مقدمه

لانه‌گزینی جنین واقعة مهمی است که تعیین کنندة موفقیت روشهای نوین باروری می‌باشد. با وجود پیشرفتهایی که در زمینه کشت جنین وآماده‌سازی رحم جهت لانه‌گزینی انجام شده است، همچنان میزان حاملگی دراین روشها، علیرغم انتقال 2 تا 4 جنین، پایین است(1). این امر

نشان دهنده وجود عوامل دیگری است که می‌توانند بر فرآیند طبیعی لانه‌گزینی جنین تاثیر گذارند(2). چندین مطالعه وجود ارتباط بین عفونت‌های دستگاه تناسلی بویژه عفونت‌های ناشی از میکروب‌های قابل سرایت از راه جنسی(STD) ودرصد موفقیت روش‌های نوین باروری را محتمل دانسته‌اند ولیکن نتایج بدست آمده تا حدی ضد و نقیض می‌باشد. در این مورد بعضی از محققین با نمونه برداری از کانال سرویکس، ارتباطی بین درصد باروری با نوع فلور باکتریال این ناحیه مشاهده نموده‌اند، ولی در مطالعات دیگری با نمونه‌برداری از واژن بیماران قبل از بدست آوردن تخمک، ارتباطی بین درصد باروری و فلور باکتریال بدست نیامد(4-2).

اخیراً مشخص شده است که وجود گونه‌های کلامیدیا در اندوسرویکس خانمهائی که تحت عمل IVF قرار گرفته‌اند، با کاهش میزان لانه گزینی و روند باروری همراه بوده است(6،5). همچنین سایر میکروبهای بالقوه پاتوژن نیز می‌تواند در سرویکس کلون تشکیل دهند ودر طی روند انتقال جنین وارد حفره رحمی شده و نتایج نامطلوبی را در لانه‌گزینی به دنبال داشته باشد(7).

مطالعات نشان داده است که تلقیح آزمایشی باکتری اشریشیاکلی به داخل حفرة اندومتر موش باعث اتصال باکتری به اندومتر و سپس تخریب اپی تلیوم اندومتر می‌گردد(8) و همچنین نتیجه IVF در بیمارانی که کشت باکتریال کاتتر انتقال جنین آنها مثبت بوده، نیز نامطلوب بوده است(3).

در ایـن زمینـه مطالعات متعـددی در کشورهـای مختلف انجام گرفته است (10-9،3،1)؛ ولی بر اساس بررسی‌‌های محققین، به نظر نمی‌رسد در ایران تا زمان شروع این پژوهش مطالعه وسیع و مدونی در این مورد انجام شده باشد. لذا با ضد و نقیض بودن بعضی از گزارش‌ها، نیاز به چنین تحقیقی کاملاً احساس گردید تا با آگاهی یافتن از میزان و نوع آلودگی باکتریایی کاتترها در هنگام انتقال جنین دربیماران با باروری موفق و ناموفق، تاثیر احتمالی این عوامل بر نتیجه باروری برآورد گردد. بنابراین با کسب نتایج مطلوب می‌توان با استفاده از روشهای درمانی پروفیلاکسی به گونه‌ای که فلور باکتریال تغییر چندانی ننماید به نتایج سودمندی نایل آمد.

مواد و روشها

در مطالعه مقطعی حاضر، نمونه‌ها از نوک کاتتر انتقال جنین (TDT- France) 100 زن کاندید ICSI مراجعه کننده به مرکزباروری و ناباروری اصفهان از مهرماه لغایت اسفند ماه 1378 بدست آمد. در ضمن تمام این بیماران در یک یا دو سیکل قبلی جهت بررسی عفونتها یا ضایعات سرویکس بررسی شدند و در صورت وجود عفونت مشخص یا ضایعه، بیماران متعاقباً درمان شدند؛ ولی در شروع سیکل به بیماران هیچگونه آنتی‌بیوتیکی داده‌نشد، زیرا چنین درمانهایی می‌تواند منجر به تغییر فلور طبیعی سرویکس گردد.

