In Vitro maturation and fertilization of human oocytes from unstimulated Polycystic Ovaries

Saremi, AbooTaleb; Azarnia, Mahnaz; Dashtizad, Mojtaba

In Vitro maturation and fertilization of human oocytes from unstimulated Polycystic Ovaries

Authors

AbooTaleb Saremi ¹

Mahnaz Azarnia ²

Mojtaba Dashtizad ³

¹ Department of Obstet . and Gynecol Faculty of Medicine, Islamic Azad University, Tehran, Iran; Sarem Medical Center, Tehran, Iran

² Department of Biology, Faculty of Science, Tarbiat Moalem University, Tehran, Iran

³ Research & Development Unit, Sarem Medical Center, Tehran, Iran

Abstract

Having baby is a desire which plays a major role in everybody’s life. Infertility as unsuccess in achieving this is an annoying matter, affecting approximately 20% of couples. However, this fact should not be ignored that there is still many unknown problems related to infertility. Polycystic ovarian syndrom (PCOS) is one of these Problems. In our study, recovery of immature oocytes followed by in vitro maturation (IVM) of these oocytes was developed as a new method for the first time in Iran for treatment of patients with infertility due to PCOS. The purpose of this study was to reduce the side effects of the currently used treatments such as ovarian hyperstimulation syndrome, ascites, circulation dysfunction, renal dysfunction, thrombosis, multiple pregnancy ,…, as well as their expensive cost. Immature oocytes were collected by transvaginal ultrasound and then transferred to maturation medium for culture. After 24 and 48h of incubation, mature oocytes were transferred to endometerium. Spermatozoa for ICSI were prepared by Swim up, and injected to the mature oocyte with micromanipulator system. A total of 52 immature oocytes were retrieved, all of which matured after incubation(100%); 49 mature oocytes were injected and 35 were cleaved (71%). Satisfactory results of IVM have been published, thus due to its advantages and suprising reduction of the medical cost, it could be as a miracle in curing infertility.

Keywords

In vitro Maturation

Maturation

oocyte

Without induction of ovulation

مقدمه

«ناباروری حادثه‌ای است که رویدادش محسوس نیست»

جودیت دانیلوک(1)

فرزنددار شدن یکی از رویدادهائی است که نقش عمده‌ای در زندگی هر فرد ایفا می‌کند. عدم موفقیت دراین مهم به منزله ناباروری بوده و از مسائل آزاردهنده‌ای است که قریب به 20% زوجها با آن دست به گریبانند. ماحصل تمامی تلاشها و مطالعاتی که در زمینه تولیدمثل صورت می‌گیرد، توسعه روشهای تشخیصی و درمانی جدیدی است که می‌تواند در جهت حل مشکل ازدواجهای ناموفق گام برداشته و امید فرزنددارشدن را به تمامی زوجهای نابارور نوید دهد. از مواردی که مطالعات زیادی در مورد شناخت علل و درمان آن صورت گرفته است می‌توان به عارضه تخمدان‌های پلی ‌کیستیک اشاره نمود. سندرم تخمدان پلی کیستیک PCOS)) شایعترین علت عدم تخمک گذاری در زنان و یک بیماری هتروژن است که با هیپرآندروژنیسم ،عدم تخمک گذاری پایدار ، اولیگومنوره یا آمنوره ، افزایش شاخص تودة بدنی (BMI) ، افزایش سطحLH و تجمع کیست‌های کوچک در تخمدان مشخص می‌شود. زنان مبتلا درصد قابل‌توجهی از مبتلایان به ناباروری را شامل می‌شوند(3،2).

سندرم تخمدان پلی کیستیک که اولین بار توسط اشتین و لونتال تحت عنوان سندرم اشتین- لونتال معرفی شد، یکی از شایعترین اختلالات اندوکرینی می‌باشد که هنوز علت خاص و معینی برای آن شناسایی نشده است(4).

