مقدمه

در خلال چند دهه گذشته کیفیت مایع اسپرمی و قدرت باروری در جوامع بشری به طور چشم‏گیری کاهش یافته است. این امر نشانگر آن است که کیفیت مذکور دستخوش تغییراتی شده که ریشه در عوامل سمی موجود در محیط زیست انسان‏ها داشته که مواردی همچون مسمومیت با انواع آفت‏کشها، سرب و نیز قرارگیری در معرض تشعشعات از آن جمله می‏باشد. از این میان توجه ویژه‏ای به اجزاء موجود در دود سیگار شده و توجه هر چه بیشتر بر تأثیر این مواد بر بلوغ سلولهای زاینده دستگاه تولید مثلی بوده است(1).

نیکوتین(C10 H14N2) به عنوان یک الکالوئید بسیار فرار از اجزاء مهم دود سیگار بوده و قادر به تقلید بسیاری از اثرات زیان‏آور آن در بدن است(2). مقدار نیکوتین موجود در گیاه تنباکو از 8/0-5/0% متغیر بوده و یک نخ سیگار حاوی 24-2% نیکوتین می‏باشد(2).

در سالهای اخیر نیکوتین به صورت کیسه‏های زیرجلدی و نیز آدامس‏های نیکوتین‏دار در ترک اعتیاد به سیگار، کاربرد گسترده‏ای پیدا کرده است. مقدار جذب نیکوتین از طریق دود سیگار وابسته به pH دود سیگار مصرفی بوده، به طوری که در سیگارهای اروپایی با pH در حدود 5/5 به علت یونیزه‏شدن نیکوتین در این شرایط، از مقدار جذب آن در دستگاه تنفسی بسیار کاسته می‏شود(3). نیکوتین به راحتی از غشاء سلولهای بدن عبور کرده و قابلیت واکنش با برخی از اجزاء درون سلولی نظیر پروتئین توبولین در سیتوپلاسم سلولهای در حال تقسیم نظیر سلولهای زاینده جنسی را دارا بوده و بدین ترتیب موجب اختلال در تقسیم سلول خواهد گردید(4-3). نیکوتین در اثر فعالیت آنزیم سیتوکروم P450 کبدی متابولیزه شده و به کوتینین تبدیل شده که از طریق ادرار دفع می‏گردد. بر اساس تحقیقی تیمار نیکوتینی موجب اختلال در فرایند اسپرماتوژنز، آتروفی و تحلیل بیضه‏ها در موش‏های آزمایشگاهی می‏گردد(5).

همچنین در انسان، استفاده از آگونیست‏های نیکوتین با اثر بر روی گیرنده‏های استیل کولین موجب کاهش تولید آندروژن‏ها می‏شود(6). در حیوانات ماده نیز تأثیر مستقیم و سمی نیکوتین بر دستگاه تولید مثلی موجب کاهش تولید استرادیول و مهار تخمک‏گذاری شده است

(7). Copeدر سال 1998، نشان داد که نیکوتین با تأثیر مستقیم بر گلبولهای سفید موجود در مایع اسپرمی، سبب تولید و آزادسازی انواع رادیکالهای فعال اکسیژن یا ROS شده که در نهایت باعث کاهش شدید در تحرک اسپرم‏ها می‏گردد(8).

تمامی موجودات زنده جهت بقاء خود نیازمند به اکسیژن هستند. عمده متابولیت‏های فعال اکسیژن(ROS) شامل O2-، OHo و H2O2 بوده که قادر به حمله به بیومولکولها و تغییرات زیان‏آور در ساختار سلولی‏ می‏باشند. ROS از جمله عوامل مهم در بروز ناباروری در مردان بوده و از دو منبع متفاوت در مایع اسپرمی تولید می‏گردد، شامل یکی سلولهای اسپرم آسیب دیده و دیگری گلبولهای سفید فعال شده می‏باشد. تولید ROS در سلولهای اسپرم سالم و فعال به عنوان یک فرایند فیزیولوژیک شناخته شده که موجب بروز واکنش اکروزومی در اسپرم می‏شود. این تأثیر مثبت ROS منوط به وجود آنتی‏اکسیدان‏ها یا حذف‏کننده‏های مازاد ROS در محیط عمل اسپرم است. در اسپرم هرگونه عدم تعادل بین تولید و حذف ROS، موجب بروز فرآیند استرس اکسیدتیو در سلول می‏گردد. ROS با اختلال در مورفولوژی، ساختار DNA، منجر به کاهش تحرک اسپرم و در نهایت عدم اتصال اسپرم به سطح تخمک می‏گردد(9).

