Evaluation of Spermatogenesis in non-obstructive azoospermic patients with histopathological and cytological methods

Akhondi, Mohammad Mehdi; Sedighi, Mohammad Ali; Amirjannati, Naser

Evaluation of Spermatogenesis in non-obstructive azoospermic patients with histopathological and cytological methods

Authors

Mohammad Mehdi Akhondi ¹

Mohammad Ali Sedighi ²

Naser Amirjannati ³

¹ Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran; Embryology Department, Royan Research Center, Tehran, Iran

² Andrology Department, Royan Research Center, Tehran, Iran; Urology Department, Shariati Hospital, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran

³ Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran

Abstract

The ability to use only a few spermatozoa using testicular biopsy and by microinjection technique to achieve fertilization and pregnancy has revolutionized the potentials to treat patients suffering from azoospermia. However, spermatogenesis is defective in men with non-obstructive azoospermia (NOA) resulting in failure to detect spermatozoa. In order to achieve a more sensitive and reliable method for detecting sperm/spermatid in testes of NOA patients, we compared histopathological and cytological methods. Eighty six NOA patients were included in a prospective study. History taking, physical examination and hormonal profile (including FSH) were done initially. Thirty six patients had testis pathology report before enrolling in to our study. The patients underwent multiple bilateral testis biopsies until successful retrieval of sperm/spermatid. Half of each biopsy specimen underwent cytological evaluation (mechanical and enzymatic) and the other half was sent for pathological evaluation (TBX). The male and female mean ages were 37 (25-59) and 32 (23-42) years, respectively. The mean infertility duration was 7 years. The mean volume of right and left testis were 16.4 and 16.2ml, respectively. Mean FSH level was 18.1±4.2 mIU/ml. In cytology, sperms and spermatids were seen in 65 and 18 patients, respectively and in pathology slides in 51 and 16 patients, respectively. In our study, the relationship between visualizing testicular sperm/spermatid and TESE had sensitivity of 80% and negative predictive value of 15%. Sixty one patients had sufficient number of sperm/spermatid for ICSI and with this treatment fifty seven embryos were transferred and seven clinical pregnancies were observed. In conclusion, in men with non-obstructive azoospermia, TESE is more sensitive and reliable than histopathology evaluation. This means that TESE may help in deciding for treatment of severe male factor infertility, even when histopathologic examination is inconclusive.