Swanson در سال 1981 یافته‌های سونوگرافی را درPCOS گزارش کرد (5). تا اینکه در سال 1985 Adams معیارهای تشخیصی دقیقی برای بیماری PCO تعریف نمود و تشخیص PCO بر اساس یافته‌های سونوگرافی مورد پذیرش قرار گرفت(6). یکی از مشکلات این افراد عدم تخمک گذاری مزمن می‌باشد. در روشهای رایج فعلی برای درمان این افراد از تحریک تخمک گذاری به وسیله کلومیفن سیترات و گونادوتروپین‌ها استفاده ‌می‌شود.‌با‌توجه‌به تحریک‌پذیری شدید تخمدان‌های این افراد نسبت به گنادوتروپین‌های تزریقی ، استفاده از این دارو خطراتی را برای فرد به‌ دنبال خواهد داشت. از جمله می‌توان به خطر بروز سندرم تحریک بیش از حد تخمدان (OHSS) و آسیت اشاره نمود که حتی می‌تواند منجر به مرگ شود. ترومبوز، نارسایی‌های قلبی و کلیوی، چند قلوزایی، زایمان زودرس، از جمله خطراتی است که در استفاده از روش‌های فعلی وجود دارد. روش درمانی جدیدی برای حل این مشکل پیشنهاد شده است. یکی از این روشها بالغ‌سازی تخمک در شرایط آزمایشگاهی(IVM) است. کشف موضوع رشد و بلوغ، تخمک‌ پستانداران در محیط آزمایشگاه برای اولین بار به سال 1935 یعنی زمانی بر می‌گردد که Pincus و Enzamanm نشان دادند تخمک‌های بدست آمده از فولیکولهای بالغ خرگوشهای تحریک نشده می‌توانند به طور خود به خودی در محیط in vitro به مرحله بلوغ برسند(7). این کشف نشان داد که در فاصله زمانی LH Surge و تخمک‌گذاری اتفاقاتی در محیط کشت رخ می‌دهد.

در سال 1965 Edwards این یافته‌ها را تایید نمود(8) و نتایج را از گونة‌ پستانداران به انسان گسترش داد، ولی بالغ سازی و بارورسازی تخمک‌های نابالغ انسانی به روش کنونی و انتقال جنین حاصل از آن به مادر، چند سالی است که در بعضی از کشورهای جهان به صورت آزمایشی در حال انجام می‌باشد. استفاده از این روش که برای اولین بار در ایران راه‌اندازی شده‌ است برای بیمار و پزشک آسانتر بوده و با دورة درمانی کوتاهتر وکاهش قابل توجه هزینه‌ها همراه است و بیماران بیشتری به آن دسترسی خواهند داشت. بدین طریق خطر بروز دو عارضه بالقوه کوتاه مدت و دراز مدت تحریک تخمک‌گذاری یعنی سندرم تحریک بیش از حد تخمدان و احتمال نئوپلازی و دیگر عوارض ذکر شده بطور کامل برطرف می‌شود و بالاخره، باتوجه به سهولت انجام این عمل، عدة بیشتری از زنان خود را برای اهداء تخمک به منظورتحقیقات و یا برای کمک به زوجهای نابارور آماده می‌کنند. در این روش به‌جای تلاش در جهت رشد فولیکول‌ها در بدن تا مرحلة متافاز II، با کمک سوزن پونکسیون مخصوص و با استفاده از سونوگرافی واژینال، تخمک‌های نابالغ به قطرmm10-2 تخلیه شده، سپس تخمک‌های نابالغ بدست آمده در شرایط آزمایشگاه تا مرحله بلوغ کشت و نگهداری می‌شوند. این روش نوین می‌تواند به عنوان یک روش مناسب به منظور کاهش خطرات درمانی فوق‌الذکرمورد استفاده قرار بگیرد.

مواد و روشها

این مطالعه بر روی 11 بیمار مبتلا به PCO و PCOS در مرکز پزشکی صارم به شکل پیوسته در فاصله خرداد تا مرداد سال1382 انجام شد. این تحقیق از نوع نیمه تجربی می‌باشد.معیارهای ورود بیماران PCO به این مطالعه شامل تظاهرات سونوگرافی تخمدان PCO بر طبق معیارهای Adams (1- وجود حداقل ده کیست به قطر mm8-2 در اطراف استرومای مرکزی متراکم به شکل گردنبند2-افزایش حجم تخمدان 3- ضخیم شدن تونیکا)،هیرسوتیسم ، افزایش شاخص توده بدنی(BMI)، ‌اختلالات قاعدگی، هیپرآندروژنیسم و نسبت بالای LH به FSH بود(10،9).افراد یائسه، مبتلایان به آمنورة ناشی از وزن، بیماری‌های هیپوفیزی، پرولاکتینوما ، هیپرپلازی مادرزادی آدرنال(CAH) و اختلال‌های تیروئیدی و افرادی که شوهر آنها دچار آزواسپرمی بودند از این مطالعه حذف شدند. پس از تشخیص قطعی PCOو PCOS، فرم‌های خاصی در اختیار زوجین قرار گرفت که در آن کلیة اطلاعات ، اعم از مزایا و خطرات ناشی از شرکت در این طرح، ذکرشده بود و افراد با امضاء و رضایت کامل ،‌ وارد طرح گردیدند. برنامه درمانی: قبل از شروع مطالعه، سطح سرمی هورمون‌های LH و FSH ، پرولاکتین، تستوسترون ، T3 ، T4 ،‌ TSH به روش الایزا اندازه‌گیری شد. برای شروع قاعدگی در افراد PCOS که دچار اختلال قاعدگی بودند، mg100 پروژسترون تزریق گردید. بعد‌از شروع سیکل، در روز دوم سیکل برای اطمینان از عدم وجود کیست، سونوگرافی واژینال انجام شد. از روز ششم سیکل به فاصلة هر 48 ساعت سونوگرافی صورت گرفت تا فولیکول به قطر mm10 مشاهده گردد(12،11). سپس یک آمپول HCG حاوی IU10000هورمون به بیمار تزریق شد. پس از 36 ساعت بوسیله سوزن‌های پونکسیون مخصوص و با کمک سونوگرافی واژینال، تخلیة ‌فولیکول‌ها آغاز گردید. سوزن پونکسیون مخصوصی که استفاده شد از نوع 17G

