در سال‌های اخیر پیشرفت‌های زیادی در علم کرایوبیولوژی برای حفظ جنین‌های حیوانی و انسانی به روش‌های انجماد آهسته و شیشه‌ای صورت گرفته است. در پروتکل‌های انجماد آهسته، از غلظت‌های پائین مواد ضدیخ استفاده می‌شود که با برودتی با سرعت1/0تا 3/0 درجه سانتیگراد در دقیقه همراه است ولی با توجه به کاهش میزان تکامل جنین پس از انجماد آهسته به دلیل تشکیل کریستال‌های یخ داخل و خارج سلولی و همچنین به دلیل نیاز به دستگاه انجماد و صرف وقت جهت این روش انجماد، امروزه تمایل زیادی به استفاده از انجماد شیشه‌ای در حفظ جنین‌های حیوانی و انسانی وجود دارد که اولین بار در سال 1937 توسط Luyet مطرح شد(1) و در آن به علت استفاده از غلظت بالای ضدیخ و کوتاهی زمان آبگیری، آب به سرعت از سلول خارج شده و محیط اطراف سلول به یکباره تبدیل به یخ شیشه‌ای (یخ فاقد کریستال) می‌شود. ضمناً استفاده از انجماد شیشه‌ای قادر به انجماد جنین از گونه‌هایی بوده است که قبلاً انجماد جنین‌های آنها میسر نبوده است(مثل خوک) (2). با این حال تاکنون یک روش پایدار از انجماد شیشه‌ای پایه‌گذاری نشده است که بتواند میزان بالایی از زنده ماندن جنین را نشان دهد. زیرا تاکنون دقیقاً مکانیسم‌های آسیب جنین به دنبال انجماد شیشه‌ای مشخص نشده است(3). برای تعیین شرایط مناسب برای انجماد جنین ضروری است که مکانیسم‌های آسیب جنین در هر روش تعیین شود. جنین‌ها در معرض انواع متفاوت از آسیب‌ها در طول انجماد هستند. مهمترین آنها، آسیب‌های ناشی از تشکیل یخ داخل سلولی و محلول‌های غلیظ ضدیخ است(4،1) .در انجماد آهسته جنین‌ها، یخ داخل و خارج سلولی عاملی مهم در ایجاد آسیب می‌باشد(5). در صورتی که در انجماد شیشه‌ای سمیت شیمیایی ضد یخ با غلظت بالا مانع مهمی است(6). نتایج نشان می‌دهد که به‌کارگیری روش‌های انجماد، علی‌رغم نقش غیرقابل انکار آنها در درمان افراد نابارور، به دلیل اثرات ضد یخ و تغییرات شدید برودتی و حرارتی می‌تواند تاثیرات نامطلوبی بر فراساختمان سلول داشته و باعث آسیب سلولی به طرق مختلف شود(3). از طرف دیگر مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده که از نظر مورفولوژیکی آپوپتوز نامیده می‌شود(7)، پدیده‌ای است که در تکامل رویانی با حذف سلول‌های ناخواسته نقش مهمی را ایفا می‌نماید و این پدیده تحت تاثیر عوامل مختلف می‌تواند دچار تغییر گردد(8). آپوپتوز یک شکل از مرگ سلولی است که توسط دو شاخص اصلی مشخص می‌شود. شاخص اول شامل ویژگی‌های مورفولوژیکی نظیر کاهش حجم سلول، متراکم شدن کروماتین، قطعه‌قطعه شدن هسته‌ای و در نهایت تشکیل اجسام آپوپتوتیک است و شاخص دیگر، شکسته شدن DNA بوسیله یک اندونوکلئاز وابسته به یون کلسیم و منیزیوم به قطعات اولیگونوکلئوزومی است که امروزه از روشی به نام TUNEL برای رنگ‌آمیزی سلول‌های آپوپتوتیک به طور رایج استفاده می‌شود که در این روش انتهای قطعات DNA تولید شده بوسیله آنزیم دی‌اکسی ترانسفراز انتهایی (TDT) با نوکلئوتیدهای جدید تغییر داده شده (فلوئورسین-dUTP) جایگزین می‌شوند و بنابراین انتهای شکسته‌شده از قطعات DNA دو زنجیره‌ای، مستقل از زنجیره قالب نشان‌دار شده و سپس در زیر میکروسکوپ فلوئوروسنت قابل رویت می‌شود(10،9). در این روش حتی سلول‌های مراحل اولیه آپوپتوز نشان‌دار می‌شوند(7). ثابت شده است که این تکنیک در اندازه‌گیری کمی مرگ سلولی در جنین موش و انسان، که در آن تعداد سلولها کم می‌باشد و بنابراین مقادیر کمی از DNA وجود دارد بسیار مفید است(12-10). لذا در مطالعه حاضر نیز از این روش برای بررسی سلول‌های آپوپتوتیک در بلاستوسیت‌ها استفاده شده است. هدف از مطالعه حاضر این بود که اثرات نامطلوب انجماد به طریق شیشه‌ای شدن را بر روی میزان آپوپتوز در بلاستوسیست‌های موش بررسی نموده و به این ترتیب با شناخت مکانیسم‌های دخیل در آسیب سلولی ناشی از انجماد، در جهت بهبود روش‌های انجماد قدمی برداشته شود.