Keywords

ICSI

Non

obstructive azoospermia

Open testis biopsy

Testicular sperm extraction

Testis histopathology

مقدمه

ورود میکرواینجکشن(ICSI) در زمرة درمانهای (ART) امکان باروری زوجهایی با مشکل آزواسپرمیای غیرانسدادی را، که تا آن زمان غیر قابل درمان بنظر می‌رسید، فراهم ساخت. آزواسپرمیای غیرانسدادی در واقع نارسایی اولیة بیضه بدلایل اختلالات کروموزومی، مادرزادی، عفونی، بدخیمی، شیمی‌درمانی، اشعه درمانی و یا با دلایل ناشناخته است که اسپرم‌سازی را تا حد زیادی متوقف می‌کند. لذا در این بیماران امکان بررسی و مشاهدة اندک اسپرم‌های موجود در کانونهای اسپرم‌ساز بیضه در انزال وجود ندارد(1). اگرچه توانایی باروری اسپرم حاصل از بیضه بسیار کمتر از اسپرم حاصل از انزال، که مراحل بلوغ را در اپی‌دیدیم طی نموده است، می‌باشد(3و2)، بکارگیری روشهای پیشرفتة درمان ناباروری از قبیل میکرواینجکشن،‌ امکان تزریق اسپرم حاصل از بیوپسی بیضه را فراهم کرده و بدین ترتیب امکان بارورنمودن تخمک و باروری زوجی که تا چندی پیش داشتن فرزند برای آنها متصور نبود، حاصل شده است. در چنین شرایطی حضور اسپرم در داخل بیضه حتی در تعداد اندک تعیین‌کننده خواهد بود و انتخاب بهترین روش بدست آوردن تعداد محدود اسپرم، از بیضه‌ای که نارسایی اولیه دارد ولی اسپرماتوژنز بصورت کانونهای معدودی در بیضه وجود دارد، برای درمان زوج نابارور با اهمیت خواهد بود. لازم به توضیح است که وجود اسپرم به تنهایی برای حصول به لقاح تخمک و حاملگی کفایت نمی‌کند و شرایطی نظیر سن همسر و وجود تخمک با کیفیت مطلوب نیز تعیین کننده خواهد بود. تلاش‌های زیادی برای تعیین عوامل پیشگویی‌کنندة حضور اسپرم در بیضه صورت گرفته است. بررسی‌های کلینیکی نشان می‌دهد که بین حجم بیضه و دستیابی به اسپرم از طریق بازیافت اسپرم از نسج بیضه (TESE) ارتباطی وجود ندارد(5،4). البته در حجم‌های کمتراز ml5 دستیابی به اسپرم بطور قابل توجهی کاهش می‌یابد(6). بررسی‌های آزمایشگاهی نشان می‌دهد که میزان طبیعی هورمونهای جنسی نظیر ß-Inhibin, LH, FSH و تستوسترون داخل بیضه برای اسپرماتوژنز فعال ضروری است. در صورت اختلال در اسپرماتوژنز مانند آزواسپرمیای غیر انسدادی، معمولاً در میزان سرمی این هورمونها اختلال حاصل می‌شود. بگونه‌ای که در این حالت میزان FSH افزایش و میزان ß-Inhibin کاهش می‌یابد؛ ولی در بسیاری از موارد با وجود این تغییرات سرمی، حضور اسپرم در بیضه مسجل شده است(11،1،4،5،7،8،9،10). تا کنون تکنیک‌‌های متنوعی برای تأیید حضور و حصول اسپرم در بیماران آزواسپرمیای غیرانسدادی مورد استفاده قرار گرفته است. بیوپسی تفنگی بدلیل داشتن عوارض و ناکافی بودن از جهت دستیابی به اسپرم، کمتر بکار می‌رود(12). درحالیکه بیوپسی سوزنی(FNA) عوارض کمتری دارد و مؤثرتر است؛ ولی ناکافی بوده و بدین ترتیب بیوپسی باز بیضه روش استاندارد برای ارزیابی اسپرماتوژنز می‌باشد (13) در این روش امکان استفاده از میکروسکوپ جراحی نیز وجود دارد که عوارض را کاهش و موفقیت عمل را افزایش می‌دهد

(14). روش متداول نمونه‌برداری از بیضه (TBx) و ارسال نمونه به منظور بررسی هیستولوژی و اسپرماتوژنز توسط پاتولوژیست معمولاً با محدودیت‌هایی مواجه می‌باشد(15و1،4،7).

از آنجا که با وجود حتی یک اسپرم در نمونه بیضه امکان باروری تخمک و حاملگی زوج نابارور فراهم می‌شود، نیاز به استفاده ازروش‌های حساس‌تر، مطمئن‌تر و دقیق‌تر، ضروری‌است.

TESE یا حصول مستقیم اسپرم از بافت دایسکت شدة بیضه، روشی است که علی‌الخصوص در مراکز درمان ناباروری بصورت متداول مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مطالعه سعی شده است تا با بررسی نقش هیستوپاتولوژی و سیتولوژی در ارزیابی اسپرماتوژنز بیماران آزواسپرمیای غیرانسدادی، لزوم استفاده از یک یا هر دو روش، مورد مطالعه قرار گیرد تا در صورت اثبات وجود اسپرم در روش‌های فوق، امکان کمک به زوج نابارور با استفاده از روش‌های درمان ناباروری لقاح خارج رحمی، به کمک تزریق اسپرم حاصل از بیضه به داخل تخمک و باروری آن و انتقال جنین حاصل به داخل رحم، فراهم آید.