در این مطالعه فاکتورهای متعددی از قبیل سن، کیفیت اندومتر، تعداد تخمک،‌ کیفیت و درصد تخمک بالغ، درصد لقاح، تعداد جنین، درصد تسهیم و کیفیت جنین مورد بررسی قرار گرفت و بیماران با سن بیش از 38 سال، اندومتر نامناسب یک خطی و کمتر ازmm 6 و دارای کمتر از دو جنین با کیفیت مناسب از مطالعه حذف گردیدند. وضعیت لانه‌گزینی جنین‌ها، 15 الی 20 روز پس از انجام عمل انتقال جنین، بر مبنای آزمایشات hCG - β مشخص گردید. لازم به ذکر است میزان β- hCG بالای IU100 به عنوان لانه‌گزینی محسوب شد ولذا بیماران با hCG β- مثبت درگروه باروری موفق دسته‌بندی شدند ودر غیر این‌صورت در گروه ناموفق قرار گرفتند.

کیفیت اندومتر بر اساس اندومتر سه خطی یا دو خطی درآخرین سونوگرافی با دستگاه Aloka(Japan) قبل ازعمل ICSI مشخص و ثبت گردید. درصد لقاح براساس تعداد تخمک لقاح یافته نسبت به کل تخمکهای بالغ و درصد تسهیم براساس تعداد جنین تشکیل شده نسبت به کل تخمکهای لقاح یافته محاسبه گردید. کیفیت جنینهای منتقل شده به سه دسته تقسیم شدند: جنین‌های دارای بلاستومر یکسان و با فراگمانتاسیون کمتر از10% ، جنین‌های دارای بلاستومر یکسان و با فراگمانتاسیون بین 10 الی50% و جنین‌های دارای بلاستومر با اندازه نامساوی و فراگمانتاسیون بیش از 50% که به ترتیب به آنها امتیاز 1،2 و3 داده شد. سپس ضریب کیفیت جنینها براساس جمع امتیاز جنینهای منتقل شده بر تعداد کل جنین‌ها محاسبه شد و فاکتورهای فوق در دو گروه مقایسه گردید.

عمل انتقال جنین با استفاده از کاتترهای مخصوص(TDT-France) توسط متخصص زنان از طریق اندوسرویکس صورت گرفت و سعی شد که نوک کاتتر انتقال جنین با جدار واژن تماس حاصل نکند. در این مرحله جهت نمونه‌برداری از اندوسرویکس و انجام مراحل کشت باکتریولوژی، پس از انجام انتقال جنین از نوک کاتتر استفاده شد. در این هنگام نوک کاتتر انتقال جنین به اندازه cm2 قطع وتوسط پنس استریل بر روی محیط‌های بلادآگار حاوی 5% خون گوسفند، شکلات آگار وEMB آگار (Merck, Germany) غلطانیده و سپس به محیط تیوگلیکولات برات (Merck, Germany) منتقل گردید (11). محیط شکلات آگار جهت بررسی رشد فلورباکتریال در حضور5 تا 10 % CO2 درون جار کاندل قرار گرفت. از محیط تیوگلیکولات برات نیز صرفاً جهت جدا نمودن فلورباکتریال بی‌هوازی اجباری استفاده شد. در کلیه موارد، کنترل کیفی و همچنین دقت لازم جهت احتراز از آلودگیهای ثانویه انجام پذیرفت؛ به این صورت که یک کاتتر به عنوان کاتتر کنترل که کلیة مراحل انتقال را گذرانده ولی به داخل سرویکس بیمار وارد نشده است به عنوان کنترل مورد استفاده قرار گرفت. محیط‌های کشت بلافاصله به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی اصفهان انتقال‌یافت و در دمای °C 37 انکوبه گردید.