(K-OPS-1235-Wood,Cook,Australia) بود(13). برای جلوگیری از ایجاد لختة‌ خون در محتوی فولیکولی آسپیره شده، می‌توان به محلول فلاشینگ IU/ml2 هپارین اضافه نمود(14). مایع فولیکولی حاصله بلافاصله به آزمایشگاه جنین‌شناسی منتقل و نسبت به جدا نمودن تخمک های نابالغ اقدام شد. برای جدا نمودن محتویات خونی از تخمک نابالغ، تخمک چندین

بــــار در محیطTCM-199 شستشو داده شد و سپس هر تخمک به درون قطرات ml25 از محیط IVM منتقل و برای مدت 48-24 ساعت در انکوباتورC º37 و CO2 5% انکوبه گردید. محیط IVM شامل :(Sigma,USA)TCM-199، ‌IU/ml075/0 هورمون محرکه فولیکولی(FSH) (Sigma,USA)، ‌IU/ml 075/0 هورمون لوتئینی(LH) (Sigma,USA)، ‌IU/ml 1 انسولین(Sigma,USA)، ‌IU/ml 1 استرادیول ((Sigma,USA،4/0% سرم آلبومین انسانی(HAS) ،((Sigma,USA، ‌IU/ml 50 پنی‌سیلینG (Sigma,USA) ، ‌IU/ml 50 استرپتومایسین سولفات و mM33/0 پیرووات سدیم (Sigma,USA) می‌باشد. تخمک نابالغ دارای توده کومولوس فشرده و متراکمی است که به علت این فشردگی، خود تخمک به طور واضح نمایان نیست (شکل-A1). بعد از گذشت 48- 24 ساعت، از میزان تراکم توده کومولوس اطراف تخمک کاسته شده و با بازشدن کومولوس ، تخمک به طور مشخصی نمایان می‌گردد(شکلB-1وC-1). تخمک‌های بالغ با توجه به گستردگی تودة کومولوس و وجود گویچه قطبی اولیه قابل تشخیص می‌باشد(15). تخمک‌های نابالغ کشت داده شده بعد از 48-24 ساعت از تودة کومولوس اطراف تخمک با کمک آنزیم هیالورونیداز جدا شدند (16) و در صورت بلوغ (آزادشدن گویچه قطبی) (شکلD-1وC-1) با اسپرم شوهر از طریق تکنیک تزریق سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) بارور گردید. برای آماده‌سازی اسپرم با روش swim up بدین صورت عمل شد که پس از مایع شدن سیمن در مدت 30-15 دقیقه، مقداری ازآن را در یک لوله آزمایش ریخته و به ازاء هرمیلی لیتر، ml2 محیط شستشوی اسپرم(Medi-cult,Denmark) به آن اضافه و به آرامی مخلوط شد. نمونه به مدت 15 دقیقه با دور g300 سانتریفوژ گردید و بلافاصله مایع رویی دور ریخته و مجدداً با اضافه کردن ml2 از محیط فوق به رسوب و مخلوط نمودن آن، با دور g200 و برای10 دقیقه سانتریفوژ گردید. سپس‌ مایع رویی را مجدداً تخلیه و ml 1-5/0 محیط IVF (Medi-cult,Denmark) به آرامی به رسوب اسپرم اضافه گردید و لوله برای نیم ساعت در انکوباتور CO2 قرار داده شد. با برداشتن قسمت رویی محیط کشت که حاوی اسپرم‌های زنده و فعال می‌باشد، این اسپرم‌ها جهت استفاده در روش ICSI مورد استفاده قرار گرفت. تخمک‌های بالغ شده لقاح یافته 48-24 ساعت درقطرات μl 25 محیط IVF کشت و در انکوباتور CO2 5% وC º37 نگهداری شد. در این مدت می‌توان مراحل مختلف تشکیل جنین، تشکیل پرونوکلئوس‌های نر و ماده (شکل E-1) و جنین 8 سلولی(شکل F-1) را مشاهده نمود. جنین‌های تشکیل‌شده را می‌توان بعد از هچینگ (F-1) به مادر انتقال داد.