مواد و روشها

در این مطالعه 86 بیمار با آزواسپرمیای غیرانسدادی که برای درمان ناباروری طی مدت یکسال به مرکز ناباروری رویان مراجعه کرده بودند مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی‌های بالینی، مراحل آزمایشگاه جنین‌شناسی و پاتولوژی بترتیب توسط متخصص ارولوژی، متخصص جنین‌شناسی و پاتولوژیست انجام ‌شد. برای بررسی ناباروری در این مردان شرح حال پزشکی و تولید مثلی گرفته شد. هر کدام از بیماران تحت معاینات بالینی شامل صفات ثانویة جنسی، معاینه آلت تناسلی، بیضه‌ها، وازدفران،‌ اپیدیدیم و معاینة رکتال (برای رد کردن پاتولوژی پروستات) قرار گرفتند. برای تعیین وضعیت هورمونی (FSH، LH و تستوسترون) از بیماران خون گرفته شد. نمونه‌های منی بعد از 5-3 روز امتناع جنسی و بطریق استمناء در یک ظرف استریل جمع آوری و بمدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد تا مایع شود و سپس براساس شاخصهای WHO آنالیز شد. تشخیص آزواسپرمی براساس عدم رؤیت اسپرم در نمونة مستقیم مایع منی و لام Pellet سانتریفوژ شده صورت گرفت، که با بررسی مشابه نمونة مجدد مایع منی تأیید شد. برای ردکردن انزال رتروگراد، ادرار بعد از انزال مورد بررسی قرار گرفت. تشخیص آزواسپرمیای غیرانسدادی براساس معاینات بالینی (اندازة بیضه‌ها)، اندازه‌گیری هورمونها و در مواردی بیوپسی بیضه‌ها بود. برای تشخیص قطعی وضعیت اسپرماتوژنز در این بیماران، بیوپسی دو طرفة بیضه بصورت سرپایی و تحت بلوک طناب اسپرماتیک و انفیلتره‌کردن موضعی اسکروتوم با لیدوکائین 2% انجام شد. درهر مرحلة بیوپسی هر تکه از بافت بیضه که حدود 25 میلی‌گرم وزن داشت، در محیط کشت Ham'sF10 (Sigma-U.S.A) قرار داده شد و در آزمایشگاه جنین‌شناسی به دو قسمت تقسیم گردید. یک دوم نمونه در اختیار پاتولوژیست و نیمی دیگر آن در اختیار جنین‌شناس قرار داده شد. در آزمایشگاه جنین‌شناسی قسمتی از نمونه بدقت توسط دو سرنگ انسولین و زیر دید میکروسکوپ نوری (Olympus-Japan)، خرد و دایسکت شد. محتوای دایسکت شده به روی لام آزمایشگاهی منتقل و با افزودن لامل بر آن و فشار مجدد بر لامل نهایت تلاش در خروج سلولـهای موجود در لولـه‌های سمینفروس برای مشاهدة آنها زیر میکروسکوپ بعمل آمد. لام تهیه شده به کمک میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی400× مشاهده و وجود یا عدم وجود اسپرم و اسپرماتید گزارش شد. در صورت عدم رؤیت این سلولـها در نمونة مورد مطالعه، بخشی دیگر از نمونه در داخل یک ظرف کشت (Nunc-Denmark) استریل کوچک قرار داده شد. سپس آنزیم کلاژناز Type II (Sigma-U.S.A) به آن اضافه شده و نمونه پس از نیم ساعت توسط دو سوزن انسولین بدقت دایسکت و محتویات ظرف به یک لولةml 6 استریل منتقل و با افزودن محیط کشت HF10 سانتریفوژ شد. رسوب حاصل در بین لام و لامل مورد بررسی قرار گرفت و وضعیت اسپرماتوژنز گزارش گردید.

در صورت عدم رؤیت اسپرم در بررسی‌های فوق بوسیلة تکنیک TESE، همزمان به ارولوژیست برای برداشت نمونه‌های جدید از محل‌ دیگر بیضه اطلاع داده می‌شد و این روند تا حصول اسپرم در نمونه، حداکثر تا 8 نمونه از دو بیضه تکرار می‌شد. یک دوم باقی‌مانده هر نمونة بیوپسی در محلول Bouin قرار داده و برای بررسی هیستوپاتولوژی برای پاتولوژیست ارسال شد. نمونة دریافتی توسط پاتولوژیست با پارافین ثابت و برش‌های mm4 از آن تهیه شد. سپس این نمونه‌ها بوسیلة الکل/گزیلل از پارافین جدا، با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی و بوسیلة میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 1000× (با تکنیک‌های استاندارد) تحت بررسی قرار گرفت. پاتولوژیست وضعیت اسپرماتوژنز در لومن توبولهای سمی‌نیفروس را گزارش کرد.

