Use of spermatide for treatment of non-obstructive azoospermic patients

Akhondi, Mohammad Mehdi; Sedighi, Mohammad Ali; Amirjannati, Naser; Sadri-Ardekani, Hooman

Use of spermatide for treatment of non-obstructive azoospermic patients

Authors

Mohammad Mehdi Akhondi ¹

Mohammad Ali Sedighi ²

Naser Amirjannati ³

Hooman Sadri-Ardekani ³

¹ Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran; Embryology Department, Royan Research Center, Tehran, Iran

² Andrology Department, Royan Research Center, Tehran, Iran; Urology Department, Shariati Hospital, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran

³ Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran

Abstract

It has been shown that male factor is a common cause of more than half of the infertilities from which 10% are azoospermic patients. Despite multiple testis biopsies, any sperm for microinjection couldn’t be obtained in 40% of nonobstructive azoospermic patients. However, recent reports showed successful use of spermatids instead of mature spermatozoa for ICSI which opened a new horizon for these patients. In the present study, 67 nonobstructive azoospermia patients with no sperm in their testis biopsies were enrolled, from whom round spermatids were extracted from testis tissue and used as male gamete for ovum fertilization. The results including fertilization rate, embryo formation, transfer rate and pregnancy rate were evaluated. Patients were selected based on their history and physical examination, semen analysis, FSH assay and results of multiple testis biopsies with no sperm. Necessary information about use of spermatid as male gamete in microinjection was presented to the patients and their consent were taken. In appropriate time, female cycles were began and simultaneous to egg collection, testis biopsy was performed Mean age of male and female were 32±6.5 and 29.5±8 years, respectively. Mean size of right and left testis were 11± 1 and 10.4±0.6 mL, respectively and the mean of FSH level was 21.1±3.2 mIU/mL. From 760 collected eggs, 537 ovums were injected with spermatids and fertilization rate was 38.2%. Totally, 182 embryos (88.8%) were transferred to the uterus. One chemical pregnancy was observed and documented by ultrasonography, although it was aborted at fourth week. Based on the results of this study, the efficiency of spermatid use in azoospermic patients with no sperm in TESE as a treatment option for their infertility was doubted.

Keywords

ICSI

Non

obstructive azoospermia

Spermatid

Testicular sperm extraction

مقدمه

رشد قابل توجه تکنیک‌های پیشرفتة درمان ناباروری از جمله ICSI زمینه را برای درمان بیماران مبتلا به آزواسپرمی غیر انسدادی با استفاده از اسپرم بدست آمده از بافت بیضه (TESE) فراهم نموده است. آزواسپرمی غیرانسدادی در واقع نارسایی بیضه به دلایل مختلف است که در آن اسپرم‌سازی به طور کامل و یا تا حد زیادی متوقف گردیده و فقط کانونهای معدودی از بیضه فعال می‌باشند. در این حالت امکان مشاهدة اسپرم‌های اندک تولید شده در بیضه، در انزال وجود ندارد(1). لازمة موفقیت تکنیک TESE/ICSI وجود اسپرماتوزوآ در بافت بیضه است(2). در60% موارد آزواسپرمی غیرانسدادی مثل (توقف بلوغ اسپرم ، سندروم سلول سرتولی تنها ، آتروفی بیضه به دلیل کریپتورکیدیسم ، آزواسپرمی بعد از شیمی درمانی و سندروم کلاین فلتر ) با تکرار بیوپسی از نقاط مختلف بیضه می‌توان تعداد ناچیزی اسپرماتوزوآ بدست آورد. این تعداد اندک اسپرم با استفاده از تکنیک ICSI می‌تواند به حاملگی طبیعی منجر گردد(3). در40% باقیماندة بیماران آزواسپرم با تداوم تکرار TESE اسپرمی بدست نمی‌آید. قبل از سال 1994 امیدی برای پدر شدن این گروه از بیماران وجود نداشت؛ ولی در سال‌های بعد استفاده از اسپرماتید حاصل از بافت بیضه به منظور کاربرد آن در میکرواینجکشن تحت بررسی قرار گرفت و نتایج امیدوارکننده‌ای گزارش و به عنوان روش جایگزین جهت بیماران فاقد اسپرماتوزوآ در نمونه TESE مطرح شد. لقاح مـوفقیـت‌آمیـز بـا استفاده از اسپرماتید در حیوانات بـه ویژه موش و خرگوش که منجر به زایمان موش و خرگوش سالم و بارور گردید، گزارش شده است(4). همچنین لقاح و تقسیم جنین اولیه با استفاده از اسپرماتید در انسان بوسیلة Vanderzwalmen گزارش شده است(5). در واقع انتشار خبر حاملگی در انسان و تولد نوزاد زنده با استفاده از تزریق اسپرماتید می‌تواند به عنوان نقطة عطفی در تکامل روشهای کمک باروری(ART) محسوب ‌شود. در این ارتباط تولد یک نوزاد دختر سالم با استفاده از اسپرماتید طویل حاصل از بیضه نیز بوسیله Fishel گزارش شده است (6). Vanderzwalmen نیز تولد نوزادان سالم را با استفاده از تزریق اسپرماتید گرد و طویل گزارش نمود(7). این اطلاعات تشویق‌کننده، ما را بر آن داشت تا از اسپرماتید مردان آزواسپرمی که (به دلایل مختلف) در TESE و بیوپسی بیضه، نارسایی کامل اسپرماتوژنز داشتند به‌عنوان روش جایگزین درمان استفاده کنیم. هدف این بررسی ارائه تجربة میکرواینجکشن با استفاده از اسپرماتیدهای بدست آمده از بافت بیضه می‌باشد تا مؤثربودن آنها در لقاح تخمک و باروری زوج بررسی شود. اگر این تکنولوژی از لحاظ بالینی قابل قبول و مؤثر واقع شود، بیماران با آزواسپرمی غیرانسدادی حتی سندرم سلول سرتولی‌ تنها (SCO) و سایر شرایط همراه با توقف کامل اسپرماتوژنز مجال درمان خواهند یافت.

