تکنیک‌های کمک باروری آزمایشگاهی (ART) بطور قابل ملاحظه‌ای مشکلات زوجهای نابارور را حل نموده است؛ ولی علیرغم گذشت بیش از دو دهه از تولد اولین نوزاد آزمایشگاهی، هنوز میزان تولد نوزاد سالم از طریق ART نسبتاً پایین و در حدود 20% باقی‌مانده است. یکی از مهمترین علل کاهش این موفقیت، کیفیت نامطلوب شرایط محیط آزمایشگاهی برای رشد و نمو جنین قبل از لانه‌گزینی می‌باشد. مطالعات انجام شده بر روی گونه‌های مختلف پستانداران دلالت بر آن دارد که میزان تکامل(1)، تعداد سلول(2)، فعالیت بیوشیمیایی(3)، قدرت حیات(4) جنین در محیط آزمایشگاه پایین‌تر از محیط داخل بدن می‌باشد. تکامل اکثر جنینها در مرحله 8-4 سلولی (زمان فعال‌شدن ژنوم جنین) به دنبال کشت در آزمایشگاه متوقف میشود(5،6). توقف تکاملی سبب می‌گردد که در عمل جنینها در مراحل اولیه تقسیم (8-4 سلولی) به داخل رحم منتقل شوند و انتقال زودرس جنینها، سبب ناهماهنگی کامل بین رشد و تکامل جنین و اندومتر می‌گردد که به همراه کیفیت بد مورفولوژیک و متابولیکی جنین باعث کاهش میزان لانه‌گزینی و حاملگی میشود.
تلاشهای متعدد برای بهبود شرایط محیط کشت به وسیله تعدیل الکترولیت‌ها و منابع انرژی با محدودیت‌هایی درموفقیت روبرو شده است(7،8). ابداع سیستم کشت همزمان جنین با استفاده از انواع مختلف سلولـهای حمایت‌کننده وسیله مؤثرتری برای نگهداری و رشد و تکامل جنین در محیط آزمایشگاه فراهم نموده است و به ما اجازه می‌دهد تا میزان تکامل جنین را بهبود بخشیم و در نهایت میزان حاملگی را افزایش دهیم(9). متداولترین رده‌های سلولی مورد استفاده برای تکامل جنین انسان سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم گوساله (10)، سلولـهای کلیه میمون سبز آفریقایی (11)، سلولـهای گرانولوزا(12) و سلولهای اپی‌تلیال لولـه رحم انسان می‌باشند(13). میزان موفقیت سیستم کشت همزمان بستگی به رده‌های مختلف سلولی و محیطهای کشت مورد استفاده برای نگهداری سلولـها دارد. با توجه به نقش بالقوه سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم در تکامل جنین قبل از لانه‌گزینی در داخل بدن، به نظر می‌رسد این سلولـها بهترین سلول حمایت‌کننده در سیستم کشت همزمان برای تکامل جنین در محیط آزمایشگاه می‌باشند(14).
تا کنون محیطهای مختلفی از جمله RPMI-1640, Ham's F10, DMEM/F12 در کشت سلول به کار برده شده است؛ ولی تا کنون در هیچ کدام از این مطالعات مقایسه‌ای بین اثرات این محیطها با یکدیگر و بر روی تکامل جنین و سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم به طور جداگانه در محیط آزمایشگاهی به عمل نیامده است. هدف از این مطالعه بررسی اثرات این محیطها بر روی سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم انسان (کشت داده شده به روش منولایر و پولاریزه) در مراحل کشت اولیه و پاساژ سلولی و تکامل جنین در محیط آزمایشگاه می‌باشد.
1- تهیه بافت لولـه رحم انسان
بافت لولـه رحم از بین مراجعین بخش جراحی زنان بیمارستان میرزا کوچک‌خان، پس از هیسترکتومی کامل شکمی از 19 زن بین سنین 31-45 سال، با سابقه حداقل یک حاملگی موفق و سیکل قاعدگی منظم 25 تا 35 روز، به دلیل فیبروئید رحمی یا دلایل دیگر بدون وجود اشکال پاتولوژیک در لولـه رحم تهیه شد. تمام بافتها با اطلاع و رضایت کامل بیماران و مجوز کمیته اخلاقی پژوهشکدة ابن‌سینا جمع‌آوری شدند. سپس لولـه‌های رحمی در شرایط استریل داخل محلول
HBSS 10% (Sigma,USA) که حاوی پنی‌سیلین IU/ml 100 و استرپتومایسین μg/ml 100 (Sigma,USA) بود، قرار داده و به آزمایشگاه منتقل شد.
