Sterility effects of Neem (Azadirachta indica) extract on male rat

Mahmoudi Meymand, Masoumeh; Morowati, Mohsen; Ghazi Khansari, Mahmoud; Nasrollazadeh, Batool; Minaie, Bagher

Sterility effects of Neem (Azadirachta indica) extract on male rat

Authors

Masoumeh Mahmoudi Meymand ¹

Mohsen Morowati ²

Mahmoud Ghazi Khansari ¹

Batool Nasrollazadeh ³

Bagher Minaie ⁴

¹ Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran

² Department of Pesticide Research, Plant Pests and Diseases Research Institute, Tehran, Iran

³ Department of Embryology, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran

⁴ Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences University, Tehran, Iran

Abstract

Nowadays uses of synthetic pesticides has caused a lot of environmental problems. For this reason there is an effort to replace them with biopesticides. One of these ways is the use of plant bioproducts. Various studies on Azadirachta indica (Neem) have proven that the seed extract of this plant has reversible infertility and spontaneous abortion properties. In this study we are trying to determine the effective dose of its seed extract for sterility of rodent pests. In this survey, 24 male wistar rats with 4-5 months old (weighing about 150-200 grams) were selected randomly. They were divided into 4 subgroups each containing 6 rats. The Neem extract (Neem Azal 1%) was fed to 3 groups by gavage for six days. The first group was fed with water and others were fed with Neem extract (5mg/kg, 15mg/kg and 25mg/kg respectively). Hematological parameters were determined on 4th and 9th day of the experiment. On the 10th day two animals from each group were dissected for histological study of testes. Remaining animals were tested for fertility with fertile female rats. There were no significant differences between control and treated groups. After observing reproduction in female rats, these groups were excluded from study. There were no significant differences between control and treated groups in their hematological parameters except for MCH and hemoglobin on 4th (P < 0.001, P < 0.01 respectively) and 9th day (p < 0.05) and WBC on 9th day (p < 0.05) in third group, which showed an increase. There were no significant differences between serum testosterone levels. In group which received 15 mg/kg extract, reproduction occurred after 60 days (reproduction cycle in rats is 20-23 days). In group which received 25mg/kg extract, half of the animals died due to high doses of Neem extract and in the remaining half, reproduction occurred after 3 months. Histological results of testes indicated abnormality in spermatogenesis and sperms production in some of the semniferous tubules. Therefore after 60-90 days and repair of injured cells, reproduction is observed again. Base on the results of this study it seems that we can use Neem seed extract as an anti-fertility agent, considering its cost benefit ratio and suitable formulation, we can use it as rodent baits to control harmful agricultural rodents. In this way we have a new method of controlling deleterious rodents.

Keywords

anti

Fertility

Neem (Azadirachta indica)

pesticide

Rat

spermatogenesis

Spermatozoa

مقدمه

همواره جوندگان بعنوان آفات کشاورزی مطرح می‏باشند. مطالعات زیادی برای یافتن راه‏های مناسب کنترل آنها صورت گرفته است. در اغلب موارد برای کنترل آنها از مواد سنتزی و شیمیایی استفاده می‏شود، اما طی نیم قرن گذشته استفاده از آفت‏کشهای سنتزی اغلب بدون دقت و بی‏رویه بوده که منجر به مسائل و مشکلات زیست محیطی زیادی از جمله: آلودگی مواد غذایی، خاک، آبهای سطحی و زیرزمینی، آلودگی هوا و... شده است. به این مشکلات میتوان باقیمانده سموم، عوارض سوء بر حشرات و سایر موجودات زنده غیرهدف، افزایش تعداد آفات مقاوم به آفت‏کشها و طغیان مجدد آفات را نیز افزود(1).