مواد و روشها

67 زوج تـحت درمــان نـابـاروری بـا تشخیص عـامـل مردانـه (آزواسپرمی غیر انسدادی) تحت ایـن بررسـی قـرار گـرفتند. پس از بـررسـی و معاینة بـالینـی، مطالعـه سطح FSH سـرم و انجـام بیوپسی با ارزیابی هیستولوژی و پاتولوژی و قطعیت عدم وجود اسپرم بالغ و یا اسپرماتید طویل، و قطعیت وجود اسپرماتید گرد، امکان تزریق اسپرماتید گرد در سیتوپلاسم تخمک همسران آنها به‌عنوان یکی از راههای ممکن جهت درمان ناباروری مطرح و پیشنهاد گردید. پس از مشاورة کامل و اطلاع زوجین از امکان عدم موفقیت و یا کسب موفقیت پایین در این نوع درمان، رضایت آگاهانه از اجرای این روش درمانی و همچنین تداوم درمان با این روش اخذ گردید. پس از تحریک تخمک‌گذاری، همسر بیمار جهت گرفتن تخمک پانکچر ‌شد. همزمان در روز جمع‌آوری تخمک، بیوپسی باز بیضه تحت بی‌حسی موضعی بر روی مرد انجام گرفت و پس از اطمینان از وجود تعداد کافی اسپرماتید در نمونه، تخمک‌های زن نیز جمع‌آوری ‌شد و در غیر این صورت درمان متوقف می‌گردید.تعداد بافت بیضه برداشت شده از موقعیت‌های متفاوت بیضه از 2 تا 8 نمونه متغیر بود. بافت برداشت شده از بیوپسی در محلول Ham’s F10 قرار داده شد. قسمتی از این بافت توسط دو سرنگ انسولین جدا شده و به همراه مقداری از محیط کشت، بر روی یک لام قرار داده شد و پس از قرار دادن یک لامل بر روی نمونه و فشار دادن آن جهت خارج شدن محتویات لوله‌های سمینی‌فروس، نمونه در زیر میکروسکوپ با درشتنمایی× 400 مورد مطالعه قرار گرفت. بررسی و مشاهده اسپرماتید در نمونه‌های رنگ‌آمیزی شده بسیار ساده‌تر از نمونه‌های مرطوب است. لازم به ذکـر است کـه سلـولهـای‌ اسپــرماتیـد نسـبت بـه سـایر رده‌های سلـولی اسپرماتوژنز کوچکتر بوده و بزرگتر از گلبولهای قرمز هستند. در هر صورت تشخیص و استفاده از این سلولها در تزریق داخل تخمک نیاز به تجربه و شناخت کافی از سلولها دارد. در صورت وجود اسپرماتید در نمونه، خرد کردن کامل لوله‌های سمینی‌فروس توسط دو سرسوزن انسولین انجام و سوسپانسیون حاصل پس از دوبار شستشو در محیط Ham’sF10 جهت تزریق داخل تخمکی اسپرماتید مورد استفاده قرار گرفت. شروع سیکل درمان در این زوجها با تحریک تخمک‌گذاری توسط یکی از پروتکل‌های مربوطه و بسته به وضعیت بیمار شروع و با تزریق HCG تکمیل و 36 ساعت بعد، دریافت تخمک از فولیکولها تحت راهنمایی سونوگرافی انجام و تخمک‌های بدست آمده در اختیار آزمایشگاه قرار داده ‌شد. در آزمایشگاه جنین ‌شناسی، تخمک‌ها از مایع فولیکولی جدا شده و پس از شستشوی کامل