2- کشت اولیه سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم به صورت منولایر:
ابتدا لولـه رحم در ظرف کشت قرار داده و با HBSS استریل شستشو شد و سپس لولـه توسط پنس و قیچی به صورت طولی از ناحیه شیپور تا انتها برش داده شد تا قسمت داخلی مشخص گردد. پس از آن تکه‌های کوچک بافت پوششی (به ابعاد mm31) از قسمت آمپول لولـه رحم توسط قیچی بریده شد و سپس توسط تیغ اسکالپل به تکه‌های کوچکتری تقسیم گردید و به داخل لولـه سانتریفوژ حاوی ml5 از محلول کلاژناز 25/0% درجه نوع 4 (Sigma,USA) که در HBSS 10% (Sigma,USA) تهیه شده بود منتقل و در درجه حرارت 0c37 به مدت 1 ساعت قرار داده شد. در این مدت لولـه با ورتکس هر 15 دقیقه تکان داده می‌شد. پس از 1 ساعت سلولـهای جدا شده از هم، تهنشین شدند. قسمت روئی (حاوی کلاژناژ) برداشته شد و سپس بافت تهنشین شده با ml5، HBSS 10% بصورت سوسپانسیون سلولی درآمد. پس از آن محلول روئی برداشته و بطور مساوی در سه لولـه سانتریفوژ ریخته شد و با دور g1000 برای مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید. سپس قسمت روئی دور ریخته و رسوب‌ها با ml5 محیطهای کشت DMEM/Ham`s F12 و RPMI و Ham`sF10 حاوی پنی‌سیلین IU/ml100 و استریتومایسین mg/μl100 (Sigma,USA)، 5/2% سرم جنین گوساله (GIBCO,Germany) و 5/2% NU سرم (GIBCO,Germany) به حالت تعلیق درآمدند. لازم به ذکر است محیط Ham`s F10 علاوه بر مواد فوق شامل کلسیم لاکتات 5/2% و بی‌کربنات سدیم بود. سپس سلولـها به داخل فلاسکml25 ریخته شدند و داخل انکوباتور با دمای oc 37، حاوی Co25% به مدت 3 روز بدون تکان دادن قرار گرفتند. فلاسک‌ها سپس در روز چهارم به وسیله میکروسکوپ نوری بررسی و همزمان با مشاهده جزایر یا تکه‌های سلولی چسبیده به فلاسک محیطهای کشت تعویض شدند. همزمان با تشکیل پوشش تک لایه‌ای سلولی (حدود روز هفتم) سلولـها به داخل فلاسک دیگری پاساژ داده شدند. میزان موفقیت جداسازی سلولـهای اپی‌تلیال از سایر سلولـهای لولـه رحمی به وسیله میکروسکوپ با فاز کنتراست (Olympus,Japan) یا ایمنوهیستوشیمی بررسی شد.
3- پاساژ سلولی
ابتدا محیط کشت داخل فلاسک خارج شد و سپس سلولـهای داخل فلاسک در مجاورت ml3-2 از محلول تریپسین 25/0% (Merck,Germany) قرار گرفتند و به مدت 2 دقیقه در دمای oC37 انکوبه شدند. بعد از جداشدن سلولـها از کف فلاسک سوسپانسیون سلولی به مدت 5 دقیقه با دور g1500 سانتریفوژ شد. سپس سلولـها با HBSS دو بار شستشو شد تا آنزیمهای تریپسین فعال حذف گردد. پس از آن روی رسوب سلولی محیط کشت اضافه شد و بعد از گذشت 5-4 روز، سلولـهایی که در طی عمل آنزیم تریسپین از سطح فلاسک جدا شده بودند به تدریج اتصالات خود را به سطح پلیت ایجاد کرده و سلولـها شروع به رشد و تکثیر نمودند. در این مطالعه تا 4 مرحله پاساژ سلولی انجام گرفت.