در صورت گزارش وجود اسپرم/ اسپرماتید در نمونه TESE (سیتولوژی)، TBx (پاتولوژی) و یا هر دو، بیمار برای درمان لقاح خارج رحمی به طریق ICSI و با استفاده از تزریق اسپرم/ اسپرماتید بدست آمده از بیوپسی بیضه بداخل تخمک، کاندید می‌شد.

نتایج

در این مطالعه 86 زوج نازا که میانگین سنی بیماران مرد 2/7±37 سال (59-25 سال) و میانگین سنی همسرانشان 0/6±32 سال (42-23سال) بود تحت بررسی قرار گرفتند. از میان مردان 18% سن بیش از 45 سال و در میان زنان 12% سن بیش از 40 سال داشتند. میانگین مدت نازائی 8/1±7 سال بود. 9 نفر از مردان سابقة ازدواج قبلی داشتند که 2 نفر آنها صاحب فرزند بودند. فقط یک زن سابقة ازدواج قبلی داشت؛ ولی هیچ زنی در سابقه، فرزندی نداشته است.

میانگین حجم بیضة راست ml4/16و بیضة چپ

ml2/16 و میانگین میزان FSH، mIU/ml2/4±1/18 بود. تعدادی از بیماران بیوپسی قبلی بیضه داشتند که نتایج آن در جدول شماره 1 آمده است. شکل شماره 1، تصویر هیستولوژی و اشکال 2 و 3 دو نوع پاتولوژی شایع اسپرماتوژنز را نشان می‌دهد.

متوسط تعداد نمونه‌های بیوپسی برداشته شده در هر فرد 1/3 (8-2) بود. جدول شماره 2 نتایج گزارش پاتولوژیست و سیتولوژیست (آزمایشگاه جنین‌شناسی) را از نمونه‌های همزمان بیوپسی باز بیضه نشان می‌دهد. در جدول شماره 2، مثبت به معنی حضور اسپرم/ اسپرماتید در هر یک از روشها و منفی به معنای عدم حضور آن دو می‌باشد.

همانگونه که در جدول شماره 2 دیده می‌شود در TESE 3 بیمار اسپرم/ اسپرماتید دیده نشد. در حالیکه این وضعیت در پاتولوژی 19 بیمار گزارش گردید. بدین ترتیب در 16 موردیکه پاتولوژیست قادر به رؤیت اسپرم/ اسپرماتید نبود، سیتولوژیست توانست این سلولـها را جدا کند. همچنین سیتولوژیست علاوه بر تأیید تمام موارد پاتولوژی، در 14 بیماریکه پاتولوژیست پاسخ منفی گزارش کرده بود توانست از بیضه اسپرم بدست آورد. 61 بیمار دارای اسپرم/ اسپرماتید کافی برای انجام درمان ناباروری به روش ICSI بودند. اطلاعات حاصل از انجام عمل TESE-ICSI در باروری تخمکها و حاملگی ناشی از آن در جدول شماره 3 آورده شده است. تصاویر 4 و 5 سیتولوژی اسپرماتوژنز طبیعی و توقف بلوغ را نشان می‌دهد.

بحث

این مطالعة آینده‌نگر ارتباط وضعیت اسپرماتوژنز توسط پاتولوژی با سیتولوژی از نمونه‌های بیوپسی باز بیضه در بیماران آزواسپرمیای غیرانسدادی را مورد بررسی قرار داده است. با توجه به حساسیت 80% و ارزش پیشگویی منفی (N.P.V.) 15% پاتولوژی بیضه، بدین ترتیب بررسی سیتولوژی، روشی مطمئن‌تر و دقیقتر نسبت به بررسی پاتولوژی درخصوص حضور اسپرم/ اسپرماتید در بیضه می‌باشد(جدول شماره 2). در 16 بیمار (19 درصد) در پاتولوژی آنها اسپرماتوزوآ و اسپرماتید دیده نشده است؛ ولی در TESE، این سلولـها رؤیت شده‌اند و لذا پاسخ منفی پاتولوژیست در این زمینه را نباید پایان راه دانست (جدول شماره 2). مشابه مطالعة Soe JT. و مطالعة Kahraman در سال 2001، در این مطالعه نیز افزایش FSH سرم، کوچک‌بودن بیضه‌ها و نیز نارسایی اولیة بیضه دلیلی برای عدم بیوپسی بیضه نیستند

(5و4).

