سلولهای بنیادی سلولهایی هستند که حداقل با دو مشخصه تقسیمات مداوم وقدرت تمایز بالا، مشخص می‌شوند؛ بطوریکه این سلولها قادرند تا انواعی از سلولهای تمایز یافته را در محیط آزمایشگاهی به وجود آورند که این مشخصه را پرتوانی می‌نامند. از جمله سلولهای پرتوان می‌توان سلولهای بنیادی جنینی(ES) را نام‌برد. سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی(ICM) بلاستوسیستها (2،1) و یا از جمعیت سلولی پرتوان اکتودرم اولیه بلاستوسیستهایی بدست می‌آیند که لانه‌گزینی آنها به تأخیر افتاده است(3).
تا کنون تولید رده‌های سلولی پرتوان جنینی، ازمهره‌دارانی غیر از موش، نظیر ماهیان(5،4)، جوجه (7،6)، خرگوش(9،8)، موش بزرگ آزمایشگاهی (10)، هامستر(11)، خوک (13،12)، گاو(14)، گوسفند(15) و میمون رزوس(6) گزارش شده است. بالاخره در سال 1998، تولید سلولهای بنیادی جنینی انسان نیز از بلاستوسیستهای انسانی گزارش شد(17). با توجه به توان تکثیر دائم و قابلیت تمایز بالای سلولهای بنیادی جنینی، این سلولها در طب پیوند ، تحقیق و توسعه داروسازی، مطالعات ژنتیکی، تولید حیوانات با خصوصیات تغییر یافته ژنتیکی و مطالعات زیست‌شناسی تکوینی حائز اهمیت می‌باشند. به گونه‌ای که می‌توان با افزودن القاءگرهای مناسب، این سلولها را در جهت خاصی تمایز داد. این موضوع گذشته از آنکه ما را نسبت به القاءگرهای مناسب، غلظت و زمان افزودن آنها آشنا می‌کند سبب حصول منبع نامتناهی از انواع سلولهای تمایز یافته برای پیوند می‌شود. بطوریکه با انتقال سلولهای تمایز یافته مولد انسولین و یا نرونهای حاصل به ترتیب به موشهای دیابتی و یا پارکینسونی علائم بهبود در آنها گزارش شده است(18،19). حتی در شرایط مناسب می‌توان فردی کامل را از سلولهای بنیادی جنینی ساخت که این موضوع تاکنون تنها از سلولهای بنیادی جنینی موشی گزارش شده و از سلولهای بنیادی جنینی سایر مهره‌داران گزارش نشده است.
بیشتر رده‌های سلولهای بنیادی جنینی موجود از موش همخون نژاد 129 می‌باشند که گزارشات موجود نشان می‌دهد که تولید حیوانات ترانس ژن و یا موشهای ناک اوت (موشهایی که یک ژن آنها از کار افتاده است) با آن دارای اشکالاتی است(22ـ20). لذا علاقمندی به تولید سلولهای بنیادی جنینی از موشهایی با نژاد دیگر بیشتر می‌باشد. لذا به منظور حصول فن‌آوری تولید و کشت سلولهای بنیادی جنینی در کشور، در این مطالعه تولید رده‌های جدیدی از سلولهای بنیادی جنینی موشی نژاد Balb/c انجام شده و پرتوانی آنها نیز با استفاده از روشهای رایج در محیط آزمایشگاهی نشان داده شده است.
- سلولهای تغذیه کننده جنین‌ها و سلولهای‌بنیادی جنینی: از سلولهای فیبروبلاستی جنین 13 روزه موش (MEF) نژاد MTK-Neo به عنوان سلولهای تغذیه‌‌کننده استفاده شد. تقسیم این سلولها تحت تیمار مایتومایسین-C (USA ، M0503 ،Sigma) و با غلظتμg/ml 10 و به مدت 5/1 ساعت متوقف شد.