نتایج

در این مطالعه میانگین سنی 11 بیمار مورد بررسی، 8/14± 27 سال بود و به طور متوسط بیش از 4 تخـمک از هر نمونه بدســت آمد. ســایر متغیرهای مورد بررسی در جدول شمارة 1 آمده است.

نمودار 1 نشان می‌دهد که از تعداد 52 تخمک نابالغ به دست آمده از نمونه‌ها تعداد51 تخمک برای کشت در محیط IVM در نظر گرفته شد که خوشبختانه تمامی تخمک‌ها به مرحله متافاز II رسیدند و گویچة قطبی آنها نیز دیده شد‌(‌100٪ موارد). از تعداد 52 تخمک بالغ شده 49 عدد آنها با اسپرم شوهر لقاح یافتند (به روش(ICSI‌ که ‌از ‌این ‌تعداد ‌‌35‌ مورد ‌آن ‌منجر ‌به ‌تشکیل‌جنین‌گشت (71٪‌موفقیت‌). ناباروری همة افراد مورد مطالعه از نوع اولیه بود. 8/81٪ بیماران دچار اولیگومنوره، 1/9% افراد دچار آمنوره و 1/9% نیز دچار پلی‌منوره بودند. آکنه در 4/36% از بیماران دیده شد. نمودار شمارة 2، کیفیت جنین‌های حاصل ‌را ‌نشان‌می‌دهد. ‌همانگونه ‌که ‌مشاهده ‌می‌شود ‌‌43%‌ جنین‌ها دارای کیفیت ‌درجه ‌2 بودند. نمودار3 همبستگی میان حجم تخمدان وBMI را نشان می‌دهد. این همبستگی از لحاظ آماری معنی‌دار بود ‌(005/0p<) و ضریب همبستگی خطی پیرسون 78/0 محاسبه گردید. با هدف بررسی ارتباط میان متغیرهایی که به نظر می‌آمد بر روی تعداد تخمک به دست آمده و تعداد جنین موثر باشند مدل رگرسیون خطی طراحی گردید. درتجزیه و تحلیل مدل رگرسیون، ابتدا تعداد تخمک به دست آمده به عنوان متغیر وابسته و سن، BMI و حجم تخمدان، به عنوان متغیر مستقل مطرح گردید که ارتباط معنی داری چه از لحاظ ارزش بالینی و چه از لحاظ آماری دیده نشد اما در بررسی مدل رگرسیون دوم که در آن تعداد جنین به عنوان متغیر وابسته وارد شد با سن، BMI، حجم تخمدان و تعداد تخمک به دست آمده، به عنوان متغیرهای مستقل، ارتباط معنی داری دیده شد(005/0p<). بر اساس این مدل، سن و BMI ارتباطی با تعداد جنین ندارند. اما حجم تخمدان و تعداد تخمک بدست آمده، دارای ارتباط معنی‌داری با تعداد جنین می‌باشد(0001/0< P). با توجه به ضرایب ß که نشانگر قدرت ارتباط می‌باشد، تعداد تخمک‌ به دست آمده دارای ارتباط بسیار قوی‌تری نسبت به حجم تخمدان است.باید توجه داشت که حجم تخمدان با تعداد جنین دارای ارتباط معکوس می‌باشد؛ یعنی هر چه حجم تخمدان بالاتر رود تعداد جنین کاهش می‌یابد. با توجه به تعداد بیمار مورد بررسی، این نتیجه نمی‌تواند مورد استناد قرار گیرد و نیاز به بررسی بیشتر می‌باشد. ضرایب B و همچنین ß را در مدل آماری زیر می توان مشاهده نمود:

+ حجم تخمدان × 0000596/0- 20782- = تعداد جنین

تعداد تخمک‌های بدست آمده × 749/0

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که تخمک های نابالغ حاصل را هم می‌توان از طریق واژینال با کمک سونوگرافی پونکسیون کرد و هم در صورت لزوم از طریق لاپاروسکوپی برداشت نمود. جمع‌آوری تخمک از فولیکولهای نابالغ بسیار مشکل است و دیگر نمی‌توان نمای کلاسیک کمپلکس تخمک – کومولوس را به صورت مشخص مشاهده نمود. بجای آن تخمک‌هایی وجود دارند که سلولهای کومولوس و کورونا در اطراف آنها جمع شده و به سختی می‌توان آنها را از غشاء سلولهای گرانولوزا افتراق داد(17). ولی درصورت مهارت کافی می‌توان تخمک‌های نابالغ را بدست آورد(8،18).