پس از انکوبه شدن در طول شب و ظاهر شدن کلنی‌ها، بر روی محیطهای کشت ابتدا با توجه به ویژگیهای شکل، اندازة کلنی، نوع همولیز و مشخصات میکروسکوپی و انجام آزمایشات تکمیلی باکتریهای رشد کرده شناسایی شدند (12).

نمونه‌ها همچنین از محیط مایع تیوگلیکولات مشکوک به رشد باکتریهای بی‌هوازی اجباری به محیط بلادآگار حاوی 5% خون گوسفند همراه با ویتامین k، به میزان µg/ml 10 تلقیح و درون جار بی‌هوازی قرار داده شدند. کشت‌های خالص در شرایط بی‌هوازی مطلق از نظر خصوصیاتی از قبیل مورفولوژی کلنی، تولید پیگمان، نوع همولیز و مشخصات میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفتند و با استفاده از آزمایشات تکمیلی تشخیص نهایی گونه باکتری صورت پذیرفت (12).

لازم به ذکر است در طی دورة درمان بیمار با داروهایhMG و hCG از هیچ گونه آنتی‌بیوتیکی استفاده نشد. فقط در زمان بدست آوردن تحمک یا پونکسیون، از g2 سفازولین استفاده شد؛ ولیکن میزان موفقیت بر اساس وجود یا عدم وجود عفونت در کانال سرویکس مقایسه گردید. جهت آنالیز نتایج و فرضیات از آزمون2 استفاده و 05/0< Pاز نظر آماری معنی‌دار قلمداد گردید.

نتایج

طیف سنی زنان داوطلب 18 تا 38 سال و میانگین سنی آنان7/99/27 سال محاسبه شد. میانگین سنی زنان با باروری‌های موفق و ناموفق به ترتیب 5/8 5/27 و 9/7 4/28 سال بود. 67% از زنان داوطلب دارای اندومتر از نوع سه خطی و 33% دارای آندومتر از نوع دو خطی در آخرین سونوگرافی قبل از تخمک‌گیری بودند. میانگین تعداد تخمک آسپیره شده 6/5 27/10، متوسط درصد لقاح 65% و میانگین تعداد جنین ایجاد شده 3/3 05/6 بود. میانگین درصد جنین نسبت به تخمک لقاح یافته 7/89% محاسبه گردید. میانگین ضریب کیفیت جنین 1/1 3/2 بر اساس امتیـازدهـی فوق محاسبـه شد.

فاکتـورهـای فـوق بین دو گـروه با بـاروری موفق و ناموفق در بیماران با آلودگی کانال سرویکس یا بدون آلودگی متفاوت نبود. از 100 مورد مطالعه شده در 46% کشت نوک کاتتر مثبت در 54% کشت نوک کاتتر منفی بود. در گروه با کشت مثبت و منفی به ترتیب 5 و 12 نفر باروری موفق داشتند که درصد باروری در این دو گروه به ترتیب 87/10% و 23/22% می‌باشد که از نظر آماری تفاوت معنی‌داری وجود دارد(P=0.002). در 15% موارد کشت مثبت باسیل دودرلاین ایزوله گردید که جزء سیکلهای عدم رشد قلمداد گردید(2. در 8/97 % موارد صرفاً باکتریهای هوازی و در 2/2% صرفاً باکتریهای بی‌هوازی اجباری رشد کرد. تنوع باکتریها در گروه کشت مثبت نوک کاتتر بدین قرار است: اشریشیاکلی (E.coli) 34 مورد (9/73%)، کلبسیلا (Klebsiella) 2 مورد (35/4%)، انتروباکتر(Entrobacter) 1مورد (18/2%)، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس (Staphylococcus)4مورد(69/8%)، استرپتوکوک گروهB (Streptococcus Group B)1مورد (18/2%)، انتروکوک (Entrococcus)3 مورد (52/6 %)، فلور بی‌هوازی (Aneaerobe)1 مورد (18/2%)(جدول شمارة 1).