حیوانات و دریافت جنین: ابتدا موش‌های سوری ماده از نژادSwiss Albino که سن آنها 6 تا 8 هفته بودند از مرکز نگهداری حیوانات دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تبریز خریداری و سپس به مدت یک هفته در حیوانخانه در درجه حرارت oC25 و در شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی نگهداری شدند. سپس به هر یک از موش‌ها به مقدار IU10 PMSG (Folligon, Holand) و حدود48 ساعت بعدIU10 hCG (Oregone, Holland) به طریق داخل صفاقی تزریق شد. سپس موش‌های ماده در مجاورت موش‌های نر به مدت یک شب قرار داده شدند و صبح روز بعد تشکیل پلاک واژینال بررسی گردید و موش‌های پلاک مثبت به عنوان موش‌های حامله تلقی شده و در حدود 98 ساعت پس از تزریق hCG موش‌های حامله به روش جابجایی مهره‌های گردنی نخاعی شده و پس از باز کردن شکم بلاستوسیست‌ها با استفاده از محیط کشتPB1 که براساس پروتکل Whittingham در سال 1971 (13) تهیه شده بود به طریق فلاش کردن از شاخ رحم جمع‌آوری شدند. بلاستوسیست‌های به‌دست آمده به طور تصادفی به دو گروه تقسیم شدند. 52 عدد از بلاستوسیست به عنوان گروه کنترل به مدت دو ساعت در محیط کشتM16 که بر اساس پروتکل Edashige و همکاران در سال 1999 (14) تهیه شده بود، کشت داده شدند و پس از دو ساعت با روش TUNEL، میزان ایندکس آپوپتوز که عبارت است از نسبت سلول‌های آپوپتوتیک به کل سلول‌های بلاستوسیست بر حسب درصد مورد بررسی قرار گرفتند و 43 عدد بلاستوسیست‌های گروه تجربی، بلافاصله پس از فلاش‌شدن به روش انجماد شیشه‌ای منجمد شده و پس از حدود یک ماه مجدداً ذوب و پس از دو ساعت کشت در محیط کشت M16، با روش TUNEL میزان ایندکس آپوپتوز آنها بررسی شدند.
انجماد شیشه‌ای و ذوب‌بلاستوسیست‌ها:بلاستوسیست‌ها پس از دریافت و انکوباسیون در محلول PB1، با روش دو مرحله‌ای که قبلاً توسط Zhu و همکاران در سال 1993 ارائه گردیده بود(15) به مدت 5 دقیقه در محلول اتیلن‌گلیکول 10% (Merck, Germany) قرار داده شده و سپس به مدت 30 ثانیه در محلول EFS40 که عبارت است از محلول PB1 ، حاوی 40% اتیلن گلیکول (V/V)و 18% فایکل با وزن مولکولی 70000 دالتون (Pharmacia, Sweden) وM 3/0 ساکارز(Wako, Japan) منتقل و سپس در نی‌های ml 25/0 (Aigle, France) فرانسوی بارگیری شدند و انتهای نی‌ها با پنس داغ بسته شد و پس از آن نی‌ها در بخار نیتروژن به مدت سه دقیقه قرار گرفته و سپس در نیتروژن مایع غوطه‌ور گردید و پس از یک ماه نی‌ها از تانک بیرون آورده شد. پس از قرار دادن به مدت 15 ثانیه در هوا و قرار دادن در آب oC 25 به مدت 8 ثانیه، با دستمال کاغذی نی‌ها خشک گردید و سپس با بریدن انتهای بسته شده نی با قیچی استریل، محتویات نی به‌صورت flushing تخلیه شد. سپس جنین‌ها به محلول تازه سوکروز 5/0 مولار به مدت پنج دقیقه قرار داده شد. پس از انتقال و انکوباسیون جنین‌ها در محلول PB1 به منظور به تعادل رسیدن، به محلول کشت M16 منتقل گردیده و پس ازدو ساعت کشت میزان ایندکس آپوپتوز بررسی گردید.