و حذف سلولهای گرانولوزا، تخمک‌ها برای تزریق داخل سیتوپلاسمی آماده شدند. در این درمان سوزن‌‌های مورد استفاده جهت تزریق اسپرم بداخل تخمک قابل استفاده نیست؛ لذا سوزنهایی به قطر دو و نیم تا سه برابر قطر سوزنهای معمولی ساخته و مورد استفاده قرار گرفت. تغییر شکل سلولهای اسپرماتید همزمان با مکش آنها به داخل سوزن نشان از قطعی بودن انتخاب اسپرماتید و زنده بودن آنها داشت. انجام تزریق اسپرماتید به داخل تخمک با تزریق اسپرم تفاوتی ندارد. بدین صورت که توسط سوزن نگهداری تخمک، تخمک نگهداری و ثابت می‌شد، به گونه‌ای که جسم قطبی در ساعت 6 و یا 12 قرار گیرد. سپس سوزن حاوی اسپرماتید مقابل تخمک‌ قرار گرفته و پس از ورود به‌ داخل آن و مکش مقدار کمی از محتویات سیتوپلاسم جهت اطمینان از پاره شدن غشاء پلاسمایی تخمک، محتویات سوزن به داخـل سیتوپلاسم تزریق می‌شـد. مشاهـده پیش هستة (PN) پس از تـزریق اسپـرمـاتید، حداکثر پس از 24 ساعت قابل ارزیابی است. در حالیکه مشاهده PN پس از تزریق اسپرم در 14 ساعت پس از لقاح امکان پذیر است. در مواردی که دو پیش هسته مشاهده شود، لقاح طبیعی قلمداد شده، جنین حاصل 48-24 ساعت پس از آن قابل انتقال به رحم می‌باشد. جنین‌های حاصل ثبت و موارد با کیفیت مناسب و قابل قبول به رحم منتقل شد و دو هفته‌ پس از آن هورمون گونادوتروپین جفتی ((HCG کلیه بیماران مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

میانگین سنی مردان مبتلا به آزواسپرمی تحت این بررسی 5/6 ± 32 سال و میانگین سنی همسران آنها 8±5/29 سال بود. میانگین حجم بیضة راست و چپ به ترتیب ml 1±11و ml 6/0±4/10 اندازه‌گیری شد. میانگین سطح FSH سرم mIU/ml 2/3±1/21 بود. نتایج بیوپسی بیضه در این بیماران که توسط پاتولوژیست گزارش شد، عبارت بودند از: توقف کامل بلوغ اسپرم در 21 نفر هـیپواسپــرمـاتوژنز - توقـف بلـوغ اسپـرم در 20 نفـر سنـدرم سلـول سرتـولــی تنهـا در 16 نـفـر و آپـلازی سلــولـهــای‌ژرمینـــال ‌در‌10نـفــر.‌در‌بـررســی‌هــای‌ سیتولوژیک با نمونه مرطوب تهیه شده از بیوپسی بیضه (TESE) این بیـماران هیچگـونه اسپرمی مشاهده نشد و لذا از اسپرماتید گرد جهت تزریق استفاده گردید. از مجموع 760 تخمک بیماران،537 عدد آن با اسپرماتید مورد تزریق قرار گرفت (جدول شماره 1). میزان لقاح تخمک‌ها (2PN)2/38% بود.درمجموع182 جنین (8/88%) به رحم انتقال داده شد. تنها یک مورد حاملگی شیمیایی مشاهده گردید که با دیدن ساک جنینی مورد تأیید قرار گرفت؛ گرچه در هفته چهارم حاملگی سقط شد.