وظیفه آنتی‏اکسیدان‏ها جمع‏آوری، خنثی‏سازی و یا حذف رادیکالهای آزاد موجود در درون اسپرم و نیز محیط خارج از آن یعنی پلاسمای سمینال است. دو نوع سیستم آنتی‏آکسیدانی مهم در این رابطه شامل: آنتی‏اکسیدان‏های آنزیمی نظیر کاتالاز ، گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) و گلوتاتیون S- ترانسفراز(GST) و آنتی‏اکسیدان‏های غیر آنزیمی (شامل دو گروه محلول در آب و محلول در چربی) نظیر: آلبومین، اسکوربات، گروههای سولفیدریل و ویتامینE می‏باشد. اسپرم به علت دارا بودن مقادیر کمی از آنتی‏اکسیدان‏ها در سیتوپلاسم خود (کاهش سیتوپلاسم در طی روند اسپرماتوژنز)، بسیار وابسته به سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی موجود در پلاسمای مایع سمینال بوده و چنانچه در طی شستشو این بخش از مایع اسپرمی از اسپرمها جدا گردد، اسپرمها بسیار مستعد اکسیداسیون لیپیدهای غشایی (LPO) و تغییر در ساختار غشاء سلولها خواهند شد. از جمله پیامدهای آسیب‏رسان LPO در سلول تخریب غشاء، غیر فعال‏شدن آنزیمهای متصل به غشاء نظیر ATPases، غیرفعال‏شدن آنزیم‏های سیتوپلاسمی مانند گلوکز 6- فسفاتاز و سیتوکروم اکسیداز (با سازوکار مسدودسازی گروه‏های آمینی و سولفیدریلی این پروتئین‏ها)، می‏باشند. سیالیت و انعطاف‏پذیری بالای غشاء اسپرم ناشی از وجود مقادیر بالایی از اسیدهای چرب اشباع نشده در آن بوده که بسیار مستعد LPO می‏باشند و در پی آن سیالیت غشاء و قدرت اتصال به تخمک و باروری آن کاهش می‏یابد

(10-9). وجود مقادیر زیاد ROS در مایع اسپرمی مردان افراد سیگاری، شانس باروری آنها را به میزان 7 برابر نسبت به مردان با مقادیر طبیعی ROS کاهش می‏دهد. این قبیل مردان نسبت به مردان طبیعی از ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کمتری در پلاسمای سمینال، برخوردار هستند(11).

با توجه به مطالب فوق و نقش نیکوتین در ایجاد ROS و اختلال در دستگاههای مختلف بدن و با توجه به تحقیقات گسترده در جهت بررسی اثرات نیکوتین به عنوان یک جزء مهم دود سیگار بر ساختار سلولی اسپرم در شرایط in vitro و نیز عدم بررسی نقش حضور آنتی‏اکسیدان‏ها در مدل انسانی، لذا بر آن شدیم تا اثرات نیکوتین در آسیب بر عملکردهای اسپرم و نقش آنتی‏اکسیدانها در تعدیل این اثرات در محیط in vitro مورد بررسی قرار دهیم.