سلولهای MEF در محیط کشــــت DMEM (UK،12800 , Gibco) حاوی 15% سرم جنین گاوی (FCS) (Australlia، 010-15-0500v، Multiser) بلاستوسیستهــــای 5/3 روزه حاصـــل از مــــوش Balb/c روی سلولهــــــای MEF کـــه تقسیـــم آنهـــــا متوقــف شــــده بـــود، کشـــــت شدنـــد. محیــــط کشـــت بـــرای کشت بلاستوسیستهــــا و سلولهــــای بنیـــادی عبــارت بود از: Knockout DMEM (UK،018-10829 , Gibco)، 15%FCS (UK،079-16141،Gibco) M μ100 بتامرکاپتواتانول (UK،M7522،Sigma) گلوتامیـن mM2 (UK،149-25030،Gibco) اسیدهای آمینه غیرضروری mM1/0 (USA،M7145 , Sigma) و فاکتــــــــــــــور ممانعت‌کننده لوکمیایی (LIF) (Austria،ESGRO،Chemicon) به محــــیط کشت مـــــزبور IU/ml1000 و یا IU/ml5000 LIF اضافه گردید.
توده سلولی داخلی (ICM) بلاستوسیستها به روش مکانیکی در روز چهارم کشت و با کمک پیپت جدا شد. سپس ICM حاصل یا تحت تیمار تریپسین /EDTA (UK،Gibco,25300-054) قرار گرفتند و در همان روز روی MEF کشت شدند (پروتکل اول)(25-23) و یا پس از جداسازی، روی MEF جدید کشت شده و در روز بعد تحت تیمار تریپسین /EDTA (Gibco,15305-014-UK) قرار گرفتند(پروتکل دوم)(26). این کشتها در ظروف 48 خانه (USA،Costar) انجام شد. پس از هشت روز مجدداً، سلولها پاساژ داده شدند و بدنبال آن کلونیهای با مورفولوژی ES مشاهده و به ظرفهای 6 خانه پاساژ داده شدند. کلونیهای ES به صورت متراکم، سه بعدی و با کناره صاف بودند. سلولها از هم قابل تفکیک نبودند؛ ولی هسته سلولها مشخص و حاوی یک تا سه هستک تیره بود.
- مشخصات سلولهای بنیادی جنینی تولیدی: به غیر از خصوصیات مورفولوژیکی سلولهای بنیادی جنینی تولید شده، این سلولها از نظر خصوصیات دیگر مورد ارزیابی قرار گرفتند که روش کامل آنها قبلاً بیان شده است(27). اما به اختصار برای آنالیز کاریوتیپی سلولهای ES تولیدی، آنها تحـت تیمار کلسمید mg/ml)05/0) (USA،Sigma,D7385) قرار داده شدند و سپس سلولها در معرض محلول هیپوتونیک 6/5% KCl قرار گرفتند و پس از تثبیت در محلول متانول و اسید استیک (3:1) بر لام گسترش داده و با گیمسا 5% رنگ‌آمیزی شدند.
همچنین برای تعیین جنسیت و آنالیز بیشتر کروموزومی از نواربندیC- استفاده شد؛ زیرا سانترومر کروموزوم Y رنگ نمی‌گیرد. بدین ترتیب که پس از تیمار کلسمیدی، سلولها در معرض محلول هیپوتونیک سیترات سدیم 8/0% قرار گرفتند و پس از تثبیت مطابق روش استاندارد رنگ‌آمیزی شدند(23).
فعالیت آلکالین فسفاتاز سلولها مطابق روش موجود در کیت (Sigma-USA) انجام شد. این آنزیم در سلولهای تمایز نیافته بیان می‌شود. محلول نمکی دیازونیوم شامل ml1/0 از محلول نیتریت سدیم (4-91) و ml 1/0 محلول آلکالین-ERV (2-86) تهیه شده پس از دو دقیقه ml 5/4 آب بدون یون به آن اضافه شد. به دنبال آن ml1/0 از محلول آلکالین AS-B1 (1-86) اضافه شد و سپس مخلوط گردید. از سوی دیگر سلولها را در بافر سیتراتی استن (شامل ml25 محلول سیترات، ml65 استن و ml8 فرمالائید 37%) برای مدت 30 ثانیه و در دمای 26-18 درجه سانتی‌گراد تثبیت شدند. سلولها با آب بدون یون به مدت 45 ثانیه شستشو شدند و سپس محلول فاز قبل در تاریکی به سلولها افزوده شد. بعد از 15 دقیقه سلولها به مدت 2 دقیقه شسته شدند.