امروزه در تمام کشورها آگاهی افراد نسبت به مسائل زیست محیطی و اثرات جانبی مرتبط با استفاده از آفت‏کشهای سنتزی رو به افزایش است، لذا سعی بر این است تا با جایگزین کردن آفت‏کشهای بیولوژیک و طبیعی به جای انواع سنتزی، گامی در جهت حفظ محیط زیست و سلامت انسان برداشته شود. از جمله این موارد استفاده از فرآورده‏های گیاهی است که برای حفاظت گیاهان در مقابل آفات و بیماریها مورد استفاده قرار می‏گیرند. یکی از خانواده‏های گیاهی که دارای ویژگیهای متعدد و از جمله اثر بر آفات و حشرات است خانواده ملیاسه (شال سنجد) می‏باشد. یکی از گونه‏های این خانواده بنام چریش گیاه بومی شبه قاره هند با ویژگیهای دارویی بسیار زیاد بوده که از قرنها پیش در طب سنتی مردم این سرزمین مورد استفاده بوده است. در حال حاضر به علت موارد کاربرد متعدد آن در تمام مناطق دنیا بعنوان یک درخت اعجاب انگیز مورد قبول واقع شده است(2). ترکیبات مختلف گیاه چریش سالها است که مورد شناسائی قرار گرفته است. این ترکیبات دارای خواص ضد ویروسی، ضدباکتریایی، ضد قارچی، ضدالتهاب و ضدتب می‏باشند(5-3). پلی‏ساکاریدهای حاصل از عصاره آبی پوست ساقه درخت دارای خواص ضد توموری بوده و باعث القای اینترفرون می‏گردد(6). در ارتباط با تولید مثل، اثرات ضد باروری روغن چریش ابتدا توسطLal و همکارانش گزارش شد (7). عصاره مغز دانه چریش اثرات ضد باروری و سقط جنینی موقت و قابل بازگشتی دارد که مطالعات متعدد روی حیوانات آزمایشگاهی آنرا به اثبات رسانده است و در حال حاضر نیز در کشور هندوستان از عصاره آن جهت ساخت قرص‏های ضدباروری برای انسان استفاده می‏شود(8). لذا با توجه به ویژگی‏های این گیاه، در این تحقیق سعی شده است تا ضمن مطالعه خاصیت ضدباروری دائم عصاره چریش روی موش صحرایی، میزان دوز مؤثر آن جهت عقیم سازی دائم جوندگان بررسی شود.

مواد و روشها

برای انجام این مطالعه 24 موش صحرائی نژاد Wistarبا سن 5-4 ماه و وزن 200-150 گرم از بصورت تصادفی انتخاب و به 4 گروه 6 عددی تقسیم شدند. یک گروه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد که فقط آب دریافت کردند و سه گروه دیگر، گروههای اول، دوم و سوم آزمایش به ترتیب دوزهای mg/kg5

(ml1/0)، mg/kg15 (ml3/0) وmg/kg25(ml5/0) عصاره گیاه چریش (عصاره تجاری Neemazal بامقدار آزادیراکتین 1%) دریافت نمودند. تجویز عصاره و آب به این گروهها با استفاده از سوزن مخصوص گاواژ موش صحرایی انجام شد. از نظر حجمی، تمام حیوانات حجم مساوی مایع دریافت کردند. به این ترتیب که گروه شاهد: ml5/0 آب، گروه اول: آب ml4/0 همراه با عصاره ml1/0، گروه دوم: آب ml2/0 همراه با عصاره ml3/0 و گروه سوم: ml5/0عصاره دریافت کردند. گاواژ کردن حیوانات به مدت 6 روز متوالی انجام شد. در روز چهارم آزمایش، از حیوانات تمام گروهها خونگیری شد. آزمایشات هماتولوژی و اندازه‏گیری ترکیبات سرم بر روی این خون انجام گرفت. به منظور انجام آزمایشات هماتولوژی (CBC) ، خون در ویالهای محتوی یک قطرهEDTA 2% جمع آوری شد و سپس با استفاده از دستگاه Cell Counter (دستگاه MS9 که ساخت کشور فرانسه V.Cedex، Version 3.5XXE) فاکتورهای هماتولوژیکی شامل: تعداد گلبولهای سفید (WBC) ، تعداد گلبولهای قرمز (RBC) ، هموگلوبین (Hb) ، حجم متوسط گلبول قرمز (MCV) ، مقدار متوسط هموگلوبین سلولی (MCH) ، مقدار متوسط غلظت هموگلوبین سلولی (MCHC) ، هماتوکریت و لنفوسیت مورد بررسی قرار گرفت. بخش دیگری از خون برای تهیه سرم در ویالهای بدون EDTA جمع‏آوری گردید. سرم حاصل در دمای c20- نگهداری و در پایان آزمایشات و جمع‏آوری تمام نمونه‏ها با استفاده از کیت تستوسترون(DRG Diagnostics, Germany) و دستگاه الایزا مقدار هورمون سنجش شد.