مواد و روشها

تعداد 8 نمونه مایع اسپرمی از افراد داوطلب غیرسیگاری و سالم اخذ گردید. این مردان در محدودة سنی 25-20 سال قرار داشته و از نظر قدرت باروری وضعیت مطلوب و مثبتی (از حیث تعداد سلول‏های اسپرم، قدرت تحرک و سایر ویژگیها) معیارهای سازمان بهداشت جهانی (WHO) را دارا بودند. نمونه‏های مایع اسپرمی مذکور پس از جمع‏آوری و مایع‏شدن در شرایط دمای اتاق به آرامی با یکدیگر مخلوط گردیده و در نهایت به سه بخش مساوی تقسیم شدند. ابتدا نمونه‏های سمینال از اسپرمها به مدت 10 دقیقه (با دور g×300) سانتریفوژ شده تا پلاسمای سمینال از اسپرمها جدا گردد، آنگاه رسوب اسپرمی حاصله با محلول 2/0 مولار از بافر فسفاته سالین‏دار (PBS) با 2/7=pH به روش قبل سانتریفوژ و مورد شستشو قرار گرفتند. پس از شستشو به میزان 1/0میلی‏لیتر از رسوب سلولی حاصله در حداقل مقدار حلال (سوسپانسیون سلولی) به لولـه‏های آزمایش در این پژوهش افزوده گردید (لازم به ذکر است که هر یک از سه بخش نمونه‏های مایع اسپرمی در بالا، خود به عنوان یک نمونه مستقل در نظر گرفته شده‏اند). در این تحقیق از دو غلظت 5/0 و 1 میلی‏مولار نیکوتین استفاده شد که درست معادل با غلظت بافتی این ماده در بیضه افراد سیگاری شدید (با مصرف بیش از 20 نخ سیگار در روز) است(12). نیکوتین مایع از شرکت Sigma آمریکا خریداری شده بود و به صورت محلول پایه 100 میلی‏مولار درPBS (2/7=pH) حل شده و از آن دو غلظت مورد نظر تهیه گردید. در تیمارها، حجم 1/0 میلی‏لیتر از نیکوتین به هر لولـه اضافه گردید. در گروه شاهد یا کنترل به جای نیکوتین از محلول PBS هم حجم آن استفاده شد. در تمامی آزمایشات این پژوهش زمان انکوباسیون 30 دقیقه و دمای آن 37 درجه سانتیگراد بود. مواد آنتی‏اکسیدان نیز در حلال PBS وارد شده و غلظت‏های نهایی 1 میلی‏مولار از ویتامین C (اسکوربات)، 5 میلی‏مولار از گلوتاتیون (GSH) و 02/0 میلی‏مولار از ترولوکس مورد استفاده قرار گرفت. این غلظت‏های خاص از آنتی‏اکسیدان‏ها، طی یک سری آزمایشات جداگانه و با استفاده از یک طیف غلظتی از هر یک از این مواد در راستای مقابله با پراکسیداسیون سلولی در نمونه‏های اسپرمی بدون هیچ نوع تیمار (گروه شاهد با پراکسیداسیون ذاتی و خودبخودی در غشاء اسپرم) مورد انتخاب قرار گرفتند (نتایج نشان داده نشده است).

آزمایش LPO بر طبق روش Buege و همکاران به انجام رسید(13). در این روش از قدرت واکنش‏دهندگی TBA با MDA (به عنوان محصول نهایی عمده در انتهای روند LPO) استفاده شد. در نهایت یک ترکیب زرد رنگ از TBA+MDA در لولـه‏های آزمایش محتوی تیمار نیکوتینی حاصل گردید که به روش طیف سنجی نوری قابل اندازه‏گیری بود. مجموعه محصولات نهایی روند LPO موسوم به اجسام واکنش‏دهنده با TBA یا TBARS بوده که MDA به عنوان عمده‏ترین این محصولات است. سنجش نسبت گلوتاتیون احیاء شده

(GSH) به گلوتاتیون اکسیده

(GSSG) با اندازه‏گیری هر یک از این دو فرم گلوتاتیون در محیط‏های حاوی تیمار نیکوتینی به روش Sedlak و همکاران انجام گرفت(14). در این روش از واکنش ماده DTNB با گروههای سولفیدریل مولکولهای گلوتاتیون محیط عمل استفاده گردید. فعالیت آنزیمی گلوتاتیون S-ترانسفراز(GST) بر طبق روش معروف Habig و همکاران(1974) مورد سنجش قرار گرفت(15). جهت شروع واکنش در این روش از ماده CDNB استفاده گردید.

این سنجش بر روی اسپرمهای لیزشده انجام گرفت که در طی مراحل مختلف سانتریفوژ، در نهایت بخشی از اجزاء سیتوپلاسمی موسوم به PMS جدا و جهت سنجش فعالیت GST مورد استفاده قرار گرفت. PMS در واقع بخشی از فراکسیون‏های سلولی در محدودة میتوکندری‏ها که غنی از GST بوده و بیشترین فعالیت این آنزیم را دارا می‏باشند، برای حصول آن ابتدا سلولهای اسپرم لیز گردیده تا یک بخش هموژن تولید گردد و سپس این بخش ابتدا با دور rpm1000 و سپس rpm10000 (هر نوبت به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد) سانتریفوژ گردیده و مایع روئی معادل با PMS خواهد بود.

به منظور بررسی وقوع شکست‏های احتمالی در ساختار DNA سلولهای اسپرم در تیمار با نیکوتین، از روش سنجش ستاره دنباله‏دار با ژل الکتروفورز برای سلولهای واحد با رنگ‏آمیزی توسط اکریدین نارنجی استفاده گردید(16).