رنگ آمیزی TUNEL وPI: رنگ‌آمیزیTUNEL وPI برای بررسی فراگمنته شدن DNA در بلاستوسیست‌ها طبق روش Brison و همکاران در سال 1997(16) انجام شد. به طوریکه در ابتدا بلاستوسیست‌ها، پس از شستشو با محلول دالبکو بافرفسفات (DPBS, Gibco) حاوی 3/0% پلی‌وینیل الکل(PBS/PVA 3mg/ml) در محلول پارافرمالدئید37% (wako, Japan) در PBSبه مدت یک شب در درجه حرارت oC4 ثابت شد. سپس بعد از شستشو با PBS/PVA، به‌مدت 40 دقیقه در محلول 1/0% درصد تریتون X – 100(Sigma, Germany) به منظور افزایش نفوذپذیری زونا پلوسیدا قرار داده شد. بلاستوسیست‌ها پس از شسشو با PBS/PVA در محلول TUNEL (Wako, Japan) براساس دستورالعمل شرکت سازنده به مدت یک ساعت درحرارت oC37 انکوبه گردید.
برای کنترل منفی تعدادی بلاستوسیست فقط در محلول فلوئورسنت به منظور اطمینان از عدم نشانه گذاری بدون آنزیم آنکوبه گردید و برای کنترل مثبت، تعدادی از بلاستوسیست‌ها قبل از آنکوباسیون در محلول TUNEL، در g/ml50 محلول DNase (Sigma, Germany) به مدت یک ساعت انکوبه گردید. پس از انکوباسیون بلاستوسیست‌ها درg/ml50 از محلول RNase A (Sigma, Germany) به مدت یک ساعت، بلاستوسیست‌ها با 50 میکرو‌گرم بر میلی‌لیتر محلول PI (Sigma, Germany) به مدت 20 دقیقه، به منظور نشانه‌گذاری همه هسته‌ها رنگ‌آمیزی زمینه‌ای گردید. سپس بلاستوسیست‌ها پس از شستشو در محلول PBS/PVA با فشار کم لامل در یک قطره l20 از محلول Antibleaching (Oregon, USA) بر روی لام مونتاژ گردید و پس از مهر و موم کردن لبه‌های لام با لاک ناخن، لام‌ها در زیر میکروسکوپ فلوئوروسنت (Olympus, Japan) مورد بررسی قرار گرفت.
روش‌های آماری: نسبت سلول‌های آپوپتوتیک با شمارش سلول‌هایTUNEL مثبت به کل هسته‌های بلاستوسیست (هسته‌های PI مثبت) در همان بلاستوسیست بر حسب درصد بعنوان ایندکس آپوپتوز محاسبه گردید و مقایسه میانگین ایندکس آپوپتوزی بر حسب درصد در گروه ها با آزمون T و در سطح معنی داری 05/0 انجام گردید.
همان طوری که در شکل شمارة 1- الف دیده می‌شود تمام بلاستومرهای جنین‌های کنترل مثبت با تکنیک TUNEL نشانه‌گزاری شدند و حتی قطعات هسته (DNA Fragmentation) در بعضی از هسته‌ها به صورت قطعات کوچک زرد رنگی به خوبی قابل مشاهده هستند و هیچ یک از بلاستومرهای جنین‌های کنترل منفی با تکنیک TUNEL نشانه‌گزاری نشدند و فقط با رنگ‌آمیزی زمینه‌ای PI)) به رنگ قرمز رنگ‌آمیزی شدند ( شکل شمارة 1- ب). شکل شمارة 1- ج، بلاستوسیستی از گروه کنترل را پس از رنگ آمیزی با تکنیک TUNEL نشان می‌دهد، به طوری که در شکل مشاهده می‌شود تعداد چهار سلول آپوپتوتیک با رنگ سبز مایل به زرد از بقیه سلولها که رنگ PI را گرفته‌اند بخوبی قابل تشخیص می‌باشند.
در بلاستوسیست‌های گروه تجربی که پس از انجماد و ذوب برای آپوپتوز رنگ‌آمیزی شدند، سلول‌های آپوپتوتیک با تکنیک TUNEL بخوبی نشان‌دار شدند و کامـلاً از سلـول‌های غیـرآپوپتوتیک که با رنگ‌آمیزی PI به رنگ قرمز دیده می شوند، قابل تشخیص هستند.
همانطور که در شکل شمارة 1- د مشاهده می‌شود، فقط تعداد سلول های آپوپتوتیک در مقایسه با بلاستوسیست های گروه کنترل زیادتر می‌باشند.