Trounson جهت سهولت در امر پونکسیون تخمک‌های نابالغ دو تغییر مهم ایجاد نمود: اولاً از سوزن آسپیراسیون جدید با سطح مورب کوتاهتر استفاده کرد و ثانیاً فشار آسپیراسیون را بهmmHg 80 کاهش داد. در مطالعه حاضر نیز از سوزن 17G (K-OPS-1235-Wood,Cook,Australia) طراحی شده برای برداشت تخمک‌های نابالغ، استفاده گردید. مسئله‌ای که باید به آن توجه زیادی شود، دقت در تعیین قطر فولیکول‌های نابالغ در سونوگرافی‌های روز ششم به بعد است. چرا که معمولاً سلول‌های گرانولوزای تخمدان طبیعی تا زمانی که قطر آنها بهmm5/9 نرسیده است نمی‌توانند نسبت به FSH پاسخ دهند؛ ولی سلول‌های گرانولوزا در افراد مبتلا به PCOS، حتی فولیکول‌های با قطر mm 4 هم نسبت به LH حساس بوده و به آن پاسخ می‌دهند(19). در نتیجه، این امر موجب شروع زودرس وقایعی می‌گردد که بطور طبیعی در میانه سیکل اتفاق می‌افتد و باعث افزایش یا ترشح پروژسترون و توقف رشد فولیکول می‌گردد. فرض براین است که افزایش سطح داخل فولیکولی انسولین توأم با افزایش سطح LH موجب وقوع لوتئینه شدن زودرس فولیکولها می‌گردد. دلایل Almahboobi مبنی بر افزایش اتصال FSH در سلول‌های گرانولوزای PCOS مبتلا به عدم تخمک‌گذاری دلالت بر کسب و ایجاد گیرنده‌های LH در عرض 48 ساعت در محیط کشت دارد(20). واکنش‌های واقعی بین تخمک و سلول‌های گرانولوزا که برای بقا و رشد طبیعی لازم است، اهمیت زیادی در طراحی و کاربرد استراتژی‌های خاص برای بلوغ تخمک در محیط آزمایشگاه (in vitro) دارد. تهیه‌ محیط کشتی که بتواند شرایط لازم برای عمل سلول‌های گرانولوزا را فراهم آورد، برای بلوغ تخمک مناسب خواهد بود.در این مطالعه محیط کشت استفاده شده TCM-199 به همراه هورمونهای FSH، LH، استرادیول و انسولین بود.تخمک برای انجام تقسیمات میوزی و رسیدن به ظرفیت وپتانسیل‌رشدوتکامل خود،حداقل به هورمون‌هایFSH وLH‌ ‌نیازمند ‌است.FSH‌ به‌ عنوان ‌اولین ‌محرک ‌رشد فولیکولی،‌تبدیل ‌آندروژن ‌به ‌استروژن ‌را ‌در ‌سلول‌های گرانولوزا توسط ‌آنزیم‌های سیستم آروماتاز ‌تحریک می‌کند. استرادیول در محیط کشت به طور مستقیم با تحریک سنتز پروتئین‌های گیرنده، بر تعداد گیرنده‌ها می‌افزاید. نکتة متمایز کنندة محیط کشتی که در این مطالعه استفاده شده است وجود انسولین در محیط کشت می‌باشد انسولین نیز حساسیت سلول‌های گرانولوزا را نسبت به FSH افزایش می‌دهد و پاسخ به LH نیز به میزان محسوسی بالا می‌رود. در پاسخ به FSH و انسولین موجود در محیط کشت تعداد زیادی اتصالات سلولی بین سلول‌های کومولوس و همچنین بین سلول‌های کومولوس و تخمک بوجود می‌آید. پس از اینکه این سلو‌لها در معرض مقادیر بالای FSH و LH در محیط in vitro قرار گرفتند، لوتئینه شدن کنترل شدة سلولها و سیگنال پاراکرین موجب گسسته شدن این ارتباطات شکننده شده و در نتیجه به شروع روند بلوغ هسته‌ای داخل تخمک کمک می‌نماید. باید توجه داشت که افزودن سرم و مایع فولیکولی به محیط انکوباسیون، موجب پرولیفراسیون سلولی و اتصال به سطح سلول می‌شود و در نتیجه منجر به از بین رفتن زودرس ارتباطات بین کومولوس و تخمک شده و پتانسیل بلوغ تخمک را دچار مشکل و اختلال خواهد نمود(14)، که می‌توان به جای آن از نوع مناسب آلبومین (همانند این مطالعه) یا ماکرومولکولهای مناسب فیزیولوژیک مثل هیالورونات استفاده نمود(21). در تحقیقات اولیه که در مورد IVM انسان صورت گرفت، مدت زمان بلوغ، بیش از 48 - 40 ساعت ذکر شده است(22). متعاقب آن، اغلب مطالعات بعدی هم زمان 48 ساعت را ملاک قرار داده‌اند(23).