بحث

آزواسپرمی غیرانسدادی یکی از علل نسبتاً شایع ناباروری مردان است. پاتولوژی آن از آپلازی سلولهای ژرمینال گرفته تا توقف بلوغ اسپرم به صورت کامل متفاوت می‌باشد. علل توقف اسپرماتوژنز متنوع بوده و شامل بیضه‌های نزول نکرده، سندرم کالمن ، سندرم سلول سرتولی تنها، ارکیت اوریونی (بعد بلوغ)، سندرم کلاین فلتر، شیمی‌درمانی، علل ژنتیکی و در مواردی با علل نامشخص می‌باشند. نتایج پاتولوژی دلیلی بر عدم پی‌گیری بیماران جهت درمان نمی‌باشد؛ زیرا در تمامی موارد فوق احتمال یافتن اسپرم در TESE وجود دارد (1). از آنجا که در موارد متعددی از TESE بیماران، اسپرمی رویت نشده ولی به میزان قابل قبولی اسپرماتید گزارش می‌شد و از طرفی حاملگی‌هایی ناشی از تزریق اسپرماتید گرد گزارش شده بود، لذا این مطالعه جهت بررسی امکان استفاده از اسپرماتید گرد به‌عنوان جایگزینی قابل قبول مورد ارزیابی قرار گرفت.

در 67 بیمار با آزواسپرمی غیرانسدادی، به امید دستیابی به اسپرماتوزوآ در بافت بیضه، نمونه‌های متعدد از بافت برداشته شد. در همه این موارد توقف بلوغ اسپرم در مرحله اسپرماتید دیده شد. در این مطالعه براساس گزارش پاتولوژیست توقف کامل بلوغ اسپرم و روند اسپرماتوژنز حدود 32% پاتولوژی بیماران آزواسپرم را شامل می‌شد. همچنین توقف بلوغ و کاهش اسپرماتوژنز نیز تقریباً درصد مشابهی را تشکیل می‌داد. گزارشهای متعددی از پاتولوژی بیماران آزواسپرم نشان می‌دهد که توقف اسپرماتوژنز در 4 تا 30% بیوپسی‌های این بیماران دیده می‌شود که این مطالعه تقریباً با آنها همخوانی دارد(8). بررسی انجام شده توسط همین گروه نشان داده است که گزارش پاتولوژیست از بیوپسی‌های بیضه نمی‌تواند مبنای قطعی و قابل قبول در تصمیم‌گیری درمان ناباروری باشد. بطوریکه حتی در موارد سندرم سلول سرتولی تنها و یا آپلازی سلولی ژرمینال گزارش شده توسط پاتولوژیست، اسپرم به روش TESE برای انجام میکروانجکشن قابل دست یابی بوده است(1). بدین ترتیب از یک طرف پاتولوژی بیوپسی بیضه از حساسیت کافی برای پیشگویی وجود اسپرم در بافت برخوردار نیست و از طرف دیگر شایع‌ترین نمای پاتولوژی در نزد بیماران آزواسپرمی که اسپرم در بافت بیضة آنها رؤیت نمی‌شود توقف بلوغ اسپرم است. علت این تناقض را می‌توان غالباً در روش ارزیابی نمونه‌های بیوپسی دانست. بعضی مؤلفین بیوپسی‌های بیضه با توقف بلوغ را کاهش اسپرماتوژنز تفسیر می‌کنند. لازم به ذکر است که در هیپواسپرماتوژنز تمامی سلولهای ژرمینال کاهش داشته ولی نسبت آنها حفظ می‌شود؛ در حالیکه در توقف بلوغ اسپرم توقف تمایز در سطح یک نوع اختصاصی سلول وجود دارد.