تعیین جنسیت رده‌های سلولی تولیدی به غیر از نواربندیC- با استفاده از PCR ژن SRY (ژن تعیینکننده بیضه) و پرایمرهای آن، پس از استخراج DNA با کیت(USA) Qiagene انجام شد. در گروه کنترل PCR بجای DNA آب اضافه شد. همچنین ازDNA استخراج‌شده از دم موشهای نر و ماده Balb/c به عنوان گروههای کنترل مثبت و منفی استفاده شد.
برای ارزیابی بیان پروتئین Oct-4 که یک فاکتور رونویسی است و به عنوان عاملی مهم در شناسایی سلولهای پرتوان می‌باشد(28) از روش RT- PCR استفاده گردید. برای انجام این ارزیابی، RNA سلولهای ES تولیدی با استفاده از RNAzol B (Tel-Test Inc., USA) استخراج شده و سپس ساخت cDNA با کمک پرایمرهای هگزامر تصادفی و آنزیم ترانس کریپتاز معکوس (Gibco-UK) انجام شد. ازS rRNA 18 به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شد. سپس PCR با استفاده از پرایمرهای ژن Oct-4 انجام‌شد.
- تولید سلولهای بنیادی جنینی: داده‌های حاصل از جداسازی سلولهای بنیادی جنینی از بلاستوسیست موشهای نژاد Balb/c در جدول شماره 1 آمده است. در مجموع سه رده سلولی با مورفولوژی سلولهای بنیادی جنینی از 68 توده سلولی داخلی (ICM) جدا شده با روش مکانیکی دوم یعنی جداسازی ICMدر روز چهارم و سپس قراردادن آنها در معرض آنزیم تریپسین در روز بعد، بدست آمد (4/4%). تمام رده‌ها از غلظت اولیه LIF IU/ml5000 حاصل شدند. اما از روش اول جداسازیICM (جداسازی ICM در روز چهارم و سپس قراردادن در معرض آنزیم تریپسین در همان روز) رده ES تولید نشد. مورفولوژی سلولهای بنیادی جنینی بر اساس کلونیهای متراکم پرسلولی بود که کناره کلونی‌ها صاف و سلولها در آن قابل تفکیک نبودند و تنها هسته‌ها که یک تا سه هستک تیره داشتند، قابل مشاهده بودند(شکل 1). سلولهای تمایز یافته که دارای مرفولوژی فیبروبلاستی بودند پاساژ داده نشدند. تا کنون رده‌های ES تولیدی تا 8 بار پاساژ داده شده‌اند و طی این مدت حالت غیرتمایزی خود را حفظ کرده و به تکثیر خود ادامه داده‌اند.
رده‌های حاصل تحت عنوان رویان C1، رویان C2.3 و رویان C3 نامگذاری شدند (حرف C اشاره به نژاد Balb/c و شماره، اشاره به ترتیب تولید آنها دارد). آزمونهای دیگر که خلاصه آنها در جدول شماره 2 آمده است نشان می‌دهد که رویان C1 و رویان C3 دارای مشخصات سلولهای بنیادی جنینی است. بطوریکه مطالعه خصوصیات کاریوتیپ ساده و نواربندی C این سلولها نشان داد که رویان C1 و رویان C3 دارای کاریوتیپ طبیعی دیپلویید (40 کروموزومی) هستند(شکل شماره 3). اما رده سلولی رویان C2.3 به صورت تتراپلویید (80 کروموزومی) است. مطالعه نواربندی C کروموزومهای رده‌های حاصل موید نربودن همه‌رده‌های تولیدی بود؛ زیرا سانترومر کروموزوم Yرنگ نمی‌گیرد(شکل شماره 4). گذشته از این، انجام واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) بر ژن تعیینکننده بیضه (SRY) مؤید آن بود که تمام رده‌های تولیدی نر می‌باشند(شکل شماره 4).