4- کشت پولاریزه سلولهای اپی‌تلیال لولـه رحم
نوع Insert HA Milli Cell با پرزهای mm5/0 (Millipore,USA) در داخل پلیت کشت 24 حفرهای گذاشته و حدود ml200 از ماتریکس خارج سلولی (Matrigel) (Uniscience Collaborative Biomedical Products, Bedford,USA) داخل میلیسل ریخته و بعد ml 500 سوسپانسیون سلولـهای اپی‌تلیال روی ماتریژل قرارداده شد و ml5/0 محیط کشت در اطراف میلیسل ریخته شد تا محیط کشت از طریق سوراخهای قسمت تحتانی میلیسل به سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم برسد. سپس پلیت در یک انکوباتور با CO2 5% و O295% و درجه حرارت 0c37 گذاشته و 72 ساعت بعد محیط کشت تعویض شد. سلولـها به مدت 7 روز کشت داده شدند و سپس زیر میکروسکوپ نوری (Ziss-Germany) مورد مطالعه قرار گرفتند.
5- نوع سلول کشت داده شده :
میزان موفقیت جداسازی سلولـهای اپی تلیال از سایر سلولـهای لولـه رحمی به وسیله میکروسکوپ با فاز کنتراست یا ایمنوهیستوشیمی بررسی شد.
1-5- روش ایمونوهیستوشیمی(15):
تمام مواد شیمیایی بکار رفته در این آزمایش از Sigma تهیه شده است. سلولـهای منولایر اپی‌تلیال اولیه و پاساژ داده شده برای سایتوکراتین و ویمنتین رنگ‌آمیزی شدند تا طبیعت اپی‌تلیالی آنها تأئید گردد. نیمی از سلولـها برای شناسایی سایتوکراتین (تعیین مورفولوژی اپی‌تلیال) و نصف دیگر از سلولـها برای شناسایی ویمنتین (تعیین مورفولوژی فیبروبلاستیک) رنگ‌آمیزی ایمنوشیمی شدند. ابتد محیط سلولـها تعویض شد و سپس سلولـها به مدت 5/1 دقیقه با محلول50:50 استن و متانل مجاور و با بافرتریس M05/0 در سالین ایزوتونیک M15/0 شستشو داده شد. پس از آن سلولـها با آنتیبادی اولیه سایتوکراتین با رقت1:400 و آنتی ویمنتین با رقت 200: 1 که توسط بافرتریس رقیق شده بودند را به مدت 2 ساعت در دمای آزمایشگاه انکوبه و سپس با بافر تریس در رقت 20: 1 از آنتیبادی ثانویه ضد موشی (DAKO, DK-2600 Glostrup, Denmark) تهیه و به مدت 30 دقیقه انکوبه شد تا از هر گونه واکنش متقاطع جلوگیری شود. محلول آنتی‌آلکالین فسفاتاز موشی که حاوی یک محلول سوبسترا/رنگ شامل mg2 نفتول فسفات ، ml2/0 دی‌متیل فرمامید ، ml10 محلول لوامیزول M1 و mg10 TR Fast Red Salt بود و در ml10 بافر تریس تهیه شده بود به مدت 15 دقیقه انکوبه شد و سپس از محلول رقت 1:40 در بافرتریس تهیه شد و سلولها بعد از شستشو به مدت 30 دقیقه با آن انکوبه شدند. و سرانجام سلولـها با تریس شسشتو داده شد و بعد با Gill,s Haematoxylin به مدت 1 دقیقه انکوبه و بعد بر روی لام قرار داده شدند و توسط میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی قرار گرفتند.
6- قابلیت زیست و کیفیت سلولـها
1ـ 6 ـ بررسی مورفولوژیک سلولـها با میکروسکوپ نوری:
سلولـها در زیر میکروسکوپ به صورت کشت منولایر و کشت پولاریزه کاملاً شفاف می‌باشند و نور را از خود عبور می‌دهند. در صورتی که سلولـهای غیر طبیعی و در حال مرگ به صورت تیره و با گرانولهای داخلی کاملاً مشخص دیده می‌شوند که در اینصورت مسلم است که سلولـها وارد فاز مرگ شدهاند.