بررسی انجام شده حاکی از این است که در 17% موارد، لانه‌گزینـی جنیـن، مـوفق بود درحالیـکه در 83% مـوارد، لانه‌گزینی جنین، ناموفق بود. 59/70 % از گروه موفق دارای کشت منفی و 4/29% دارای کشت مثبت نوک کاتتر بودند. در گروه ناموفق 6/50% دارای کشت منفی و 4/49% دارای کشت مثبت نوک کاتتر بودند. به عبارت دیگر در 54 بیمار بدون آلودگی کانال سرویکس درصد باروری 2/22% بود؛ درحالیکه در بیماران با آلودگی کانال سرویکس 8/10% بود. بررسی آماری نتایج حاصله با استفاده از آزمون 2 نشان دهنده آن است که رشد باکتریهای اندوسرویکس در زنان با باروری ناموفق به طور معنی‌داری بیشتر از زنان با باروری موفق بوده است (P=0.004) . طبق شواهد موجود گونه غالب کلنیزه کننده آندوسرویکس، باکتری اشریشیاکلی می‌باشد.

بحث

مطالعه حاضر به منظور تحقیق در مورد تاثیر احتمالی فلورباکتریال سرویکس بر نتیجه لقاح خارج رحمی و انتقال جنین انجام گردید. باکتری‌های اندوسرویکس از طریق بررسی باکتری‌شناسی کاتترهای انتقال جنین پس از انتقال جنین مورد ارزیابی قرار گرفتند. افراد مشمول مطالعه از نظر سن، وضعیت آندومتر و نیز تعداد و کیفیت جنین های منتقل شده کنترل گردیدند. نتایج حاصله نشان دهنده تفاوت معنی‌داری بین میزان کشت مثبت در گروه بیماران با باروری موفق (4/29%) و ناموفق(9/49%) بود (جدول شمارة 2). همچنین در میزان باروری موفق در بیماران با آلودگی کانال سرویکس (8/10%) و بدون آلودگی (2/22%) تفاوت وجود داشت.

این نتایج موید آن است که احتمالا فلورباکتریال همسفره سرویکس در زمان انتقال جنین ممکن است از لانه گزینی جنین جلوگیری کند.

علل مختلفی را می‌توان برای منشاء عفونت‌های دهانة سرویکس نام برد، که یکی از این علل می‌تواند نحوة بدست آوردن تخمک در بیماران باشد. مقایسة میزان آلودگی دهانة سرویکس بیمارانی‌ که در همان سیکل جنین به آنها انتقال داده شده بود با بیمارانی که از جنین‌های منجمد شده استفاده نموده بودند موید آن است که احتمال آلودگی در طی فرآیند بدست آوردن تخمک پایین می‌باشد(10).

از لحاظ پاتوفیزیولوژی، حداقل سه مکانیسیم ممکن است پایین‌تر بودن میزان باروری را در بیماران با کشت مثبت نوک کاتتر توجیه نماید. اول آنکه، قابل تصور است که غلظتهای بالای باکتریهای سرویکس ممکن است

با عفونت تحت بالینی آندومتریت همراه باشد و لذا باعث اختلال در پذیرش جنین توسط آندومتر گردد(13).

دوم آنکه شیوه انجام عمل انتقال جنین ممکن است باعث تلقیح باکتریهای سرویکال به داخل حفره رحم گردد و در نتیجه باعث تغییر ویژگیهای بیوشیمیایی یا فرا ساختاری آندومترگردد که این ویژگیها برای لانه‌گزینی و تکامل اولیه جنین لازم است(15،14). سوم آنکه آلودگی مستقیم جنین‌ها توان آنها را در لانه گزینی پایین می‌آورد.