مطالعة .Seo JT در سال 2001 نشان داده است که روش هیستوپاتولوژی بیضه می‌تواند بعنوان موفق‌ترین روش بدست‌آوردن اسپرم از بیضه به کار رود. در این مطالعه در 3/16% از بیماران با سندرم سلول سرتولی تنها و در 5/62% از بیماران باتوقف بلوغ اسپرم اسپرم بطور موفقیت‌آمیز به روش TESE خارج شد(4). همچنین این مطالعه، مشابه مطالعة حاضر، در مواردیکه پاتولوژی ناامید‌کننده بود TESE را منتفی ندانسته و اقدام به انجام‌دادن آن کرده است. در مطالعة Soe JT. طبقه‌بندی بیوپسی‌های بیضه براساس نمای غالب دیده شده در هیستولوژی بود. در مطالعة ما حضور اسپرم/ اسپرماتید (که رده‌های انتهایی فرآیند اسپرماتوژنز می‌باشند و در تصمیم‌گیری درمانی دخالت دارند) در بررسی‌های هیستولوژی مورد نظر بود تا اینکه به یک نمای هیستولوژی خاص اشاره شود.

در مطالعة ما رابطة بررسی هیستوپاتولوژی با دسترسی به اسپرم/ ‌اسپرماتید در TESE دارای حساسیت 80%، اختصاصی‌بودن 100%، ارزش پیشگویی مثبت(P.P.V.) 100% و ارزش پیشگویی منفی 15% بود. در مطالعة‌ Ezeh در سال 1998 رابطة بین رؤیت اسپرماتید در پاتولوژی با TESE دارای حساسیت71%، ویژگی 92%، ارزش پیشگویی مثبت 97% و ارزش پیشگویی منفی 58% بود. بدین ترتیب در مطالعة Ezeh‌ در 42% مواردی که در پاتولوژی اسپرماتید دیده نشده بود TESE توانست اسپرماتوزوآی متحرک را از نمونه‌ها خارج کند. در حالیکه در مطالعة‌ ما در 85%‌ مواردی که در پاتولوژی، اسپرم/ اسپرماتید دیده نشد TESE مثبت بود. علت این اختلاف این است که در مطالعة Ezeh فقط دستیابی به اسپرماتوزوآی متحرک در TESE مورد نظر بود در حالیکه در مطالعة ما علاوه بر آن، حضور اسپرماتید نیز بعنوان TESE مثبت تلقی شد و حتی مورد استفاده درمانی قرار گرفت. علت دیگر این تفاوت آن است که در مطالعة حاضر به هنگام TESE از آنزیم کلاژناز نیز استفاده شد؛ در حالیکه در مطالعة Ezeh‌ عمل TESE‌ صرفاً به روش مکانیکی بوده است(1). از طرفی همانگونه که عدم رؤیت اسپرم در هیستولوژی بیضه نمی‌تواند احتمال تولید اسپرم را رد کند فقدان اسپرماتید در هیستولوژی نیز نمی‌تواند بیانگر فقدان اسپرماتوژنز و به تبع آن عدم رؤیت اسپرم و یا اسپرماتید در TESE باشد. مطالعة Ezeh در 1998 نیز به مطلب فوق پرداخته است(1).

از ویژگی‌های بررسی بیوپسی بیضه از طریق TESE نسبت به بررسی پاتولوژی این است که حجم نمونة بیشتری از مجموع بافت بیضة برداشته شده مورد ارزیابی قرار می‌گیرد؛ در حالیکه در بررسی پاتولوژی (TBx) تنها چند برش از مجموع نمونه‌های ارسالی مورد مطالعه قرار می‌گیرد. بنابراین ارزیابی TESE امکان مطالعة کانونهای اسپرم‌ساز بیشتری از بیضه را فراهم می‌کند.