اندازه‏گیری تستوسترون: l25 از نمونه، کنترل و استاندارد با l 200 -کونژوگه آنزیمی به مدت 10 ثانیه مخلوط شد و در دمای اتاق برای مدت یک ساعت روی روتاتور انکوبه گردید. چاهک‏ها با استفاده از l400 محلول شستشوی رقیق سه بار شستشو گردید.

l200 محلول سوبسترا به آن اضافه شد و پس از 15 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق واکنش آنزیمی با افزودن l100 محلول اسیدی متوقف گردید. در نهایت جذب نمونه‏ها توسط دستگاه الایزا در طول موج

nm450 قرائت گردیده و با استفاده از منحنی استاندارد غلظت نمونه‏های مجهول تعیین گردید.

در روز نهم (دو روز پس از پایان گاواژ) مجدداً خونگیری از تمام حیوانات صورت گرفته، آزمایشات مذکور انجام شد.

در روز دهم آزمایش، دو حیوان از هر یک از گروههای فوق تشریح شده و بیضه‏های آنها برای انجام بررسیهای بافت‏شناسی جدا گردید. در روز پانزدهم، به منظور بررسی مدت زمان تأثیر دوزهای مختلف عصاره، حیوانات باقیمانده گروههای فوق برای تست باروری در کنار حیوانات ماده فعال قرار گرفتند تا زمان عدم تکثیر آنها حیوانات نگهداری و پس از تکثیر از دور آزمایش خارج شدند. در حین آزمایش، حیوانات در روزهای اول، سوم، پنجم، هشتم و دهم آزمایش وزن شدند.

بررسیهای بافت شناسی: پس از تشریح حیوانات، بیضه جداسازی شده و بافت به مدت 10-7 روز در فرمالین قرار گرفت تا کاملاً فیکس شود. فیکس کردن بافت به منظور جلوگیری از تغییرات بعدی (اتولیز) ضروری است. مرحله آماده‏سازی که عبارت است از: آبگیری با استفاده از اتانول، شفاف‏سازی توسط زایلین ، نفوذ و آغشتگی. بافت پس از شفاف‏سازی، به حمام پارافین منتقل می‏شود. در این مرحله زایلین از بافت خارج شده و پارافین جایگزین آن می‏شود. پس از سردشدن پارافین، بافت به مقاطعی با ضخامت 7-6برش داده شد. رنگ‏آمیزی مقاطع با استفاده از رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت گرفت. لام‏ها پس از آماده‏شدن مورد بررسیهای بافت‏شناسی قرار گرفت. برای محاسبه میانگین و انحراف معیار داده‏های مربوط به گروههای آزمایشی از نرم‏افزار آماری SPSS و آنالیز واریانس دو طرفه استفاده شد. در صورتیکه آزمون فوق بین گروهها تفاوت نشان می‏داد، تجزیه و تحلیل بعدی با استفاده از آزمون Newman-Kevles انجام شد. 05/0P< به عنوان اختلاف معنی‏دار در نظر گرفته شد.

نتایج

الف:تأثیر عصاه گیاه چریش بر فاکتورهای هماتولوژیکی:

تجزیه و تحلیل آماری داده‏های آزمایش بیانگر این است که در روز چهارم آزمایش (مرحله اول خونگیری) مقادیر هموگلوبین و MCH در گروه سوم نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری نشان می‏دهد (05/0P<) در حالیکه مقادیر سایر فاکتورها در گروه‏های آزمایشی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏داری نشان نمی‏دهد(جدول1).

بررسی فاکتورهای هماتولوژیک در روز نهم آزمایش (مرحله دوم خونگیری) نشان‏دهنده افزایش معنی‏دار هموگلوبین، MCH وWBC در گروه سوم نسبت به گروه کنترل است (به ترتیب 01/0 P<، 001/0 P<و

05/0.(P< مقادیر سایر فاکتورها در گروه‏های آزمایشی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏داری نشان نمی‏دهد (جدول2). بررسی اختلاف میانگین مقادیر فاکتورهای هماتولوژیک در مراحل اول و دوم خونگیری نشان‏دهنده این است که مقدار MCH در گروه اول و درصد لنفوسیت در گروه کنترل و گروه دوم اختلاف معنی‏داری نشان می‏دهد (05/0P<) (جدول3).