همانطوری که در جدول 1 مشاهده می‌شود، نتایج نشان داد میانگین تعداد بلاستومرها در بلاستوسیست‌های گروه کنترل موش 9/20±23/50 بود در حالیکه میانگین تعداد بلاستومرها در بلاستوسیست‌های گروه منجمد شده 2/16±91/44 بود و اختلاف میانگین تعداد بلاستومرها در گروها تفاوت معنی‌داری را نشان نداد(176/0P=).
میانگین تعداد بلاستومرهای آپوپتوتیک در بلاستوسیست‌های گروه کنترل در حدود 04/2±08/4 بود در حالیکه این میانگین در بلاستوسیست‌های گروه منجمد شده در حدود 42/1±93/4 بود و اختلاف میانگین بین دو گروه معنی‌دار بود(02/0p=).
میانگین میزان ایندکس آپوپتوز در بلاستوسیست‌های منجمد شده که پس از ذوب به مدت دو ساعت کشت داده شدند در حدود 11/4±87/11 بود. در صورتیکه میانگین میزان ایندکس آپوپتوز در گروه کنترل (بلاستوسیست‌های منجمد نشده) در حدود 83/4±12/9 بود و تفاوت بین آنها معنی‌دار بود (004/0P=).
هدف از مطالعه حاضر، بررسی میزان آپوپتوز در بلاستوسیست‌ها پس از انجماد، ذوب و کشت با مشاهده قطعه قطعه شدن DNA در هسته بلاستومرها با تکنیک TUNEL بود. اگر چه مطالعات اندکی، در مورد اثرات انجماد و آنهم بر روی تخمدان انجام شده است، ولی هیچگونه مطالعه‌ای در مورد اثرات انجماد شیشه‌ای بر میزان آپوپتوز در بلاستوسیست موش و حتی گونه‌های دیگر انجام نشده است. درمطالعه حاضر، همان طوری که در نتایج دیده می‌شود، میزان ایندکس آپوپتوز در بلاستوسیست‌های منجمد شده که پس از ذوب به مدت 2 ساعت کشت داده شدند نسبت به بلاستوسیست‌های منجمد نشده به طور معنی‌داری بیشتر بود(9/11 در مقابل 2/9 و005/0p=). به طور مشابهی، در مطالعه‌ای، Yuge و همکاران نشان دادند که سرد کردن تخمدان خوک در درجه حرارت پایین تر ازoC 25 باعث کاهش میزان تکامل اووسیت‌های آسپیره شده به بلاستوسیست پس از IVF و کشت متعاقب آن می‌شود(17)؛ اگرچه نوع آسیب و ارتباط آن با آپوپتوزیس، در این مطالعه مشخص نشد. توسط تعداد دیگری از محققین گزارش شده است که بعضی از فولیکول‌ها در انسان در طول انجماد آهسته و ذوب دچار آسیب می‌شوند(18)؛ به نظر می‌رسد قسمت اعظم فولیکول‌های بدوی از نظر مورفولوژیکی بعد از انجماد و ذوب طبیعی باشند(19). در مطالعه دیگری که توسط Rahimi و همکاران در سال 2003 انجام گردید. محققین اثر پروتکل‌های متفاوت انجماد شیشه‌ای را بر تعداد سلول‌های آپوپتوتیک در بافت تخمدان انسانی با استفاده از رنگ فلوئورسنت مورد مطالعه قرار دادند و مشاهده نمودند که وقتی قطعات تخمدان با استفاده از نی یا صفحه مشبک میکروسکوپ الکترونی مستقیما در نیتروژن مایع غوطه‌ور می‌شوند (انجماد شیشه‌ای خیلی سریع) تفاوت قابل ملاحظه‌ای در میزان سلول‌های آپوپتوتیک نسبت به گروه کنترل دیده نشد و در مقابل وقتی که نمونه‌ها مشابه مطالعه حاضر ابتدا در بخار نیتروژن مایع (oC120-) قرار گرفته و سپس در نیتروژن مایع غوطه‌ور شدند (انجماد شیشه‌ای با سرعت کمتر) تعداد سلول‌های آپوپتوتیک به طور قابل ملاحظه‌ای بعد از ذوب نسبت به گروه کنترل بیشتر بود(20).