در مطالعة حاضر از اسپرماتید گرد به منظور تزریق در باروری تخمک استفاده شده است. Vanderzwalmen در سال 1997 در 40 زوج نابارور با مشکل آزواسپرمی غیرانسدادی که در نمونه‌های بیوپسی بیضه، اسپرمی برای تزریق بداخل اووسیت پیدا نشده بود، از اسپرماتید (گرد و طویل) برای تزریق بداخل تخمک استفاده نمود و لقاح موفقیت‌آمیز را در 27% از مجموع 296 اووسیت تزریق شده گزارش کرد. در این گزارش 5 مورد حاملگی که 3 تولد زنده، یک حاملگی در جریان (در زمان گزارش) و یک مورد سقط در 4 هفتگی دیده شد(10). در همین سال Fishel استفاده از اسپرماتید (گرد و طویل) را در 17 زوج با آزواسپرمی گزارش کرد که از مجموع 98 تخمک تزریق شده، میزان لقاح 4/17% و میانگین تعداد جنین انتقال یافته 5/1عدد بود؛ ولی هیچ موردی از حاملگی ثبت نگردید(11).

در سال 1999 Ghazzawi در 87 بیمار از اسپرماتید گرد جهت میکرواینجکشن استفاده نمود. میزان لقاح در 574 اووسیت تزریق شده، 22% بود که 46% جنین‌های تشکیل شده انتقال یافتند؛ ولی در هیچ مورد حاملگی گزارش نشد(7). در سال 2002 میلادیBulent در 58 بیمار از اسپرماتید گرد برای ICSI استفاده نمود. میزان لقاح مجموع 1021 اووسیت تزریق شده، 5/40% بود که 7/20% جنین‌های تشکیل شده به رحم انتقال داده شدند. در این مطالعه انتقال در مرحلة بلاستوسیست انجام شد ولی هیچ موردی حاملگی دیده نشد(12). در مطالعةحاضر از 537 تخمک تزریق شده بوسیلة اسپرماتید گرد و طویل در 67 بیمار، میزان اووسیت‌های لقاح یافته 2/38% بود که 8/88% تخمک‌های لقاح یافته به مرحلة جنینی مناسب برای انتقال رسیده و انتقال داده شدند؛ ولی هیچ مورد حاملگی شیمیایی دیده نشد. با توجه به میزان بالای لقاح تخمک در گزارشات فوق‌الذکر، به نظر می‌رسد که بلوغ ساختمانی و بیوشیمیایی اسپرم برای تشکیل جنین الزامی و ضروری نیست. اگرچه از طرف دیگر باید دلایل مختلف میزان حاملگی پایین را مورد بررسی قرار داد. شاید مهمترین علت، شدت پاتولوژی بیضه‌ها ‌باشد. در مطالعة حاضر بیش از 55% بیماران پاتولوژی بیضه به صورت توقف کامل بلوغ اسپرم و روند اسپرماتوژنزو سندرم سلول سرتولی تنها داشتند. یکی از دلایل متأثر شدن روند اسپرماتوژنز به صورتی‌که اسپرم بالغی در بیضه‌ها تولید نشود، می‌تواند علل ژنتیکی از جمله حذف در بازوی بلند کروموزوم Y باشد، که در این موارد اسپرماتید تولید شده از نظر کیفی نیز متأثر می‌شود. چه بسا عدم لقاح تخمک توسط چنین اسپرماتیدهایی و عدم لانه‌گزینی جنین‌های حاصل به دلیل این اشکال کروموزومی باشد. علل غیرژنتیک از قبیل: عوامل محیطی، تروما، ارکیت، واریکوسل، کریپتورکیدیسم و غیره...، نیز می‌تواند آسیب‌های جدی بیضه را باعث شوند. این موارد نه تنها می‌توانند از نظر کمی اسپرماتوژنز را مختل کنند بلکه از نظر کیفی نیز اسپرماتیدهای تولیدشده را تحت تأثیر قرار داده و ظرفیت باروری را کاهش می‌دهند(13).

شاید یکی از دلایل عدم حاملگی و یا تعداد کم حاملگی‌ها در ایـن گونـه مطالعـات، استفـاده از اسـپرماتید گرد در تزریق سیتوپلاسمی تخمک باشد.

در بررسی‌های مختلفی که از اسپرماتید گرد در ICSI استفاده شده ، میزان لقاح 40-20% بوده و نتیجه از نظر حاملگی ناامیدکننده بوده است (14،12،7). مطالعة حاضر نیز با این مطالعات منطبق بوده ولی در بررسی‌هایی که از اسپرماتید طویل استفاده شده است ، میزان لقاح بـالای 50% گـزارش شـده و میـزان حـاملگی تا حدودی امیدوارکننده است(15،14،11). توزیع انواع مختلف اسپرماتید و روند اسپرمیوژنز به شدت پاتولوژی بیضه‌ها بستگی دارد. علل نتایج بهتر با اسپرماتید طویل شاید به دلیل بلوغ بیشتر آن، توانایی بالاتر آن در تحریک تخمک و نیز تشخیص آسانتر آن در مقایسه با اسپرماتید گرد از سایر سلولهای موجود در بافت بیضه باشد.