در این روش در صورت وقوع شکست در ساختار DNA، شبکه کروماتین هسته سلول اسپرم در محیط الکتروفورز، ضمن حرکت، تغییر شکل یافته و به حالت یک ستاره دنباله‏دار (واجد سر و دم) خود را نشان می‎دهد.

هر قدر مقدار و وسعت شکستگی‏ها بیشتر باشد، طول دم ستاره دنباله‏دار نیز بیشتر خواهد بود. روش آماری مورد استفاده از نوع student t-test بوده و میانگین گروههای مختلف با یکدیگر مقایسه گردیدند.

نتایج

پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء (LPO): در طی آزمایش اکسیداسیون لیپیدهای غشایی یا LPO (جدول 1) مشخص شد که تیمارهای نیکوتینی (به ترتیب 5/0 و1 میلی‏مولار) موجب افزایش سطوح TBARS (در این قسمت مقادیر TBARS مساوی با مقادیر MDA تولید شده در نظر گرفته شده است) به میزان 50/51% و 78% (به ترتیب در سطوح معنی‏دار 01/0P< و001/0P<) در محیط واجد اسپرم نسبت به گروه کنترل گردیدند. افزایش در میزان اکسیداسیون سلولی با افزایش در رنگ زرد تولید شده در جریان آزمایش همراه بود. سطوح افزایش یافته TBARS با افزودن آنتی‏اکسیدان‏ها به محیط عمل دچار کاهش چشمگیری گردید. هنگامی که mM1 ویتامین C به محیط عمل اضافه گردید، کاهش معنی‏داری در سطوح TBARS به میزان 60/37% و 35% نسبت به گروههای تیمار یافته با نیکوتین (01/0P<) پدیدار گردید. کاهش بیشتری در سطوح TBARS به هنگام افزودن ترولوکس (02/0‏میلی‏مولار) به محیط عمل مشاهده گردید که به ترتیب به میزان40/47% و

30/54% (معنی‏دار در سطح 99% یا 01/0P<) برای تیمارهای نیکوتینی بود. آنتی‏اکسیدان سوم یعنی گلوتاتیون (5 میلی‏مولار) نیز موجب کاهش در سطوح TBARS و کاهش روند LPO در محیط عمل به میزان 10/25% و 15% (به ترتیب معنی‏دار در سطوح 01/0P< و 05/0P<) گردید. در یک آزمایش فرعی مربوط به LPO مشخص گردید چنانچه یونهای دو ظرفیتی آهن

(Fe2+) به محیط واجد اسپرم اضافه گردد، موجب افزایش معنی‏داری در میزان TBARS (33/59%) گردیده و هنگامی که آنتی‏اکسیدانها به این محیط افزوده گردند ترولوکس و گلوتاتیون موجب کاهش TBARS شده، اما ویتامین C در طی یک عمل سینرژی با یونهای آهن، موجب افزایش هرچه بیشتر در سطوح TBARS محیط آزمایش (16/89%) نسبت به گروه کنترل گردید (نتایج نشان داده نشده است).

سنجش نسبت گلوتاتیون احیاء شده به اکسیده

(GSH/GSSG): این نسبت دارای رابطه‏ای معکوس با استرس اکسیداسیون سلولی بوده و کاهش آن به منزله افزایش حضور رادیکالهای آزاد در محیط و گسترش روند LPO می‏باشد و بالعکس. در این قسمت نشان داده شده که تیمارهای نیکوتینی (5/0 و 1 میلی‏مولار) باعث کاهش در میزان این نسبت می‏گردد (درصد تغییرات در جدول2 آورده شده است)، اما در مقابل، به کارگیری آنتی‏اکسیدان‏ها یعنی ترولوکس و ویتامین C (از کاربرد گلوتاتیون به علت جلوگیری از بروز اشتباه در اندازه‏گیری GSH در محیط،‌ خودداری شد) موجب افزایش مقدار این نسبت می‏گردد. نکته جالب توجه آن که پس از افزودن ترولوکس به گروه کنترل، موجب حفظ و افزایش مولکولهای گلوتاتیون احیاء (GSSG) گردید(جدول 2).