درآندومتریت میکروارگانیسم‌ها، یا به طور مستقیم باعث تخریب سلولهای آندومتر می‌شوند و یا باعث تجمع لوکوسیت‌ها در آندومتر شده و سایتوکین‌هایی تولید می‌کنند که روی مولکولهای چسبنده از نوع اینتگرین اثر کرده و سبب اختلال در قدرت پذیرش آندومتر می‌شوند.

بررسی باکتریولوژیک مؤید آن است که باکتری اشریشیاکلی به‌طور واضح بر سایر باکتریها غالب است (9/73 % در گروه کشت مثبت). این یافته همراه با درصد پایین حاملگی‌ها در این گروه نشان می‌دهد که کولیفرمهای سرویکس را باید بالقوه عامل مضری برای لانه‌گزینی جنین بدانیم. در تائید این فرضیه تلقیح آزمایشی باکتری اشریشیا کلی به داخل اندومتر موش باعث اتصال باکتری و سپس تخریب اپی‌تلیوم آندومتر شده است(8). در مطالعة حاضر، بر روی ارتباط تصادفی باکتری‌های پاتوژن از قبیل گونة کلامیدیا و مایکوپلاسما همومینیس بررسی صورت نگرفت، که بهتر است در مطالعات وسیع دیگری مد نظر قرار داده شوند. نتایج مطالعه حاضر با مطالعه Egbase و همکاران در سال 1996 مطابقت داشت. در مطالعه فوق الذکر وجود باکتریهای سرویکس که از کاتتر جنین ایزوله گردیدند، با کاهش میزان باروری همراه بود(3). این محققین میزان کشت مثبت نوک کاتتر را 49 % گزارش کردند که در مطالعه حاضر نیز در حدود 46% بود. Fanchin وهمکاران نیز در مطالعه‌ای در سال 1998 که بر روی 279 سیکل انتقال جنین انجام دادند، حضور فلورباکتریال سرویکس را در زمان انتقال جنین بر پیامد لانه‌گزینی مضر دانستند و میزان کشت مثبت نوک کاتتر را 51% گزارش نمودند. میزان شیوع گونة اشریشیاکلی در این مطالعه تقریباً هم ارز شیوع این باکتری در مطالعه Fanchin و همکاران بود؛ ولی با میزان شیوع این باکتری در مطالعة Salim و همکاران(5/8%) متفاوت بود(10). این متخصصین چنین بیان نموده‌اند که این تفاوت می‌تواند به دلیل اختلاف دو جمعیت مورد بررسی باشد. در مطالعه Salim و همکاران این باکتری غالب گزارش نشد، با این حال در مطالعه Salim مانند مطالعه حاضر درصد میزان باروری در گروه بدون آلودگی نسبت به گروه با آلودگی کانال سرویکس دوبرابر بود. در ضمن این محققین و همچنین Egbase یک ارتباط آماری بین شانس باروری و تعداد کلونی و نوع باکتری گزارش نمودند. از نظر میزان شیوع گونة استرپتوکوک در مطالعه Egbase(55%) با مطالعه حاضر( 7/8%) و مطالعه Fanchin (8%) همخوانی نداشت. متضاد بودن برخی موارد مطالعه حاضر با مطالعات قبلی، ممکن است با برخی اقدامات پیشگیرانه، از جمله ضدعفونی کردن سرویکس با محیط Ham`s که دارای آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین است، توجیه گردد. این عامل ضد باکتریایی برضد گونه استرپتوکوک بیش از 90% موثر است، در حالیکه در مورد باکتری اشریشیاکلی اثر مغایری دارد که علت آن تولید احتمالی بتالاکتاماز توسط این باکتری می‌باشد. به علاوه کولیفرم‌های این باکتری در زنان جوان سالم که اخیراً تحت درمان ضد باکتری یا ضد قارچی قرار گرفته‌اند به نحو معنی‌داری می‌تواند شایع‌تر از سایر باکتریها باشد(16). این نتایج مؤید

این است که استعمال آنتی‌بیوتیک‌های واژینال، باعث شکنندگی مقاومت اپی‌تیلوم واژن شده و این ناحیه را مستعد کلونیزه شدن باکتری اشریشیاکلی می‌گرداند(16).

