ‌های رحمی با محیط Ham’s- F10 تأثیر منفی بر روند بارداری نداشت . یکی دیگر از علل احتمالی کاهش درصد بارداری در موشهایی که رحم آنها با مایع فولیکولی شستشو شد تأثیر منفی مایع فولیکولی بر رشد جنین‌های در حال تقسیم می‏باشد ولی این نظریه را می‌توان به دو علت رد نمود: اول آنکه، افزودن EDTA کاملاً تأثیر منفی مایع فولیکولی را خنثی می‌نماید و با توجه به اینکه EDTA یک متصل شونده به کاتیونهای فلزی می‌باشد به تنهایی قادر به حذف تأثیر منفی مایع فولیکولی بر رشد جنین‌ها می‏باشد. در ضمن در مطالعات زمینه‌ای دیده می‌شود که EDTA تأثیر مثبت بر روند رشد جنین‌ها تا مرحله قبل از چهار سلولی دارد و پس از آن تأثیر مثبتی بر روی روند تکامل ندارد و با توجه به انجام شستشوی رحم بعد از روز سوم که جنین‌ها در مرحله 16-8 سلولی می‌باشند، به نظر نمی‌رسد که EDTA نقش مثبت خود را بر روی رشد و تکامل جنین‌ها گذاشته باشد و احتمالاً تأثیر مثبت خود را از طریق دیگری مانند ممانعت از فعالیت متالوپروتئینازها اعمال می‏نماید. از طرف دیگر بسیاری از مطالعات، مایع فولیکولی را بعنوان یک مکمل محیط کشت در روند تکامل جنین‌ها قبل از لانه‏گزینی، مفید گزارش نموده‌اند. البته گزارشات ضد و نقیض در این زمینه نیز وجود دارد (19-18).

بررسی نتایج حاصل از شستشوی شاخ‌های رحم با مایع فولیکولی در روزهای مختلف بیانگر آن است که احتمالاً مایع فولیکولی منجر به تغییراتی می‌شود که از لانه‏گزینی جلوگیری می‌کند. با توجه به این که تأثیرمایع فولیکولی پس از روز پنجم کاهش می‌یابد می‏توان چنین نتیجه گرفت که مایع فولیکولی بر لانه‏گزینی تأثیر منفی دارد(16).

لازم به ذکر است که در طی روند لانه‏گزینی، آندومتر رحم در مرحله پذیرندگی دچار تغییرات مختلفی می‌شود که از آن جمله می‌توان به کاهش بار الکتریکی سطحی، کاهش ضخامت گلیکوکالیکس سلولهای اپی‏تلیال، کوتاه و سپس پهن شدن و ناپدید شدن میکرو ویلهای سطح سلولهای اپی‏تلیوم، ظهور رسپتورهای سطحی خاص نظیر رسپتورهای هپارین سولفات و پروتوگلیکانها، پینوپودها و غیره اشاره نمود (17،4). از آنجایی که مایع فولیکولی حاوی آنزیم‌های مختلفی از جمله پلاسمین و آنزیمهای ماتریکس متالوپروتئیناز و بسیاری از مولکولهای پروتئینی فعال دیگر می‌باشد، این آنزیمها قادر به تجزیه لامینین، الاستینن، فیبرونکتین و کلاژناز نوع (IV) می‏باشند. از آنجایی که بلاستوسیست در حال لانه‏گزینی نیاز به این فاکتورها جهت اتصال و تمایز دارد لذا تجزیه این مواد در زمان نزدیک به لانه‏گزینی می‌تواند مانع تمایز تروفوبلاست و اتصال آن به آندومتر گردد و نتیجه آن ممانعت از باروری و لانه‏گزینی می‌باشد. از آنجایی که EDTA یک ممانعت کننده متالوپروتئیناز می‌باشد احتمال می‌رود که ماده فعال در مایع فولیکولی یک متالوپروتئیناز باشد. بنابراین افزودن آن به مایع فولیکولی از تأثیر منفی مایع فولیکولی بر بارداری می‌کاهد البته نباید نقشهای EDTA را در برداشت و جذب کلسیم و دیگر کاتیونها از یاد برد. در ضمن مطالعات در موش صحرایی نشان داده است که Doxycyclin که ممانعت کننده طیف وسیع متالوپروتئیناز است، بر روی لانه‏گزینی تأثیر معکوس ندارد و فقط تا حدی مانع از روند دسیدوایی شدن می‌شود (20). بنابراین EDTA احتمالاً از طریق ممانعت از فعالیت بیش از حد متالوپروتئیازها تأثیر منفی مایع فولیکولی را خنثی می‌کند.

در اثر مجاور نمودن آندومتر به مدت 20 ساعت با مایع فولیکولی (in vitro) موجب کنده شدن کامل اپی‏ تلیوم می‏گردد( شکل a1)، درصورتیکه شستشوی رحم با مایع فولیکولی (in vivo) تاثیر چشمگیری در ساختمان میکروسکوپی اپی تلیوم رحم ندارد و بنابراین می‏توان چنین استنباط کرد که تاثیر مایع فولیکولی(in vivo) از طریق صدمه یا تخریب ساختار بافتی نمی‏باشد و مکانیسمهای مختلفی برای تاثیر منفی مایع فولیکولی بر روند بارداری را می‏توان ذکر نمود،ولی مکانیسم دقیق عملکرد آن در کاهش درصد بارداری مشخص نبوده و نیاز به بررسیهای بیشتری دارد. در طی لانه‏گزینی که شامل سه مرحله تماس ، چسبندگی و تهاجم می‌باشد