2ـ6ـ روش رنگ سنجی(16):
از محلول ذخیره mg/ml5 قرمز خنثی (3- آمینو 3-7- دی‌متیل‌آمینو 2- متیل فنازین هیدرو کلراید)
(Merck-Germany) با رقت mg/ml 40 در آب مقطر تهیه و به مدت یک شب در انکوباتور oC37 قرار داده شد. سپس لولـه حاوی قرمز خنثی به مدت 10 دقیقه با دور g1500 سانتریفوژ گردید تا رسوب‌های کریستالی از محیط رنگ خارج شود. از محلول روئی رنگ برای انجام آزمایشات استفاده شد. پس از آن محیط رویی سلولـها به آرامی خارج و μl200 از رنگ قرمز خنثی به آن اضافه و به مدت 3 ساعت انکوبه شدند (سلولـهای زنده، رنگ قرمز خنثی را توسط لیزوزمهای غشاء سیتوپلاسمی سلول جذب می‌کند و بعد از ثابت‌کردن سلولـها با فرمالدئید و لیز سلولی با اتانل و اسید استیک میزان رنگ آزاد شده از سلولـهای زنده توسط دستگاه الایزاریدر در طول موج nm540 خوانده شد و آنگاه درصد سلولـهای زنده نسبت به مرده محاسبه گردید.
3ـ6ـ روش رنگ‌سنجی Trypan blue (16):
تریپان بلو ((Merck-Germany 4/0% در PBS تهیه شد. ابتدا سلولـها در معرض تریپسین قرار داده شد و سوسپانسیون سلولی به نسبت 1:1 (رقت سلول به تریپان بلو) تهیه گردید و بر روی لام نئوبار قرار داده شد. با شمارش تعداد سلولـهای مرده توسط میکروسکوپ، نسبت سلولهای مرده به کل سلولـهای موجود و درصد سلولـهای زنده محاسبه گردید.
7- بررسی محیطهای کشت مخلتف بر روی قابلیت حیات سلولـهای لولـه رحم انسان:
قابلیت زیست سلولـهای لولـه رحمی در محیطهای کشت ROMI-1640, DMEM/Ham`s F12 و Ham`s F10 در مرحله کشت اولیه و پاساژ بوسیله رنگ‌آمیزی حیاتی مورد مطالعه قرار داده و مقایسه شد.
8- تهیه جنین های اضافه وارزیابی آنها از نظر مورفولوژیکی:
تعداد 210 جنین اضافه از بیماران تحت درمان با IVF یا ICSI تهیه شد. از تمام بیماران رضایتنامه کتبی برای استفاده از جنینهای اضافه آنها دریافت شد. در این بیماران برای تحریک تخمک گذاری از پروتوکل طولانی GnRHa (Buserelin, Hoechest) وHMG (Pergonal, Serono) استفاده گردید. پاسخ به درمان به وسیله سونوگرافی لگنی واژینال با دستگاه (Aloka-SD900-Japan) و اندازه‌گیری مکرر میزان استرادیول سرم پی‌گیری شد. تخمک گذاری بوسیله 10000 واحد HCG بطور عضلانی تحریک گردید. 36 ساعت بعد تخمکها با هدایت سونوگرافی جمع‌آوری شد. پس از انجام IVF یا ICSI باروری اووسیت 20-16 ساعت بعد از تلقیح به وسیله وجود دو پرونوکلئوس تأیید شد. 48 ساعت بعد، بعد از جمع آوری تخمک، حدود 4 جنین 4-8 سلولی به داخل رحم منتقل گردید و بقیه جنینها پس از ارزیابی آنها از نظر مورفولوژی و عدم درخواست زوج برای منجمد‌کردن جنینهای اضافه، امکان استفاده این جنینها، برای تحقیقات بعدی فراهم شد.
9- بررسی محیطهای کشت مختلف بر روی تکوین جنینهای انسان:
جنینهای اضافی بدست آمده ابتدا از نظر مورفولوژی بررسی و پس از درجه‌بندی، در محیطهای کشت DMEM/Ham`sF12, RPMI-1640, Ham`sF10 قرار داده شدند و مراحل رشد وتقسیم آن تا مرحله بلاستوسیست توسط میکروسکوپ اینورت لوپ در زمانهای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفتند.
نتایج با استفاده از آزمون مجذور کا و با 05/0P< مورد ارزیابی قرار گرفت.
کیفیت و نوع سلول طی کشت اولیه و پاساژ سلولـهای آمپول لولـه رحم:
مشاهده کشت اولیه سلولـهای آمپول لولـه رحم توسط میکروسکوپ اینورت Phase-Contrast در روز 7-6 نشان داد که سلولـها بسیار متراکم هستند و الگوی اپی‌تلیوئیدی دارند و حرکت مژکها قابل رؤیت می‌باشد. همچنین چندین توده سلولی در حال تقسیم میتوز دیده شد. هیچ رابطهای بین رشد و کیفیت سلول در محیط آزمایشگاه با سن بیمار و مرحله سیکل قاعدگی مشاهده نشد. سلولـهای جمع‌آوری شده در مرحله فولیکولی و ترشحی همگی ظاهر اپی‌تلیوئیدی در کشت اولیه داشتند. (شکل شماره 1) بررسی ایمنوهیستوشیمی انجام شده در کشت اولیه نشان داد که اکثریت (98%) سلولـهای کشت داده شده از نوع اپی‌تلیالی بوده و درصد سلولـهای استروما بسیار اندک می‌باشد (شکل شماره 2).