اندازه‏گیری فعالیت گلوتاتیونS –ترانسفراز

(GST): در این آزمایش افزودن تیمارهای نیکوتینی(5/0و1 میلی‏مولار) فعالیت GST را به عنوان اولین آنزیم تدافعی در مقابله با فرآیند اکسیداسیون سلولی (از مولکولهای GST به عنوان سوبسترا، استفاده می‏نماید) به طور معنی‏داری به میزان 01/34% و 19/57% (به ترتیب 05/0P< و 01/0P<) افزایش می‏دهد. از سوی دیگر افزودن آنتی‏اکسیدانها موجب کاهش در فعالیت این آنزیم می‏گردد. در این بین ترولوکس موجب کاهش معنی‏دار به میزان 71/33% و 07/39% (05/0P<) در تیمارهای نیکوتینی گردید(جدول 3).

تشخیص شکستگی در DNA اسپرمها: در این قسمت جهت تشخیص و تعیین میزان شکستگی در DNA اسپرمها از روش سنجش ستاره دنباله‏دار استفاده گردید و در طی آن معلوم شد که تیمارهای نیکوتینی

(5/0 و 1 میلی‏مولار) موجب آسیب و ایجاد شکستگی در DNA (به ترتیب در 5 و 10%) اسپرمهای مورد بررسی می‏گردد. کاربرد موادآنتی‏اکسیدان نتوانست تغییر معنی‏داری را در شمارش سلولهای آسیب دیده ایجاد نماید. با کمک رنگ‏آمیزی اکریدین نارنجی مشخص گردید که تقریباً تمامی شکستگی‏های موجود در DNA اسپرمها از نوع دو رشته‏ای یا (DSDB) بود. شکل‏1 نشان‏دهنده اسپرمها در تیمار نیکوتینی (یک میلی‏مولار) بوده که در آن نقاط روشن کروی، مجموعه کروماتین هسته سلولهای اسپرم سالم و نقاط روشن کشیده و غیر کروی، مجموعه کروماتین هسته سلولهای اسپرمی است که دچار آسیب و شکستگی شده و به شکل یک ستاره دنباله‏دار دارای سر و دم مشخص گردیده‏اند.

بحث

در بدن موجودات زنده، اکسیژن به عنوان یک تیغ دو لبه عمل می‏نماید. از یک طرف زندگی بدون آن غیرممکن بوده و از طرف دیگر بدن ما به طور مستمر در معرض مسمومیت با آن قرار دارد، مسمومیت از آن جهت که رادیکالهای آزاد مشتق از آن (ROS) خطرآفرین بوده و نظم فیزیولوژیک بدن را مختل می‏سازند. تشخیص استرس اکسیداتیو سلولی در پلاسمای سمینال افراد نابارور، نشان می‏دهد که ROS قادر به ایفاء یک نقش مهم در پاتوفیزیولوژی ناباروری در مردان است(17). مطالعات Kobayashi و همکاران در سال 2001 نشان داد که یک کاهش مستمر در تعداد سلولهای اسپرم زنده و فعال در ارتباط با افزایش مقدار ROS در محیط وجود دارد(18). همان طور که در بخش مقدمه ذکر شد، یکی از بارزترین شواهد صدمات سلولی ناشی از عمل ROS پدیدة LPO بوده و سلولهای اسپرم به دلیل دارا بودن مقادیر زیاد اسیدهای چرب اشباع نشده در ساختار غشایی خود، بسیار مستعد آسیب توسط LPO هستند(9). بارزترین اثر LPO در سلولها، ایجاد اختلال در نظم و کار غشاء سلولها است، بطوریکه روندهای انتقال یون‏ها و مواد گوناگون و نیز شیب‏های غلظتی در دو طرف غشاء همراه با انتقال پیامبرهای شیمیایی به واسطة گیرنده‏های غشایی دستخوش تغییر شده و مختل می‏گردد(19).