آزمون آلکالین فسفاتاز نشان داد که تمام رده‌های تولیدی و همچنین رویان C2.3 نیز که پلی‌پلویید است بیان‌کننده آلکالین فسفاتاز می‌باشند (شکل شماره 5). از سوی دیگر بررسیRT-PCR برای ژن Oct-4 نشان داد که تمام رده‌های سلولی نیز OCt-4 را بیان می‌کنند (شکل شماره 6).
نتایج این مطالعه نشان داد که سه رده سلولی از موش نژاد Balb/c با مورفولوژی سلولهای بنیادی جنینی به دست آمد که دارای قابلیت تکثیر بودند. تمام سلولهای بنیادی جنینی تولیدی باید دارای خصوصیات زیر باشد: از توده سلولی داخلی (ICM) و یا اپی‌بلاست بلاستوسیست مشتق شده باشد؛ دارای توان تقسیم نامحدود و بدون تمایز باشد؛ دارای کاریوتیپ طبیعی کروموزومی باشد و این حالت را حفظ نماید؛ بتواند کلونی‌زایی کند یعنی یک سلول بنیادی جنینی توان تولید یک کلونی متشکل از سلولهای با خواص ژنتیکی یکسان را داشته باشد و آلکالین فسفاتاز و Oct-4 را بیان نماید (29). بر این اساس تنها دو رده سلولی رویان C1 و رویان C3 دارای خصوصیات مذکور بودند و رویان C2.3 علیرغم داشتن تمام خصوصیات، دارای کاریوتیپ غیرطبیعی (تتراپلویید) بود. لذا اگرچه رده سلولی رویان C2.3 پرتوان است؛ ولی رده سلولی بنیادی جنینی محسوب نمی‌شود. سلولهای کارسینومای جنینی نیز که حاصل تراتوما هستند به عنوان سلولهایی پرتوان می‌باشند؛ ولی از آنجا که دارای مشکلات کروموزومی هستند و در ضمن به دلیل منشاء آنها، به عنوان سلول بنیادی جنینی مطرح نمی‌شوند. یکی دیگر از خصوصیات سلولهای بنیادی جنینی که نشان‌دهنده پرتوانی فوق‌العاده سلولها است، قابلیت تـــــولید فـــــرد زایا می‌باشد و یا به عبارتی دارای قابلیت Germ Line Transmission باشند که این آزمایش تاکنون بر سلولهای بنیادی جنینی حاصل انجام نشده است.
تاکنون رده‌های سلولهای بنیادی جنینی زیادی تولید شده که از آنها در مطالعات گوناگون استفاده گردیده است. بیشتر این رده‌های سلولی نظیر CCE(30)، D3(31)، E14(32)، AB1 (33) و R1(34) از موش نژاد 129 بدست آمده‌اند. ولی رده‌های F1/1 (35) و TT2 (36) از هیبرید بین نرهای نژاد CBA و ماده‌های نژاد C57BL/6 به دست آمده‌اند و ردهBL/6III (37) و رویان B1 و رویان B2 از نژادC57BL/6 مشتق‌شده است(27). از موش NOD نیز که به عنوان مدل جانوری بیماری دیابت نوع I استفاده می‌شود، رده سلولی بنیادی جنینی تولید شده است(38).
در این مطالعه مشاهده شد که 4/4 درصد (3:68) از توده‌های سلولی داخلی (ICM) جدا شده از بلاستوسیستها خصوصیات مورفولوژیکی سلولهای بنیادی جنینی را داشتند و در واقع تنها 9/2% (2:68) از ICM تولیدی علاوه بر خصوصیات مورفولوژیکی دارای سایر خصوصیات سلولهای بنیادی جنینی بودند. فراوانی تولید سلولهای بنیادی جنینی از Balb/c نیز قبلاً پس از انجام ایمونوسرجری (جراحی با استفاده از سیستم ایمنی) 5/2% گزارش شده است(39). به هر ترتیب تولید رده‌های سلولی‌بنیادی جنینی از این نژاد به سختی انجام می‌شود.