سلولـها تا چندین پاساژ (چهار پاساژ در این مطالعه) قادر به زنده ماندن بودند. در طی پاساژها زمان لازم برای تشکیل حالت پوشش سلولی تک لایه حدود 4 روز بود. مورفولوژی سلولـها با ادامه پاساژ تغییر می‌کرد. بطوریکه در پاساژ اول، سلولـها اپی‌تلیوئیدی بودند در صورتی که در پاساژ دوم و سوم سلولـها شبیه سلولـهای فیبروبلاست بودند که ظاهری دراز، دوکی شکل با چندین زائده سیتوپلاسمیک دراز داشتند.
کشت پولاریزه سلولـهای آمپول لولـه رحم انسان:
سلولـهای اپی‌تلیالی در کشت منولایر از نظر ساختمانی بصورت پهن، اپی‌تلیوئیدی و سنگفرشی بودند و تا زمانیکه تمام سطح پلاستیک را اشغال کنند به رشد خود ادامه دادند و میتوز فراوان داشتند. در صورتیکه سلولـها در کشت پولاریزه میتوز محدود و پولاریزه داشتند و مانند حالت in vivo تمام سطوح فوقانی، تحتانی، جانبی سلولـها از همدیگر قابل تشخیص بود.
قابلیت زیست سلولـها در محیطهای کشت مختلف:
نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی حیاتی نشان داد که قابلیت حیات سلولـها در طی کشت اولیه سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم در محیطهای کشت RPMI-1640 DMEM/F12 و Ham`s F10 به ترتیب 8/99%، 95% و 93% بود که بطور معنی‌داری محیط کشت DMEM/F12 نسبت به دو محیط دیگر ارجحیت داشت. ولی پس از پاساژ سلولی و کشت سلولـها و انجام کشت پولاریزه تفاوت معنی‌داری در قابلیت حیات بین محیطهای کشت مختلف دیده نشد.
مقایسه میزان رشد و تکامل جنینهای 8-4 سلولی در محیطهای کشت مختلف:
میزان رشد و تکامل جنینهای 4-8 سلولی در جدول شماره 1 نشان داده شده است. درصد جنینها 8-4 سلولی که پس از 72 ساعت به مرحله 8 سلولی (مورولا) رسیدهاند بطور معنی‌داری در محیط Ham`sF10 ( 05/0P<) نسبت به محیط DMEM/F12, RPMI-1640 بیشتر بود(شکل شماره 3). تنها 6 مورولا (1/5%) جنینها در محیط Ham`sF10 به مرحله بلاستوسیست رسیده بودند و در محیطهای DMEM/F12 و RPMI-1640 هیچ جنین 8-4 سلولی به مرحله بلاستوسیست نرسیده بود. تفاوت معنی‌داری بین محیطهای کشتRPMI-1640 و DMEM/Ham`sF12 در تکامل جنین 8-4 سلولی به مرحله مورولا و بلاستوسیست دیده نشد(05/0P>).