این مطالعه نیز مشابه مطالعات دیگر نشان داد که میزان FSH سرمی و اندازة بیضه‌ها برای پیشگویی حضور اسپرم در TESE تعیین‌کننده نخواهند بود و علی رغم افزایش FSH و کوچک‌بودن بیضه‌ها بیوپسی و جست و جوی اسپرماتوزوآ در بیضه انجام شد (6و1،4،5).

اگرچه استفاده از روش TESE در ارزیابی وضعیت اسپرماتوژنز در آزواسپرمیای غیرانسدادی منجر به دستیابی اسپرم/ اسپرماتید در 65 بیمار شد؛ ولی در زمان درمان زوجین با استفاده از ICSI/TESE بوسیلة تزریق اسپرم/ اسپرماتید، تنها در 61 بیمار درمان انجام گردید. شاید علت این امر علی‌رغم نمونه‌برداری متعدد، عدم دسترسی به کانونهای اسپرم ساز بیضه در روز درمان باشد. از دلایل دیگر عدم دسترسی به اسپرم در زمان درمان، محدودیت استفاده از روش آنزیمی بود؛ در حالیکه در زمان تشخیص علاوه بر روش مکانیکی از روش آنزیمی نیز استفاده شد. چون تأثیر این آنزیمها در درمان ناباروری مورد ارزیابی دقیق واقع نشده، در این مطالعه در روند درمان از این روش استفاده نگردیده است. مطالعات بیشتر برای اطمینان از عدم تأثیر آنزیم‌هایی مانند کلاژناز بر عملکرد اسپرم ضروری است تا بدون نگرانی، استفاده از آن در بررسی این بیماران امکان‌پذیر شود.

در 10 بیمار (12%) در حالیکه TESE تشخیصی وجود اسپرماتوزوآ و اسپرماتید را در بافت بیضه گزارش کرد، درTESE درمانی، سلول دیده نشد و یا تعداد کافی برای انجام ICSI وجود نداشت. در این بررسی، در مواردیکه در TESE و یا TBx، اسپرماتید گزارش شد از تلاش بعدی برای درمان ناباروری و تزریق بداخل تخمک حذف نشدند و نهایتاً در 12 مورد از TESEها که در آنها اسپرماتوژنز تا مرحله اسپرماتید موجود بود، ICSI انجام شد و در کلیه موارد انتقال جنین صورت پذیرفت. اگر چه هیچ حاملگی از این موارد گزارش نشد. شاید یکی از دلایل پایین بودن میزان حاملگی بالینی در این مطالعه (ده درصد) نسبت به مطالعات دیگر (تزریق اسپرم حاصل از بیضه بداخل تخمک) باشد که به موارد درمانی اضافه شده است. بطوریکه در مطالعه Chan P.T. در سال 2001 میزان حاملگی بالینی 33% و مطالعة Koci K. در سال 1998، 27% بود(17و16).

می‌توان نتیجه گرفت که هیچکدام از روشهای بالینی (اندازة بیضه‌ها)، آزمایشگاهی (میزان FSH) و هیستولوژی بیضه در بیماران آزواسپرمیای غیرانسدادی نمی‌تواند دستیابی موفقیت‌آمیز به اسپرم را در TESE پیشگویی کند و بررسی روند اسپرماتوژنز با روش TESE حساستر و مطمئن‌تر از پاتولوژی می‌باشد و حتی در مواردیکه بررسی‌های پاتولوژی منفی باشند می‌تواند در تصمیم‌گیری درمان ناباروری دخیل باشد. در صورت دستیابی به اسپرم در نمونه‌های TESE تشخیصی، منجمدکردن توصیه می‌شود؛ تا در صورت عدم دسترسی به اسپرم در TESE درمانی (که احتمال آن هم نشان داده شده است) از نمونه‌های منجمد شده استفاده شود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از کلیه همکاران آزمایشگاه جنین‌شناسی پژوهشکده رویان که ما را در این مطالعه یاری نمودند، ‌کمال تشکر و سپاس را داریم.