در این بررسی ظرفیت باروری اسپرماتید گرد در بیماران با توقف اسپرماتوژنز و توان حاملگی ناشی از آن نشان داده شد. در بیماران آزواسپرمی که اسپرم بالغ در نمونه‌های TESE رؤیت نمی‌شود، شاید استفاده از اسپرماتید در ICSI به‌عنوان یک انتخاب درمانی مطرح باشد؛ اگرچه مفید بودن و رضایت بخش بودن استفاده از اسپرماتید گرد نیاز به مطالعات وسیعتری دارد. همچنین خطر انتقال حذف‌های کروموزوم Y و اختلالات ژنتیکی نباید نادیده گرفته شود و لازم است که با غربال ‌گری این بیماران بوسیلة تست کاریوتایپ و بررسی ژنهای کروموزوم Y از عواقب آن جلوگیری نمود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از کلیه همکاران آزمایشگاه جنین‌شناسی پژوهشکدة رویان که ما را در این مطالعه یاری نمودند، کمال تشکر و سپاس را داریم.

AkhondiM.M.,Sedighi M.A.,Amirjannati N. Evaluation of spermatogenesis nonobstructive azoospermic patients with histopathological and cytological methods.Med J Reprod Infert. 2003; 4(1):30-38
JowW.W., Steckel J., Schlegel P.N. Motile sperm in human testis biopsy specimens. J Androl. 1993;14(3):194-8.
Silber S.J., Vansteirteghem A., Nagyz. Normal pregnancies resulting from testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection for azoospermia due to maturation arrest. Fertil Steril. 1996;66(1):110-7.
Ogura A., Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected in to hamster oocytes from pronuclei and participate in syngamy. Biol Reprod. 1993;48(2):219-25.
Vanderzwalmen P., Lejeune B., Nijs M. Fertilization of anoocyte microinserminated with a spermatid in an in vitro fertilization programme. Hum Reprod. 1995;10(3):502-3.
Foshel S., Greens, Bishop M. Pregnancy after intracytoplasmic injection of spermatid Lancet. 1995;24,345(8965): 1641-2.
Ghazzawi M., Alhasani S., Taher M. Reproductive capacity of round spermatids compared with mature spermatozoa in a population of azoospermic men. Hum Reprod. 1999;14(3):736-740.
Kahraman S., Polat G., Samli M. Multiple pregnancies obtained by testicular spermatid injection in combination with intracytoplasmic perm injection. Hum Reprod. 1998;13(1):104-110
Tesarin J., Mendoza C. Spermatid injection in outcome after microinjection of fresh and frozen thawed sperm and spermatids. Hum Reprod. 2002;17(7):1800-1810.to human oocytes. Laboratory Techniques and special features of zygote development. Hum Reprod. 1996;11(4):772-9.
Vanderz Walmen P., Zech H., Birkenfeld A. Intracytoplasmic injection of spermatid retrieved from testicular tissue. Influence of testicular pathology, type of selectes spermatids and oocyte activation. Hum Repord. 1997;12(6):1203-13.
Fishel S., Green S., Hunter A. Human fertilization with round and elongated spermatids. Hum Reprod. 1997;12(2):336-240.
Bulent V., Cengiz A., Senai A. Transfer at the blastocyst stage of embryos derived from testicular round spermatid injection. Hum Reprod. 2002;17(3):741-743.
Sofikitis N.V., Miyagawa I., Incze P. Detrimental effect of left varicose on the reproductive capacity of the early haploid male gamete. J Urol. 1996;156(1):267-70.
Aslam I., Fishel S., Green S. Can we justify spermatic microinjection for severe male factor infertility. Hum Reprod Update. 1998;4(3):213-222.
Sousa M., Cremades N., Silvaj. Predictive value of testicular in secretory azoospermic subgroups and clinical outcome after microinjection of fresh and frozen thawed sperm and spermatids. Hum Reprod. 2002;17(7):1800-1810.