در این مطالعه به منظور ایجاد شرایطی مناسب و مشابه با داخل بدن برای رشد و تکامل جنین قبل از لانه‌گزینی، سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم به دو روش منولایر و پولاریزه کشت داده شدند و قدرت حیات و کیفیت آنها بعد از کشت اولیه و چند بار پاساژ سلولی با محیطهای مختلف کشت مقایسه شد. با توجه به اینکه لقاح و مراحل تکاملی رشد جنین تا مرحله بلاستوسیت در داخل لولـه رحم رخ می‌دهد و سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم گلیکوپروتئین خاصی تولید می‌کند که مانع توقف تکاملی جنین در مرحله 4-8 سلولی میشود(17) و بعلاوه تماس و میانکنش بین جنین و سلولـهای لولـه رحم باعث تکامل جنین میشود(18). اخیراً نشان داده شده که چندین فاکتور مفید برای رشد جنین مانندCSF-1 ، LIF ،EGF ، IL-2 به وسیله سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم تولید میشود(19-20). بنابراین به منظور رسیدن به حالت فیزیولوژیک و مشابه با داخل بدن، در این مطالعه از سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم انسان استفاده شد. اگر چه مطالعات مختلف نشان داده است که کشت همزمان با استفاده از سلولـهای با منشأ لولـه رحمی (13) و غیر لولـه رحمی (11-12) هر دو قادر به بهبود رشد و تکامل جنین در محیط آزمایشگاهی می‌باشند؛ ولی مطالعه مقایسه‌ای بین تأثیر سلولـهای با منشأ لولـه رحمی و غیر لولـه رحمی بر روی تکامل جنین در محیط آزمایشگاه صورت نگرفته است. بعلاوه استفاده از سلولـهای لولـه رحم حیوانی از نظر اخلاقی مطلوب نبود زیرا خطر انتقال بیماری‌های ناشناخته حیوانی به جنین یا مادر وجود دارد.
در این مطالعه از لولـه رحمی غیرپاتولوژیک استفاده شد. زیرا محیط پاتولوژیک لولـه رحم در هیدروسالپنکس میزان حاملگی را کاهش و سبب افزایش سقط جنین میشود که ممکن است به دلیل عملکرد و ترشحات مضر سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم باشد(21).
بهترین حالت برای داشتن شرایطی مشابه با داخل بدن استفاده از کشت لولـه رحم دست نخورده می‌باشد. اگر چه بافت از نظر ساختمانی در این روش تغییر نمی‌کند ولی بدلیل عدم پرفیوژن و نرسیدن محیط کشت به قسمتهای مرکزی، بافت سریعاً نکروزه شده و از بین می‌رود. لذا استفاده از این مدل در سیستم کشت همزمان مقدور نبوده است؛ زیرا نیاز دارد که سلولـها حداقل 6-5 روز در محیط کشت زنده باقی بمانند تا جنین به مرحله بلاستوسیت برسد. لذا ما در این مطالعه از کشت سلولی منفرد (منولایر و پولاریزه) استفاده نمودیم.
این مطالعه نشان داد که در کشت اولیه بدون در نظر گرفتن زمان انجام بیوپسی (مرحله فولیکولی یا ترشحی سیکل قاعدگی) بطور موفقیت آمیزی در روز 6-7 پوشش تک لایه سلولی ایجاد میشود و سلولـها قادر به زنده ماندن بمدت طولانی می‌باشند. اکثر سلولـها در این کشت منشأ اپی‌تلیوئیدی داشتند که بعد از پاساژهای سوم و چهارم سلولـها از حالت اپی‌تلیوئیدی بحالت فیبروبلاستی تبدیل شدند. این نتایج با یافته‌های Yeung و همکاران (22)، Bongso و همکاران (23) و Takeuchi و همکاران (24) که به ترتیب از محیطهای RPMI/1640, DMEM/F12 و Ham`sF10 برای رشد و تکثیر سلولهای اپی‌تلیال لولـه رحم انسان استفاده نمودند مطابقت داشت. لذا با توجه به تغییر ماهیت و مورفولوژی سلولـها در طی پاساژهای مختلف بهتر است از پاساژهای سوم به بعد برای کشت همزمان استفاده نشود.
سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم از دو نوع مشخص مژک‌دار و ترشحی می‌باشند(25). این مطالعه نشان داد که در مرحله کشت اولیه سلولی هر دو سلول مژک‌دار و ترشحی دیده میشود که با ادامه پاساژ سلولی، سلولـهای مژک‌دار، مژک خود را از دست می‌دهند و تبدیل به نوع ترشحی می‌شوند یا در آزمایشگاه می‌میرند و اجازه می‌دهند که نوع ترشحی در پاساژهای اول به بعد اکثریت سلولـها را تشکیل دهند. احتمالاً بدلیل فقدان نقش فیزیولوژیک برای انتقال تخمک و جنین در محیط آزمایشگاه و فقدان حرکات پریستالتیک لولـه رحم، سلولـهای مژک‌دار عملکرد خود را از دست داده و نقش ترشحی به خود می‌گیرند. همچنین با توجه به اینکه مژک‌سازی در سلولـهای اپی‌تلیال در انتهای فاز فولیکولی سیکل قاعدگی به دنبال افزایش میزان هورمون استروژن ایجاد میشود(26). فقدان این هورمون در محیط آزمایشگاه ممکن است سبب از دست رفتن مژک این سلولـها شود. به نظر می‌رسد سلولـهای ترشحی در حضور مواد مغذی موجود در محیط کشت خیلی فعال می‌باشند و ترشحات زیادی را داخل محیط آزاد می‌کنند؛ لذا بهتر است سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم برای انجام کشت همزمان را بعد از پاساژ اولیه استفاده کرد.