روش لقاح نیز بر تعداد و کیفیت جنین‌های حاصل از بلوغ‌آزمایشگاهی‌تخمک انسان مؤثرمی‌باشد. ICSI اثرات مخرب‌ناشی‌از‌کشت‌طولانی‌مدت بر روی زوناپلوسیدا را به حداقل می‌رساند(24). کشت طولانی مدت تخمک‌در غیاب سرم موجب آزادشدن گرانولهای قشری زودترازموعد‌مقرر و در نتیجه سخت شدن زوناپلوسیدا می‌گردد(25). این امر نه تنها در تلقیح معمولی موجب کاهش لقاح می‌گردد بلکه مانع از هچینگ جنینی می‌شود. مطالعات‌نشان‌داده‌است‌که‌سخت‌شدن زونا میزان هچینگ بلاستوسیست را در میمونهای رسوس از 77% به 25% کاهش‌می‌دهد.بنابراین انجام هر دو عمل ICSI و هچینگ کمک‌شده در تمامی جنین‌های حاصل از IVM ضرورت دارد(26). Trounson در سال 1994 با بدست آوردن 403 اووسیت نابالغ از بیماران PCO در شرایط بدون تحریک تخمک‌گذاری، موفق شد 4/46% آنها را به مرحلة متافاز II برساند. وی 77% این مقدار را بارور نمود که 6/69% آنها منجر به تشکیل جنین گشت(27). Carson در سال 1995 نیز به همین صورت، 36 تخمک نابالغ را بدست آورد و با کشت دادن آنها، توانست8/63% آنها را به مرحلة متافاز II برساند و از این مقدار 40% آنها را بارور نمود که در نتیجه 56% از آنها تقسیم و تشکیل جنین دادند(27). Barnea در سال 1995، با بدست آوردن 52 تخمک نابالغ و کشت آنها در محیط IVM توانست 6/57% آنها را به مرحلة بلوغ برساند. از این درصد 3/43% آنها را بارور نمود که 6/84% آنها تقسیم شدند(27). Russell در سال 1995 با بدست آوردن 1621 تخمک نابالغ و کشت آن در محیط IVM ، 9/50% آنها را به مرحلة متافاز II رساند و با بارور سازی 3/74% آنها توانست 59% تخمک‌های بارور شده را به مرحلة تقسیم جنینی برساند(27). Barnea در سال 1996 با بدست آوردن 234 تخمک نابالغ و کشت آنها، 67% این تخمک‌ها را به مرحلة متافاز II رساند که 32% آنها بارور شده که از این مقدار 19% آنها تقسیم شدند(27). Carson در سال 1997، 109 تخمک نابالغ را بدون تحریک تخمک‌گذای بدست آورد که 6/59% آنها بعد از کشت به مرحلة متافاز II رسیدند و از این تعداد 5/63% آنها را بارور نمود که 4/75% آنها به مرحله تقسیم جنینی رسیدند و با انتقال جنین حاصله توانست به حاملگی و در نهایت تولد نوازد سالم برسد(27). Kamal A. Jaroudi و همکاران در سال 1999 با بدست آوردن 171 تخمک نابالغ بدون تحریک تخمک‌گذاری توانست 121 عدد آنها (8/70%) را به مرحلة متافاز II برساند. 71 عدد(7/58%) آن را با روش ICSI بارور نمود که 53 تخمک(6/74%)، لقاح یافته و تشکیل جنین دادند از این تعداد 14 جنین (4/26%) از نظر کیفیت درجة 1، 23 جنین(4/34%) درجة 2 و 16 جنین(2/30%) درجة 3 بودند(27). Kwangy.cha و همکاران در سال 2000 توانستند به مجموع 2/62% بلوغ آزمایشگاهی و 1/88% تقسیم جنینی دست یابند(27). Timj.drild در سال 2001 ،849 تخمک نابالغ از افراد PCO بدست آورد که از این تعداد 792 تخمک سالم بود و برای بالغ شدن، کشت داده شدند. 9/73% آنها بالغ شد که پس از لقاح منجر به تشکیل 7/64% جنین گشت(27).