ب-تأثیر عصاره گیاه چریش بر مقدار هورمون تستوسترون: بر اساس مقایسه مقادیر حاصل از اندازه‏گیری مقدار هورمون تستوسترون در گروههای مختلف آزمایش در هیچ یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد(جدول4).

ج-اثر عصاره گیاه چریش بر وزن: بررسی تغییرات وزنی حیوانات بیانگر این است که در طی مدت آزمایش، میانگین وزنی هیچ یک از گروه‏های آزمایشی نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏داری نشان نمی‏دهد(جدول5).

د-اثر عصاره گیاه چریش بر بافت بیضه: نتیجه مطالعات بافت‏شناسی بیانگر کاهش رده‏های مختلف سلولهای اسپرم‏ساز و پرخونی در بافت‏ بینابینی در برخی از مجاری اسپرم‏ساز است که نشان‏دهنده آماس در بافت بینابینی می‏باشد (اشکال 2و3). هم‏چنین در برخی مجاری، اسپرماتوزوئیدها در مرکز مجاری اسپرم‏ساز دچار نکروز گردیده‏اند(شکل4). گسست لایة اولیه سلولهای مسئول اسپرماتوژنر از جدار لولـه‏ها، تورم و تغییر شکل سلولها که بیانگر مرگ سلولی است در برخی مجاری دیده می‏شود (شکل 2). شکل 1، مقطعی از دیواره‏های مجاری اسپرم‏ساز بیضه گروه کنترل را نشان می‏دهد که در آن رده‏های مختلف اسپرماتید بصورت خوشه‏ای و اسپرماتوزوئیدها که سر آنها به سمت محیط و دم آنها به سمت مرکز مشاهده می‏گردد.

مدت زمان تغییر در قدرت باروری و وقفه در تولید مثل این حیوانات در گروه‏های اول، دوم و سوم آزمایشی به ترتیب 60،50 و 90 روز بود در حالیکه در گروه کنترل پس از 23 روز (دوره بارداری موش‏های صحرایی) تکثیر دیده شد.

بحث

در این مطالعه اثر عصاره گیاه چریش بر فاکتورهای هماتولوژیک، هورمون تستوسترون مورد بررسی قرار گرفت. در حیواناتی که به مدت 6 روز تحت تیمار با عصاره گیاه چریش بودند، دو مرحله خونگیری در روزهای چهارم و نهم آزمایش انجام و فاکتورهای هماتولوژیک سنجش شد. هموگلوبین و MCH گروه سوم در هر دو مرحله و WBC گروه سوم در مرحله دوم نسبت به گروه کنترل اختلاف معنی‏داری نشان دادند(جداول3-1). در مطالعه انجام شده توسط Parshad و همکاران تجویز دوزهای 1/0%،4/0% و 6/1% عصاره آبی چریش به موشهای صحرایی نر به مدت 10 هفته باعث افزایش معنی‏دار مقادیر RBC، PCV ، Hb، MCHC گروههای آزمایشی نسبت به گروه کنترل شد که این افزایش می‏تواند دلیلی بر وجود برخی ترکیبات فعال در عصاره آبی چریش باشد که تولید سلولهای خونی را تحریک می‏کند(9). از طرفی طبق گزارش Talwar و همکارانش در سال 1997 تیمار موشهای صحرایی و میمونهای آزمایشگاهی با عصاره تخلیص شده گیاه چریش تغییر چندانی در فاکتورهای هماتولوژیکی ایجاد نکرد(10). تجویز خوراکی عصاره چریش به موشهای صحرایی نر و ماده به مدت 90 روز هیچ تغییری در مقدار هموگلوبین، RBC، WBC، لوکوسیت‏ها، مونوسیت‏ها و ائوزینوفیل‏ها ایجاد نکرد

(11). در مطالعه حاضر مقدار هورمون تستوسترون طی دو مرحله خون‏گیری نیز اختلاف معنی‏داری را نشان نداد(جدول4). در مطالعه Parshad مقدار هورمون تستوسترون با افزایش دوز عصاره کاهش معنی‏داری نشان داد (01/0P<) که این کاهش را دلیل احتمالی کاهش وزن نسبی سمینال وزیکول‏ها عنوان کرده