در سال 1998 Cope، نشان داد که نیکوتین به عنوان یک ترکیب فعال و مهم در دود سیگار قادر است تا سطوح ROS را در پلاسمای مایع سمینال افزایش داده و بدین ترتیب ناباروری را القاء نماید(8). در این مطالعه مقدار MDA تولید شده پس از گذشت نیم ساعت، (معادل با TBARS) در محیط حاوی اسپرم انسان، به میزان معنی‏دار و وابسته به غلظت، افزایش یافت. MDA به عنوان یکی از عمده‏ترین محصولات نهایی اکسیداسیون اسیدهای چرب اشباع نشده در طی روند LPO در سیستم‏های زیستی، مطرح بوده و حدود 50% کل TBARS را تشکیل می‏دهد و به واسطه واکنش‏دهی زیاد آن با TBA، به راحتی می‏توان، وسعت و گستردگی روند LPO را مشخص نمود. مولکولهای MDA با نفوذ به درون ساختار غشاء سلول موجب عدم تقارن در توزیع اجزاء لیپیدی غشاء شده و علاوه بر این با ایجاد پیوندهای محکم با DNA سلول، موجب بروز صدمات و شکستگی‏هایی در این کروموزوم می‏شود(20-19). وجود رابطه معکوس بین غلظت MDA محیط و میزان چسبندگی اسپرم به سلول تخمک توسط Aitken و همکارانش در سال 1992 به اثبات رسیده است(21). نتایج حاصل از مطالعه اخیر نشانگر قدرت و توانایی نیکوتین در جهت معرفی رادیکال‏های آزاد مشتق از اکسیژن در محیط واجد اسپرمهای انسان است که توسط ترکیب زرد رنگ TBA+MDA قابل اثبات است. همانطوریکه پیش از این ذکر شد، ‌نیکوتین دارای قابلیت عبور از غشاء سلولها بوده، بنابراین قادر است با اجزاء غشاء نیز واکنش متقابل داده و به نوعی باعث تولید و یا رهاسازی ROS در این ساختار گردد.

غشاء اسپرم حاوی آنزیمی موسوم به NADPH –اکسیداز بوده که به هنگام فعالیت بیش از حد، مقادیر زیادی از ROS را به محیط عرضه کرده و موجب اکسیداسیون سلولی خواهد گردید(22). بنابراین تصور می‏شود که نوعی ارتباط بین نیکوتین و این آنزیم در جهت تولید ROS و القاء پدیده LPO در غشاء اسپرم وجود دارد. در مطالعه‏ای روی سلولهای پانکراس انسان مشخص گردید که افزودن نیکوتین به محیط کشت این سلولها موجب افزایش در مقدار TBARS و نیز ROS می‏گردد(23). به نظر این محققان نیکوتین به صورت مستقیم بر غشاء سلول اثر نموده و تولید ROS را سبب می‏شود. در آزمایش مذکور حضور ROS در محیط به روش لومی‏نسانس ثابت کردند،‌ اما توضیحی در مورد آن که نیکوتین از چه طریق سبب تولید و رهاسازی ROS در محیط عمل شده، ارایه نشده است.

نیکوتین دارای اثرات زیان‏آوری در غلظتهای یک میلی‏مولار و بیشتر بر مشخصه‏های حرکتی اسپرم بوده و این در حالی است که غلظت 1/0 میلی‏مولار آن فاقد هرگونه اثر مخربی بر عملکرد اسپرم است(24). همچنین در رابطه با اثرات مخرب نیکوتین بر غشاء سلولهای جنسی و تأثیر آن بر فرآیند لقاح و اتصال سلولهای اسپرم و تخمک، در سال 1995 Pekarsky و همکاران نشان دادند که میزان اتصال و نفوذ اسپرم به درون تخمک فاقد لایه زونا هامستر با افزایش در غلظت نیکوتین از 1/0 به 10 میلی‏مولار، کاهش شدید و معنی‏دار را نشان می‏دهد(25). موارد فوق و نتایج مطالعه اخیر نشان می‏دهد که نیکوتین قادر به تغییر ساختار غشاء اسپرم بوده که نتیجه آن عدم کارآیی غشاء اسپرم در ارتباط و میان کنش با سلول تخمک بوده که منجر به عدم باروری خواهد گردید.

مواد آنتی اکسیدان غیر آنزیمی نظیر ویتامین C، گلوتاتیون و آنالوگ محلول در آب ویتامین E (ترولوکس) به عنوان دومین سد دفاعی در مقابل عوامل اکسیدکننده نظیر ROS، پس از اولین خط دفاعی یعنی آنتی‏اکسیدان‏های آنزیمی عمل می‏کنند و از طریق به دام انداختن رادیکال‏های آزاد ، باعث جمع‏آوری و حذف آنها از محیط عمل سلول‏ها می‏گردند. در پژوهش حاضر از غلظت نهایی 1 میلی‏مولار برای ویتامینC، 5 میلی‏مولار برای GSH و 02/0 میلی‏مولار برای ترولوکس استفاده شد. در این بین ترولوکس به عنوان آنتی‏اکسیدان برتر و قادر به پائین آوردن سطوح TBARS در محیط عمل اسپرم بود. ترولوکس به عنوان یک آنتی‏اکسیدان کرومانولی توانایی به بدام انداختن دو رادیکال آزاد در نزدیکی ناحیه قطبی و آب‏دوست خود را دارد و قادر به نفوذ به درون ساختار لیپیدی غشاء سلول بوده و رادیکالهای آزاد را از درون غشاء جدا و از محیط دور می‏سازد(26).