از دیگر نکات قابل توجه، اهمیت اثر حجم محیط انکوباسیون بر جنین می‌باشد. این مسئله که جنین در حجم کم و یا به صورت گروهی بطور مشخصی تشکیل بلاستوسیست داده و نیز تعداد سلولهای بلاستوسیست را افزایش می‌دهد(28)، در چند گونه از پستانداران به اثبات رسیده است. در مطالعة حاضر، جنین‌ها را در قطراتµl 25 از محیط کشت قرار دادیم. کشت جنین در محیط‌های کوچک قابلیت حیات را پس از انتقال افزایش می‌دهد(29). علت این موضوع ناشی از تولید فاکتورهای اتوکرین یا پاراکرین مخصوصی است که رشد جنین را تحریک نموده و جنین را در همان محیط رشد احاطه می‌کنند. بنابراین کشت جنین در محیط‌های بزرگ موجب رقیق‌شدن فاکتور ودر نتیجه غیر مؤثر بودن آن می‌شود. در دو پستاندار موش و گاو ثابت شده است که کاهش نسبت حجم انکوباسیون به جنین به طور خاصی رشد و تکامل ICM را تحریک می‌کند(31،30). میزان تقسیم سلولها ارتباط مستقیمی با افزایش شانس حاملگی دارد(32،33).

در جنین‌های حاصل از IVM هم احتمال حاملگی در جنین‌های با سرعت تقسیم بالاتر، بیشتر می‌باشد(34). میزان ناهنجاری‌ میوزی واضح در آن دسته از تخمک‌های انسان که از نظر شکل طبیعی هستند (18%) (35) مشابه تخمک‌هایی است که در محیط Invivo به بلوغ رسیده‌اند(20%) و نیز کمتر از تخمک‌هایی است که پس از تحریک تخمک‌گذاری جمع‌آوری شده‌اند(36،37). بررسی و تحقیقات کامل بر روی اثرات IVM بر تقسیمات میوزی و ناهنجاری‌های کروموزومی ادامه دارد. هنوز خیلی زود است که تمامی مشکلات ناشی از IVM برطرف گردد ولی اگر نتایج حاصل در تحقیقات آیـــنده رضایت‌بخش باشد وIVM به صــورت روش بالینی رایج استفاده گردد، می‌تواند یک تحول جدید در درمان ناباروری محسوب گردد.

دارد. هنوز خیلی زود است که تمامی مشکلات ناشی از IVM برطرف گردد ولی اگر نتایج حاصل در تحقیقات آینده رضایت‌بخش باشد وIVM به صورت روش بالینی رایج استفاده گردد، می‌تواند یک تحول جدید در درمان ناباروری محسوب گردد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله، نویسندگان مراتب تقدیر و تشکر خود را از کلیه پرسنل محترم مرکز پزشکی صارم که صمیمانه ما را در انجام این طرح یاری رساندند، ابراز می‌دارند.