است(9). اما مطالعهKrause هیچ اختلاف معنی‏داری را در مقدار هورمون تستوسترون و وزن سمینال وزیکول‏های حیوانات مورد آزمایش نشان نداد(12). اختلاف در نتایج حاصل از آزمایشات مختلف ممکن است ناشی از تفاوت در روش انجام آزمایش از قبیل نوع و دوز عصاره مصرفی، نحوه تجویز عصاره، تکنیک‏های استخراج، طول دوره درمان و گونه حیوانات مورد آزمایش باشد. بررسی‏های بافت شناسی مقاطع تهیه شده از بیضه حیوانات نشان داد عصاره بر مراحل مختلف اسپرماتوژنز در لولـه‏های اسپرم‏ساز تأثیر گذاشته و سیر طبیعی اسپرماتوژنز را تغییر می‏دهد. این اختلالات به چندین حالت دیده می‏شود: گسست لایه اولیه سلولهای اسپرماتوگونی از جدار لوله‏ها، تورم و تغییر شکل این سلولها و اسپرماتوسیت‏ها که بیانگر مرگ سلولی است(شکل3)، اختلال در تولید اسپرماتیدها، از بین رفتن اسپرماتوزوئیدها در مرکز مجاری اسپرم‏ساز(شکل4) و کاهش رده‎های مختلف سلولهای اسپرم‏ساز(اشکال2و3). تغییرات فوق در برخی توبولها دیده می‏شود و در کنار آنها توبولهایی که مراحل اسپرماتوژنز را به طور طبیعی طی می‏کنند نیز وجود دارند. اما از آنجائیکه برای بارور بودن حیوانات نر وجود تعداد معینی اسپرم ضروری است لذا اختلالات ایجاد شده، سبب میشود میزان اسپرم لازم جهت باروری تخمک و تشکیل جنین کاهش پیدا کرده و تکثیر در گروه‏های آزمایشی نسبت به گروه کنترل با تأخیر همراه باشد. با افزایش دوز عصاره تعداد مجاری که این اختلالات در آنها دیده می‏شود بیشتر شده، مدت زمان وقفه در تولیدمثل حیوانات نیز افزایش خواهد یافت. با گذشت زمان و از بین‏ رفتن تأثیر عصاره، سلولهای آسیب دیده ترمیم یافته و حیوانات قدرت باروری خود را به دست می‏آورند.

طبق بررسیهای انجام شده، عصاره خالص گیاه چریش دارای خاصیت اسپرم کشی قوی بوده، روغن چریش نیز دارای اثرات اسپرم کشی بوده و مانع از لانه‏گزینی می‏گردد(15-13). مطالعه اثر عصاره برگهای چریش بر بیضه موشهای صحرایی آلبینو توسط Shaikh، بیانگر ایجاد ضایعه درسلولهای لیدیگ و نیز کاهش تعداد و تحرک اسپرم و افزایش اسپرم‏های غیرطبیعی بود. در مطالعه Shaikh ایجاد تغییراتی از قبیل کاهش وزن، ارتفاع سلولهای اپی‏تلیال، قطر هسته اپی‏تلیال وزیکول سمینال و بخش ونترال پروستات در اثر تیمار با عصاره برگ چریش شاهدی غیرمستقیم بر عملکرد آنتی آندروژنی عصاره چریش عنوان می‏شود (16). در مطالعه‏ای دیگر تجویز خوراکی یک عصاره اتانولی خام بـرگهای چریـش بـه موش‏های نر بالغ به مـدت 6 هفـته باعث افزایش وقوع تغییرات ساختاری و اختلال سیناپتیک در کروموزوم‏های میوزی شده و ضایعات میوزی بیشتری را هم موجب می‏شود. عصاره باعث کاهش تعداد اسپرم و افزایش تعداد اسپرم‏های غیرطبیعی شد بنابراین احتمال می‏رود که حداقل یکی از اجزای موجود در عصاره گیاه چریش ممکن است با DNA تداخل کرده که نتیجه آن اختلال در تنظیم ژنهای مسئول مرفولوژی اسپرم است(17). با توجه به اینکه در مطالعه فعلی عصاره چریش تاثیر چندانی بر فاکتورهای هماتولوژیک نداشت و مقدار هورمون تستوسترون و وزن حیوانات هم تحت تأثیر عصاره قرار نگرفت و از طرفی عصاره باعث ایجاد کاهش قدرت باروری و وقفه در تولیدمثل حیوانات مورد آزمایش شد چنین به نظر می‏رسد که عصاره این گیاه علاوه بر اثرات ضدباروری خود در میزان فاکتورهای فوق‏الذکر تغییری ایجاد نمی‏کند، بنابراین عصاره گیاه چریش (Neemazal) ماده‏ای ایمن بوده و بدون اینکه عارضه جانبی در اثر مصرف آن ایجاد شود میتوان آنرا برای کنترل باروری در انسان و حیوان مورد استفاده قرار داد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از آقای دکتر تقی‏زاده و سرکار خانم ورداسبی که در اجرای این تحقیق ما را یاری نمودند، تشکر و قدردانی می‏گردد.