در مطالعة اخیر توسط Salim و همکاران میزان شیوع باکتریهای گرم منفی، پاتوژن‌های بی‌هوازی، گرم مثبت، کاندیدا و مختلط به ترتیب 19، 38، 46، 18 و 21 درصد گزارش شد. و درصد حاملگی در این گروه‌ها به ترتیب صفر،5/10، 7/21، 5/22 و14 درصد بود. ولی نتایج حاصله از این مطالعه موید 1/8% باروری در بیماران آلوده به باکتری‌های گرم منفی بود که این درصد در مورد بیماران آلوده به باکتری‌های گرم مثبت 25% بود. در کل از نتایج مطالعه حاضرو مطالعه Salim می‌توان چنین نتیجه گرفت که باکتری‌های گرم منفی باعث کاهش چشمگیر در درصد باروری می‌گردند.

در مطالعة حاضر غربالگری فلور باکتریال سرویکس طبق روشهای نمونه‌گیری مرسوم انجام نشده است و قابل قبول است که احتمالا حساسیت روش بررسی با استفاده از نوک کاتتر انتقال جنین، کمتر از حساسیت سواب‌های استاندارد می‌باشد. از این رو تمام الگوهای باکتریولوژی گزارش شده در اینجا باید با توجه به این قضیه تفسیر شود. لذا ممکن است برخی بیماران که در گروه کشت منفی قرار داده شده‌اند، اگر با سواب‌های تهاجمی‌تر و استاندارد نمونه برداری می‌شدند، کشت آنها مثبت می بود. در مطالعه Egbase و همکاران با نمونه برداری با استفاده از سواب و نوک کاتتر در یک گروه از بیماران به ترتیب میزان آلودگی را 9/70% و 1/49% گزارش نمودند که این نتایج موید مطلب فوق می‌باشد. در عین حال، مطالعة حاضر به منظور تحقیق در مورد وجود باکتریهایی که بر روی کاتتر انتقال جنین وجود داشتند و تاثیرات احتمالی آنها بر نتیجه لانه‌گزینی طراحی گردید و هدف آن بررسی لیست کامل انواع فلورسرویکس نبوده است.

لازم اسـت از مطالعاتـی که در آنها ازشیوه‌های مرسوم نمونه‌گیــری جهـت ارزیابــی فـلورباکتریال سرویکس استفـاده مـی‌شود، بـرای پاسخ به این سؤال بهره جست.

نتیجه آنکه، وجود فلورباکتریال سرویکس بالاخص گونه اشریشیا کلی و گونه استرپتوکوک در زمان انتقال جنین با کاهش موفقیت باروری همراه می‌باشد.

با توجه به اینکه پارامترهایی از جمله وضعیت اندومتر، تعداد تخمک، درصد لقاح، تعداد و کیفیت جنین انتقال یافته در دو گروه با باروری موفق وناموفق یکسان بود، و تنها فاکتور متفاوت در دو گروه میزان آلودگی باکتریال می‌باشد. از این‌رو می‌توان نتیجه گرفت که آلودگی‌های باکتریال اندوسرویکس بخصوص از نوع گرم منفی نیز می‌تواند در کاهش لانه‌گزینی دخیل باشند.

تشکر و قدردانی

ابتداء از مسئولین دانشگاه علوم پزشکی اصفهان و مرکز باروری و ناباروی اصفهان که هزینه‌های این مطالعه را فراهم آوردند و همچنین از کلیه متخصصین و همکاران مرکز باروری و ناباروی اصفهان و گروه میکروب‌شناسی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی اصفهان که ما را در این مطالعه یاری نمودند بخصوص سرکار خانم‌ها فریبا و فرحناز مولوی تشکرفراوان را می‌نماییم.