بدین ترتیب نقش ترولوکس به عنوان یک آنتی‏اکسیدان محلول در آب و نیز تا حدودی دارای قدرت ورود به لایه‏های لیپیدی غشاء آشکار گشته و احتمالاً نتایج بهتر آن در این مطالعه نیز ناشی از این پتانسیل دوگانه آن باشد.

همانطور که قبلاً اشاره شد در بخشی از این پژوهش برای تعیین LPO از سولفات فروس mM2/0 به عنوان منبع یون‏های دو ظرفیتی آهن (Fe2+) استفاده شد تا اثر آن بر روند LPO مشخص گردد. نتایج حاصل نشان داد که افزودن یون‏های آهن باعث افزایش سطوحTBARS محیط می‏گردد و واکنش آنتی‏اکسیدان‏ها نیز در جهت کاهش این روند بود، ‌اما در این قسمت ویتامین C نه تنها نقش مهاری خود را ایفاء ننمود بلکه در طی یک عمل سینرژیک با یون‏های آهن، موجب افزایش هر چه بیشتر میزان MAD و یا TBARS محیط آزمایش گردید. یون‏های دو ظرفیتی آهن در طی واکنش موسوم به واکنش Fenton موجب تبدیل آب اکسیژنه محیط به رادیکال آزاد هایدروکسیل (OHo) شده، که محصولی بسیار فعال و واکنش‏دهنده بوده و به سرعت به ساختار لیپیدی غشاء حمله‏ کرده و روند LPO آغاز می‏گردد. ویتامین C به عنوان یک عامل احیاءکننده موجب رهاسازی یون‏های فلزی نظیر آهن و مس از ساختار غشاء سلول شده و بدین ترتیب مواد اولیه مورد نیاز واکنش Fenton را تأمین و سبب تشدید اکسیداسیون سلولی خواهد شد(27). نسبت گلوتاتیون احیاء به اکسید دارای نسبت عکس با استرس اکسیداتیو دانست. در مطالعه حاضر مشخص گردید که تیمارهای نیکوتینی قادر به کاهش این نسبت بوده و مقادیر زیادی از مولکولهای گلوتاتیون احیاء به مصرف رسیده و به گلوتاتیون اکسید تبدیل می‏شود. با توجه به نقش نیکوتین در تولید ROS می‏توان تصور نمود که ROS تولید شده توسط نیکوتین با کاهش گلوتاتیون احیاء موجب اکسیداسیون سلولی شده است. Mammoto و همکاران در سال 1996 نشان دادند که ROS از طریق اکسیداسیون گروههای سولفیدریل موجود در اسپرم موش، موجب کاهش قدرت اتصال اسپرم به تخمک گردید. بخش فعال و مهم در مولکول گلوتاتیون احیاء نیز، گروه سولفیدریل بوده که قادر به ایجاد واکنش با رادیکال‏های آزاد محیطی و حذف آنها است(28). در اریتروسیت‏های انسان استرس اکسیداتیو موجب کاهش و یا حذف مولکولهای GSH شده و در مقابل، افزایش سطوح GSSG در محیط را به دنبال دارد(29). بنابراین سنجش و بررسی این نسبت کمک زیادی در تفسیر اثرات یک ماده شیمیایی و یا یک داروی پیشنهادی در بافت‏های بدن جانوران خواهد نمود. گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST) به عنوان یکی از اولین سدهای مقابله با اکسیداسیون سلولی نقش مهمی را در جهت حذف رادیکال‏های آزاد از محیط ایفاء می‏نماید. این نقش به کمک سوبسترای آن یعنی GSH امکان‏پذیر خواهد بود. GST علاوه بر حضور در درون اسپرم، به صورت چسبیده بر سطح خارجی غشاء اسپرم نیز مورد شناسایی قرار گرفته است(30). در مطالعه حاضر نشان داده شد به دنبال افزایش نیکوتین به نمونه‏های مایع اسپرمی به صورت وابسته به غلظت نیکوتین موجب افزایش فعالیت GST می‏گردد. این امر نشان دهنده دخالت وسیع مجموعه‏های دفاعی وابسته به GSH در درون و برون اسپرم است. از آنجا که کاربرد آنتی‏اکسیدان‏ها سبب کندی فعالیت GST گردید، لذا می‏توان عنوان نمود که آنتی‏اکسیدان‏ها با حذف ROS محیط پیرامون آنزیم GST موجب کاهش فعالیت آن شده و در نتیجه در میزان سوبسترای GSH این آنزیم صرفه‏جویی گردیده که در واقع همان افزایش ضریب حفاظتی سلول است. بدین ترتیب در شرایط استرس اکسیداتیو، فعالیت GST نیز افزایش معنی‏داری را نشان خواهد داد(31). لذا با توجه به این امر تولید ROS توسط تیمارهای نیکوتینی قریب به یقین خواهد بود.