تغییرات خاصی صورت می‌گیرد که محدود به همان محل لانه‏گزینی می‌شود و اگر این تغییرات به صورت وسیع انجام گیرد احتمالاً بر روند بارداری تأثیر معکوس گذاشته و از کل روند لانه‏گزینی جلوگیری می‌نماید. با توجه به اینکه مایع فولیکولی سرشار از آنزیمهای مختلف بوده و بسیاری از آنزیمها برای لانه‌گزینی مفید می‏باشند، ولی تأثیر وسیع آنها در کل سطح آندومتر احتمالاً از لانه‏گزینی جنین ممانعت می‏نماید (21). نتایج کلی بیانگر آن است که مایع فولیکولی می‌تواند بعنوان یک ممانعت کننده در لانه‏گزینی عمل نماید، شستشوی رحم با این مایع می‌تواند به عنوان یک روش جلوگیری از بارداری بصورت مداخله‏گر در لانه‏گزینی، مطرح باشد. این نتایج برای اولین بار در دنیا گزارش می‌گردد و امید است که با پیگیری و تحقیقات بیشتر در جلوگیری از بارداری‌های ناخواسته انسان مورد استفاده قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

این تحقیق طرح تحقیقاتی شماره 76301 دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی اصفهان بوده که با همکاری مرکز باروری و نابارداری اصفهان انجام گردید. بدینوسیله از مسئولین محترم دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی،‌درمانی اصفهان به خصوص همکاران گروههای علوم تشریحی، ایمنی شناسی و کارکنان مرکز بارداری و نابارداری تقدیر و تشکر می‏گردد.

Goldzieher J.W., Nezam M. Oral contraceptive side effects: where is the beef? Contraception.1995; 52: 327-5.
Barken M. B. Oral contraception and congenital malformation in offspring: a review and meta analysis of prospective studies. Obs Gyn. 1990; 76: 552-7.
Hormonal and non-hormonal agents at implantation as targets for contraception. Reprod Fertil Dev.1997; 9: 65-76.
Simon C., Pellicer A., Remohi J. Emerging concepts on human implantation. Hum Reprod. 1999; 14: (2).
Tabibzadeh S., Babaknia A. The signal and molecular pathways involved in implantation, a symbiotic interaction between blastocystis and endometrium involving adhesion and tissue invasion. Hum Reprod.1995; 10(6): 1579-602.
Psychoyos A. Hormonal control of uterine receptivity for nidation. J Reprod Fertil. 1976; 25: 17-28.
Nikas G. Pinopodes as marker of endometrial receptivity. Hum Rerod. 1999; 14 (12).
Senturk L.M., Arici A. Leukemia inhibitory factor in human reproduction. Am J Reprod Immunol. 1998; 39(2): 144-51.
Carson D.D., Tang Y., Gray S. Collagenase support. Embryo attachment and outgrowth in vitro. Dev Biol. 1988; 127:386.
Huang H. Y., Wen Y., Irwin J.C., et al. Cytocine mediated regulation of tissue inhibitors of metalloprotinase –1 (TIMP-1), TIMP-3 and 92 kDa type IV collagenase mRNA expression in.human endometrial stromal cells. J Clin Endocrinol Metab. 1988; 83: 1721-90.
Somon C., Valbuena D., Krussel J. Interleukin-1 receptor antagonist prevents embryonic implantation by a direct effect on the endometrial epithelium. Fertil Steril. 1998; 70: 896-906.
Reich R., Miskin R., Tsafrir A. Follicular plasminogen activator in ovulation. Endocrionl. 1985; 116:516-21.
Zhu C., Woessner J.F. Tissue inhibitor of metalloprotinase and alpha macroglobulins in the ovulating rat ovary: possible regulator of collagen matrix breakdown. Biol Repord. 1991; 45: 334-42.
Reich R. Tsafrir A., Mechanic G.L. The involvement of collagenas in ovulation in rat. Endocrinol. 1985; 116: 522-7.
Ward R.V., Atkinson S.J., Slocombe P.M., et al. The tissue inhibitor of metalloproteinases –2 inhibits the activation of 72Kda progelatinase by fibroblast membrane. Bioch et Biophy Acta. 1991; 1089:242-6.
Edward R.G. Review of implantation, interception and contraception. Hum Repord. 1994; 6:955-95.
Psychoyos A., Nikas G. Uterine pionpodes as marker of uterine receptivity. Assis Repord Rev. 1994; 4:23-6.
Hemmings R., Lachapelle M.H., Falcone T., et al. Effect of follicular fluid supplementation on the in vitro development of human pre-embryos. Fertil Steril. 1994; 62(5): 1018-21.
Chi H.J., Kim D.H., Koo J.J., et al. The suitability and efficiency of human follicular fluid as a protein supplement in human in vitro fertilization programs. Fertil Steril. 1998; 70(5): 871-7
Hung T.T., Millard. M.M. Inhibition of mouse embryo cleavage by factor present in the human preovulatory follicular fluid. J Clin Endocrinol Metab.1985; 61:899-904.
Rechtman M.P., Zhang J., Salamonsen L.A. Effect of inhibition of matrix metalloproteinases on endometrial decidualization and implantation in mated rats. J Repord Fertil. 1999; 117(1): 169-77.
Klentzeris L.D. The role of endometrium in implantation. Hum Repord. 1997; 2: 170-5.