این در حالی است که فراوانی تولید سلولهای ES در موش نژادsv129 به مقدار 30-10% گزارش شده است (23). نژاد sv129 دارای شیوع بالایی از تراتوم بیضه‌ای یا تراتوکارسینومس است و به عنوان منبع تولید رده‌های سلولی کارسینومای جنینی بکار می‌رود (40). احتمال دارد که نژاد مزبور دارای مشخصات منحصر به فردی باشد که در نژادهای دیگر یافت نمی‌شود و سبب تولید رده‌های سلولی ESپایدار می‌شود. جدای از نژاد موش، تولید رده‌های جدید سلولهای بنیادی جنینی به مقدار زیاد به دسترس‌بودن شرایط مطلوب کشت و به مهارت تکنیکی محقق بستگی دارد. نکته مهم دیگر نحوه دستکاری سلولهای ICM برای حصول رده سلولی ES بود. این موضوع بسیار حائز اهمیت است. در حقیقت تنها بکارگیری روش دوم (26) جداسازی ICM در این نژاد یعنی جداسازی ICM از بلاستوسیست در روز چهارم کشت و سپس کشت مجدد آن بر MEF و سپس تریپسینه‌‌نمودن ICM در روز بعد، سلولهای بنیادی جنینی تولید شد. قبلاً نیز همین روشها بر ICM مشتق از بلاستوسیستهای موش نژاد C57BL/6 نیز بکار برده شد و تنها با روش اول جداسازی ICM یعنی جداسازی ICM در روز چهارم و تریپسینه نمودن آن در همان روز و سپس کشت بر MEF، دو رده سلولی بنیادی جنینی جدید تولید شد(27). شاید در اینجا نیز نوع نژاد و روش جداسازی ICM در تولید سلول بنیادی جنینی مؤثر باشد. به هرحال ممکن است مجموع این عوامل یا هر کدام از آنها در حصول نتایج مؤثر بوده است.
همچنین اگرچه در این مطالعه از دو غلظت متفاوت LIF (IU/ml5000 و 1000) استفاده شد، ولی در موش نژاد Balb/c سه رده رویانC1، رویانC2.3 و رویان C3 از غلظت IU/ml5000 بدست آمدند. ایـــــن در حالی است که در مطالعه قبلی ما تولید سلولهای بنیادی جنینی در غلظتهای IU/ml1000 و IU/ml5000 و از نژاد C57BL/6 گزارش شــــده است(27). LIF بـــــه عنوان عامل ممانعت‌کننده از تمایز، بسیار حائز اهمیت باشد(41). احتمال دارد که نوع نژاد با غلظت LIF در تولید رده جدیــــد ES حائز اهمیت باشـــد.
Kawase نیز با غلظتIU/ml LIF 5000 توانست رده‌های جدید سلولهای بنیادی جنینی ازBalb/c، C57BL/6 تولید کنند. مطالعات نواربندی C و PCR ژن SRY (ژن تعیینکننده بیضه) نشان داد که همه رده‌های سلولی ES تولیدی نر می‌باشند. این موضوع بسیار حائز اهمیت است؛ زیرا نگهداری حیوان حاصل از آن راحت‌تر است و دیگر اینکه طی پاساژهای متوالی، پایداری کروموزومی آن نسبت به سلولهای ES ماده بالاتر است؛ بطوریکه در ES ماده همانند اپی‌پلاست هر دو کروموزوم X فعال می‌باشند، در نتیجه ناپایدار هستند(42) و طی پاساژهای متوالی معمولاً یک کروموزوم X از بین می‌رود و رده سلولی ES تبدیل به کاریوتیپ XO 39 کروموزومی می‌شود. از سوی دیگر تولید حیوانی کایمرا از سلولهای ES نر راحت‌تر است. زیرا بدلیل مشارکت سلولهای ES در برآمدگی گنادی حتــی اگــر جنین میزبان ماده باشد، از آنجاکه سلولهای XXدر محیط بیضه‌ای رشــــــد نمــــی‌کنند
سلولهای زاینده حاصل ES نر بـــــوده و کایمراهـــای تولیدی نر می‌شوند(43).
بدین ترتیب نتایج این مطالعه، حصول دو رده جدید از سلولهای بنیادی جنینی موش از بلاستوسیست موش نژادBalb/c را نشان داد.
بدینوسیله نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را از تمام کسانیکه ما را در انجام این مطالعه یاری کرده‌اند اعلام می‌دارند.