اسفندیاری‌نوید.بررسی‌تاثیر برخی از عوامل ایمونولوژیک و ناباروری با علت نامشخص. پایان نامه دکترای تخصصی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تهران، 73-1372.
Frank S. The Polycystic Ovary Syndrome. N Engl J Med.1995;333:853-61.
Futterweit W. Pathophysiology of Polycystic Ovarian Syndrome. Redmond G.P(Editor)., Androgenic Disorders. Raven Press, New York. 1995;77-166.
Balen A.H. The phatogenesis of Polycystic Ovary Syndrome.Lancet.1999;354:966-7.
Swanson M., Sauerbrie E.E., Cooperberg P.L. Medical implications of ultrasonically detec polycyctic ovaries. J Clin Ultrasound.1981;9:219-22.
Adams J., Frank S., Polson D.W., Mason H.D., Abdulwahid N., Jacobs H.S.Multifollicular ovaries: clinical and endocrine features and response to pulsatile gonadotrophin releasing hormone. Lancet. 1985;1375-8.
Pincus G., Enzmann E.V. The comparative behaviour of mammalian eggs in vivo and in vitro. J Exp Med. 1935;65:665-75.
Edwards R.G., Bavister B.C., Steptoe P.C. Early stage of fertifization In Vitro of Human oocytes matured In vitro. Nature.1969;221:632-5.
Jacobs H.S. Polycystic Ovaries and Polycystic Ovary Syndrome. Gyn Endocrinol.1987;1:113-31.
Yen S.S.C. The Polycystic Ovary Syndrome. Clin Endocrinol.1980;12:177-86.
Chian R.C., Gulekli B.Pregnancy and delivery after cryopreservation of zygotes produced by in-vitro matured oocytes retrieved from a woman with Polycystic Ovarian Syndrome. Hum Reprod.2001;16,8,1700-2001.
Tim J. In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated normal ovaries,and women with polycystic ovary syndrome. Fertil Steril.2001;76,5:936-41.
Trounson A., W., C., In vitro maturation and the fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated polycystic ovarian patients. Fertil Steril. 1994;62; (2):353-62.
Ben- ze’ev A., Amsterdam A.Regulation of cytoskeletal proteins invo lved in cell contact formation during differentiation of granulosa cells on extracellular matrix.Proc Natl Acad Sci USA.1998;83:2894-8.
Kwang Y., Cha Se., Han Y. Pregnancies and deliveries after in vitro maturation culture followed by in vitro fertilization and embryo transfer without stimulation in women with Polycystic Ovary Syndrome. Fertil Steril.2000;73(5):978-83.
Cortvrindt R., Smitz J. In vitro follicle growth: Achievements in mammalian species. Reprod Dom Anim.2001;36: 3-9.
Liu j., Katze., Garcia J.E., et al. Successful In Vitro maturation of human oocytes not exposed to human chorionic gonadotropin during ovulation induction, resulting in Pregnancy. Fertil Steril. 1997;67:566-8.
Barnes F.L., Kausche A., Tiglias J., et al. Production of embryos from in vitro matured primary human Oocyte. Fertil Steril.1996;65: 1151-6.
Willis D.S., Mason H.D. Premature response to LH of granulose cells from anovlatory women with PCOS: Relevance to mechanism of anovulation. J Clin Endocrinol Metab.1998;83:3984-91.
Almahboobi G., Anderiesz C. Functional integrity of granulose cells from polycystic ovaries. Clin Endocrinol.1996;44:571-80.
Gardner D.K., Lane M., Rodriguez-Martinez H. Fetal development after transfer is increased by replacing protein with the glycosaminoglycan hyaluronate for embryo culture. Hum Reprod. 1997;12:0-215.
Regan L., Owen E.J. Hypersecretion of luteinising hormone, infertility and miscarriage. Lancet.1990;336:1141-4.
Hardy K., Wright C.S. In vitro maturation of oocytes. Brith Med Bull. 2000;56(3):588-602.
Russell J.B., Knezevich K.M., Fabian K.F., Dickson J.A. Unstimulated immature oocyte retrieval: early versus midfollicular endometrial Priming. Fertil Steril.1997;(67):616-20.
Green D.P.L. Three- dimensional structure of the zona Pellucida.Rev Reprod.1997;2:147-56.
Schramm R.D., Baoister B.D. Follicle- Stimulating hormone priming of rhesus monkeys enhances meiotic and developmental competerce of oocytes matured invitro. Biol Reprod.1994;5151:904-12.
Cobo Ana C., Requena A. Maturation in vitro of human oocytes from unstimulated cycles: Selection of the optimal day for ovum retrieval based on follicular size. Hum Reprod. 1999; 14(7):18 64-8.
Wiley L.M., yanami S., Van Muyden D. Effect of potassium concentration, type of protein Supplement and embryo density on mouse preimplantation development in vitro. Fertil steril.1986;45:111-19.
Lane M., Gardner D.K. Effect of incubation volume and embryo density on the development and viability of Preimplantation mouse embryos in vitro. Hum Reprod.1992;7:558-62.
Ahern T., Gardner D.K. Culturing bovine embryos in groups Stimulates blastocyst development and cell allocation to the inner cell mass.Theriogenology.1998;49:194.
Gardner D.K., Lane M.W., Lane M. Development of the inner cell mass in mouse blastocysts is stimulated by reducing the embryo: incubation volume ratio. Hum Reprod.1997;12: 132.
Cumming J.M., Breen T.M., Harrison K.L., et al. A formula for scoring human embryo growh rates in invitro fertilization: its value in predicting pregnancy and in comparison with visual estimates of embryo quality.J In vitro Fertil Embryo Transf.1986;3:284-95.
Bolton V.N., Hawes S.M., Taylor C.T., Parsons J.H. Development of spare human preimplatntation embryos in vitro and analysis of the correlations among gross morphology, cleavage rates and development to the blastocyst. J In vitro Fertil Embryo Transf.1989;6:30-5.
Trounson A.O., wood C., kausche A. In vitro maturation and fertilization and developmental competence of oocytes recovered from untreated- polycystic ovarian Patients. Fertil Steril. 1994;62: 353-62.
Racowsky C., kaufman M.L. Nuclear degeneration and meiotic aberrations observed in human oocytes matured in vitro: analysis by light microscopy. Fertil Steril.1992;58:750-5.
Gras L., Mcbain J., Trounson A.o., Kola I. The incidence of chromosomal aneuploidy in stimulated and unstimulated (natural) uninseminated human oocytes.Hum Reprod. 1992;7:1396-401.
Delhanty J.D., Harper J.C., Handyside A.H., Winston R.M. Multicolour fish detects frequent chromosomal mosaicisms and chaotic division in normal Preimplantation embryos from fertile patients. Hum Genet.1997;99:755-60.