سلولهای اسپرم واجد دو مکانیسم تدافعی در مقابل هجوم عوامل خارجی به ساختار DNA خود هستند، یکی قالب محکم و مقاوم پروتامینی که در طی بلوغ اسپرم به آنان افزوده می‏شود و دیگری آنتی‏اکسیدان‏های پلاسمای سمینال است، در حالت طبیعی بسته‏بندی محکم و لوپ‏های موجود در ساختار DNA مانع از ایجاد آسیب‏های جدی توسط رادیکال‏های آزاد محیطی می‏شوند اما در حالت جداسازی آنتی‏اکسیدان‏های طبیعی از مایع اسپرمی (برای مثال شستشوی مایع اسپرمی) این سپر دفاعی، تضعیف می‏گردد. Hughes و همکاران در سال 1996 نشان دادند که در افراد بارور میزان شکستگی‏ها و صدمات موجود در DNA نسبت به افراد طبیعی بیشتر بوده و به تابش اشعه‏های قدرتمندی چون اشعه گاما بیشتر نیز حساس هستند(31). در پژوهش حاضر به کمک روش ستاره دنباله‏دار نشان داده شد که تیمارهای نیکوتینی در یک روند وابسته به غلظت، موجب القاء شکستگی‏هایی در DNA اسپرم گردید. این شکستگی‏ها را می‏توان به طور مستقیم به حضور ROS ناشی از افزایش نیکوتین نسبت داد که با ایجاد اکسیداسیون موضعی مقدمات بروز این شکست‏ها را فراهم نمودند. کاربرد رنگ اکریدین نارنجی نیز نشان داد که بیشتر این شکست‎ها از نوع دو زنجیره‏ای بوده و در نتیجه رنگ فلوئورسانس سبز در DNA اسپرم حاصل می‏گردید. در مردان نابارور هردو شکست‏های DNA و سطوح ROS افزایش معنی‏داری را نشان داده است(32). کاربرد آنتی‏اکسیدان‏ها در آزمایش حاضر تا حدی از میزان شکستگی‏ها کاسته و تعداد سایر سلول‏های طبیعی بدن را افزایش داد ولی این تغییرات از نظر آماری تفاوت معنی‏داری نداشت. حذف ROS از محیط، اولین و اصلی‏ترین علت در کاهش میزان آسیب‏های DNA سلول‏های اسپرم در هنگام افزودن آنــتی‏اکـسیـدان‏هـا بـه مـحیط بـوده است. در مـجمـوع کـاربـرد نیکـوتین به عنوان ماده‏ای مهم در دود سیگار، موجب القاء اکسیداسیون شدید در ساختار اسپرم شد که از نتایج آن تخریب غشاء سلولی و نیز بروز شکستگی در DNA این سلول‏ها بوده که به مقدار زیادی در ناباروری دخیل هستند. این نتایج زیان‏آور در صورت استفاده از مواد آنتی‏اکسیدان‏ها قابل تعدیل و یا حتی برگشت به حالت اولیه نیز خواهند بود.

تعیین دقیق مسیر سیگنال رسانی نیکوتین به درون سلول‏های اسپرم و نیز تشخیص کمپلکس‏های احتمالی نیکوتین با اجزاء پلاسمای سمینال که قادر به تأثیر بر ساختار این سلول‏ها هستند از جمله مواردی است که می‏توان در پژوهش‏های آینده مد نظر قرار داد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از وزارت علوم، تحقیقات و فنآوری جمهوری اسلامی ایران به جهت پشتیبانی مالی از تحقیق حاضر که در کشور هند انجام گرفت تشکر و قدردانی می‏گردد.