این مطالعه همانند مطالعة قبلی ما نشان داد که سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم در هنگام کشت بر روی پلاستیک، مورفولوژی پولاریزه خود را از دست می‌دهند. مطالعه قبلی نشان داده بود که سلولـهای اپی‌تلیال اندومتر در کشت منولایر، مورفولوژی پولاریزه خود را از دست می‌دهد(27). با توجه به اینکه علت پولاریزه شدن سلولـهای اپی‌تلیالی اتصال مولکلولـهای چسبنده سلولی (اینتگرین) به ماتریکس خارج سلولی (ECM) می‌باشد(28) لذا در این مطالعه به منظور تولید سلولـهای پولاریزه اپی‌تلیال لولـه رحم مشابه با حالت in vivo، سلولـهای لولـه رحمی پس از پاساژ سلولی بر روی ECM کشت داده شد تا سلولـهای اپی‌تلیالی پولاریزه به دست آید. با توجه به اینکه مورفولوژی سلول با عملکرد آن ارتباط دارد(27)؛ احتمالاً استفاده از سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحم پولاریزه نسبت به غیر پولاریزه در کشت همزمان ارجحیت خواهد داشت.
یکی از مشکلات مهم در کشت همزمان عدم وجود محیطی مناسب برای کشت همزمان سلولـهای لولـه رحم و جنین می‌باشد. برای مثال محیطی که معمولاً برای سلولـهای لولـه رحمی مناسب است برای جنین نامناسب بوده و عکس آن هم معمولاً دیده میشود(29). بدین منظور در این مطالعه استفاده از محیطهای متداول کشت برای سلولـهای لولـه رحمی و اثرات آنها را ابتدا بر روی سلولـهای لولـه رحمی در مرحله کشت اولیه و پاساژهای سلولی در حالت منولایر و پولاریزه بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که بهترین محیط کشت برای مرحله اولیه کشت و پاساژ اولیه سلولـها به ترتیب DMEM/ F12 (با قابلیت حیات تقریباً 100%)، RPMI-1640 (با قابلیت حیات 95%) و Ham`s F10 (با قابلیت حیات 93%) می‌باشد؛ ولی در طی پاساژهای دوم، سوم و چهارم سلولـها در محیط کشت منولایر و پولاریزه تفاوت معنی‌داری بین محیطهای کشت مختلف دیده نشد(05/0P<). مطالعات مختلف نیز بر مناسب بودن محیط کشت DMEM/ F12 بر رشد و تکثیر سلولـهای اپی‌تلیال لولـه رحمی دلالت می‌کند(29-30). بررسی اثر همین محیطهای کشت بر روی تکوین جنینهای 4-8 سلولی نشان داد که Ham`s F10 به طور معنی‌داری بهتر از RPMI- 1640, DMEM/ F12 بود.
بطوریکه 93% جنینها پس از 72 ساعت به مرحله مورولا رسیده بودند که این نتایج در مقایسه با نتایج Feng و همکاران (31) بهتر می‌باشد. Feng و همکاران اثر Ham`s F10 بعلاوه سرم انسانی را بر روی اووسیت‌های بارورشده انسان مطالعه کرده و نشان داده‌اند که بعد از 72 ساعت 45% جنینها به مرحله مورولا می‌رسند. علت این تفاوت شاید بدلیل تفاوت در نوع بیماران با کیفیت تخمک و اسپرم یا محیط آزمایشگاه باشد. لذا پیشنهاد میشود ابتدا از محیط کشت DMEM/ F12 برای تکثیر و پاساژ سلولـها استفاده کرده و در هنگام قراردادن جنین، محیط کشت از DMEM/F12 به Ham`s F10 تغییر داده شود.
مؤلفین مقاله از معاونت تحقیقات و فناوری وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی به دلیل تأمین اعتبار طرح و از مسئولین اطاق عمل بیمارستان میرزاکوچک‌خان به دلیل تهیه بافت لولـه رحم تشکر و قدردانی می‌کنند.