Ezeh U.I.O., Moore H.D.M., Cooke I.D. Correlation of testicular sperm extraction with morphological, biophysical and endocrine profiles in men with azoospermia due to primary gonadal failure. Hum Reprod.1998; 13(11): 3066-3074.
Akhondi M.A., Chapple C., Moore H.D.M. Prolonged survival of human spermatozoa where Co-incubated with epididymal cell cultures. Hum Reprod. 1997;3:514-22.
Sadeghi M.R., Akhondi M.A., Zahraei M. Role of surface proteins with epididymal origin on fertilization. Med J Reprod & Infertil. 2000;3:43-54.
Seo J.T., KO W.J. Predictive factors of successful testicular sperm recovery in non obstructive azoospermia patients. Int J Androl. 2001;24(5):306-10.
Kahramans S., Yakin K., Samli M., Vanlioglu F., Karlikaya G., Sertyel S., Donmez E. A comparative study of three techniques for the analysis of sperm recovery: touch-print cytology,wet preparation, and testicular histopathology. J Assist Reprod Genet. 2001;18(7):357-63
Glander H.J., Horn L.C., Dorschner W., Paasch U., Kratzsch J. Probability to retrieve testicular spermatozoa in azoospermic patients. Asian J Androl. 2000;2(3):199-205
Jezek D., knuth U.A, schulze W. Successful testicular sperm extraction (TESE) in spite of high serum follicle stimulating hormone and azoospermia: correlation between testicular morphology, TESE results,semen analysis and serum hormone values in 103 infertile men. Hum Reprod. 1998; 13(5): 1230-1234.
Ballesca Jose L., Balasch J., Calafell Josep M., Alvarez R., Fabregues F., Osaba M., Ascaso C., Vanrell A. Serum inhibin B determination is predictive of successful testicular serum extraction in men with non-obstructive azoospermia. Hum Reprod. 2000; 15(8): 1734-1738.
Bohring C., Schroeder I., Weidner W., Krause W. Serum levels of inhibin B and follicle stimulating hormone may predict successful sperm retrieval in men with azoospermia who are undrgoing testicular sperm extraction. Fertil steril. 2002; 78(6): 1195-9.
Vernaeve V., Tournaye H., Schiettecatte J., Verheyen G., Van steirteghen A., Devroey P. Serum inhibin B can not predict testicular sperm retrieval in patients with nonobstructive azoospermia. Hum Reprod. 2002; 17(4): 971-6.
Houser R., Botchan A., Yogev L., Gamzu R., Ben Yosef D., Lessing JB., Amit A., Yavetz H. Probability of sperm detection in nonobstructive azoospermic men undergoing testicular sperm extraction procedures unrelated to clinical parameters. Arch Androl. 2002; 48(4): 301-5
Meng M.V., Cha I.,Ljung B.M., Turek P.J. Testicular fine needle aspiration in infertile men: correlation of cytologic pattern with biopsy histology. Am J surg pathol. 2001; 25(1): 71-9
Dardashti K., Williams R.H., Goldstein M. Microsurgical testis biopsy: a novel technique for retrieval of testicular tissue. J Urol. 2000;163(4): 1206-7
Sousa M., Cremades N., Silva J., Oliveira C., Ferraz L., Teixeira da silva J., Viana P., Barros A.Predictive valve of testicular histology in secretory azoospermic subgroups and clinical outcome after microinjection of fresh and frozen-thawed sperm and spermatids. Hum Reprod. 2002;17(7): 1800-1810
Chan P.T., Palemo G.D., Veeck L.L., Rosenwaks Z., Schlegel P.N. Testicular sperm extraction combined with intracytoplasmic sperm injection in the treatment men with persistant azoospermic postchemotherapy.Cancer. 2001; 92(6):1632-7
Koci K., Lachman M., Mayer Z., Mrazek M., Jarolimkov AK., Tepla O., Mika J., Nejezchlebova L.MESA, TESA,TESE+ICSI: result of the first 50 cases. Ceska Gynekol. 1998; 63(1): 13-9. Czech.