Singleton G.R., Hinds L.A., Herwig L., et al.Ecologically-based management of rodent pests. Australian Centre for International Agricultural Reaserch, Canberra. 1999.
Randhawa N.S., Parmar B.S. Neem. Research and Development, Society of Pesticide Science, India. New Dehli Agricultural Research Institue. 1993; pp 283.
Gogati S.S., Marathe A.D. Anti –viral effect of neem leaf (Azadirachta indica) extracts on chinkungunya and measles viruses. J Res Edu Indian Med. 1989; 8: 1-5.
Singh N., Sastry M.S. Anti-microbial activity of neem oil. Indian J Pharmacol. 1981; 13:102.
Kher A., Chaurasia S.C. Anti-fungal activity of essential oils of three medicinals plants. Indian Drug. 1997; 15:41- 2.
Fujiwara T., Takeda T., Ogihara Y., et al. Studies on the structure of polysaccharides from bark of Melia Azadirachta. Chem Pharm Bull. 1982; 30: 4025- 30.
Lal R., Sankarnaryanan A., Mathur V.S., et al. Antifertility effect of neem oil in female albino rats by intra vaginal and oral routes. Indian J Med Res. 1986; 83: 89- 92.
Mukherjee S., Garge S., Talwar G.P. Early post implantation contraceptive effects of a purified fraction of neem (Azadirachta indica) seeds, given orally in rats: possible mechanisms involved. Ethnopharmacol. 1999; 67: 287- 96.
Parshad O., Singh P., Gardner M., et al. Effect of aqueous neem (Azadirachta indica) extract on testosterone and other blood constituents in male rats. Med J. 1994; 43: 71- 4.
Talwar G.P., Shah S., Mukherjee S., et al. Induced termination f pregnancy by purified extracts of Azadirachta indica (neem): mechanisms involved. Am J Reprod Immunol. 1997; 37: 485- 91.
Raizada R.B., Srivastava M.K., Kaushal R.A., et al. Azadirachtin, a neem biopesticide: subchronic toxicity assessment in rats. Food Chem Toxicol. 2001; 39: 477- 83.
Krause W., Adami M. Extracts of neem (Azadirachta indica) seed kernels do not inhibit spermatogenesis in the rat. In: Proc 2nd Intl Neem Conf Rauischholzhausen Fed Rep Germany. 1983; 483- 789.
Garge S., Doncel G., Chabra S., et al. Synergistic spermicidal activity of neem seed extract, reetha saponins and quinine hydrochloride. Contraception. 1994; 50: 185- 90. 14-Sander F.V., Cramer S. D. A practical method of testing the spermicidal action of chemical contraceptives. Hum Fertil. 1941; 6: 134.
Sander F.V., Cramer S. D. A practical method of testing the spermicidal action of chemical contraceptives. Hum Fertil. 1941; 6: 134.
Sinha K.C., Riar S.S., Tiwary R.S., et al. Neem oil as a vaginal contraceptive. Indian J Med Res. 1984; 79:131- 6.
Shaikh P.D. Studies on the antifertility effect of Azadirachta indica leaves on the testis of albino rats. M Phil Dissertation. Karnataka University, Dharwad, India. 1990.
Awasthy K.S. Genotoxity of a crude leaf extract of neem in male germ cells of mice. Cytobios. 2001; 106: 151- 64.