در تحقیقی دیگر که در آن برش‌هایی به اندازة mm2 از کورتکس تخمدان به طریق انجماد آهسته منجمد شدند نشان داد که اگرچه درصد فولیکول‌های با مورفولوژی طبیعی، در گروه منجمد شده، در مقایسه با گروه کنترل، به طور قابل ملاحظه‌ای کمتر بود ولی نتایج با تکنیک TUNEL نشان داد که درصد فولیکول‌های TUNEL مثبت در قطعات فریز شده نسبت به گروه کنترل، تفاوت قابل ملاحظه‌ای نداشتند(21) و این نتایج با نتایج تحقیق حاضر همسو نمی‌باشد و علت تفاوت نتایج را می‌توان در تفاوت در پروتکل انجمادی و مرحله تکاملی سلولها توضیح داد، به طوری که در مطالعه اخیر از پروتکل‌های انجماد آهسته استفاده شده در حالیکه در مطالعه حاضر با روش انجماد شیشه‌ای، سلولها منجمد شدند و از آنجایی که در روش انجماد شیشه‌ای، از غلظت‌های بالای ضد یخ استفاده می‌شود (اتیلن گلیکول40%) که می‌تواند تاثیرات سوء بر سلول داشته باشد، لذا تفاوت نتایج حاضر با نتایج مطالعات قبلی که با روش انجماد آهسته با استفاده از اتیلن گلیکول 10% صورت گرفته، امری واضح و بدیهی بنظر می‌رسد. در ضمن در مطالعه اخیر، اووسیت‌ها در مراحل مختلف تکاملی در تخمدان مورد مطالعه قرار گرفتند؛ در حالیکه در مطالعه حاضر، جنین‌های مرحله بلاستوسیست مورد مطالعه قرار گرفتند و بر اساس گزارش محققین، میزان حساسیت اووسیت و جنین نسبت به انجماد متفاوت است(22).
در تجربه قبلی که اثر ضد یخ‌های مختلف را بر میزان آپوپتوزیس در بلاستوسیست‌های خوک در دانشگاه یاماگوچی ژاپن مورد مطالعه قرار دادیم، نشان دادیم وقتی که بلاستوسیست‌های خوک تولیدشده به روش In vitro (IVM , IVF وIVC ) در معرض مواد ضد یخ مختلف مثل اتیلن گلیکول، گلیسرول و 1و2 پروپاندیول به مدت 30 دقیقه قرار گرفتند، میزان فراگمنته شدن DNA در آنها (9/19 در مورد اتیلن گلیکول) نسبت به گروه کنترل (6/11) به طور معنی‌داری بیشتر بود(مقاله چاپ نشده). تفاوت در میانگین ایندکس آپوپتوز در تجربه قبلی نسبت به تجربه حاضر می‌تواند به دلیل تفاوت در نوع جنین تحت تجربه، تفاوت درمدت زمان در معرض قرار گرفتن در ماده ضد یخ (30 دقیقه در مقابل 5 دقیقه) و بالاخره کیفیت بلاستوسیست باشد که در تجربه قبلی بلاستوسیست به روش In vitro تولید شده و براساس گزارش محققین، کیفیت بلاستوسیست‌های تولید شده به روش In vitro به دلیل اثرات زیانبار محیط کشت بر روی جنین و فقدان ترشحات پاراکرینی مترشحه از لوله‌های رحمی، پایین‌تر از کیفیت بلاستوسیست‌های تولید شده به روشIn vivo می‌باشد و بنابراین میزان ایندکس آپوپتوز در بلاستوسیست‌های تولید شده به روش In vitro بیشتر می‌باشد(16،8).
نتایج محققین نشان می‌دهد که استفاده از ضدیخ‌های مختلف به تنهایی یا طی فرآیند انجماد، هرکدام می‌تواند تأثیرات زیادی را بر فرا ساختمان سلول داشته باشد(23) و از حساس‌ترین ساختار، نسبت به تغییرات شدید برودتی و حرارتی و یا غلظت‌های مختلف ضدیخ، می‌توان اسکلت سلول، میتوکندری و قشر شفاف را نام برد(23) و از آنجایی که بسیاری از فعالیت‌های مهم سلول از جمله جابجایی کروموزوم‌ها طی تقسیم وستیوکنیز وابسته به عناصر اسکلت سلول می‌باشند، هرگونه آشفتگی درآن، می‌تواند تأثیر زیادی بر تکوین و تکامل تخمک و جنین داشته باشد(24). حتی نشان داده شده است که انجماد ممکن است باعث سختی قشر شفاف به دلیل تغییر ماهیت بیوشیمیایی آن شود(26،25). یافته‌های دیگری نیز نشان می‌دهد که انجماد سبب اختلال فعالیت پمپ‌های تنظیم‌کنندة pH موجود در غشاء سلولی طی 6-4 ساعت اولیه پس از ذوب می‌شود و اختلال فعالیت این پمپ‌ها سبب اختلال PH درون سلولی و در نتیجه کم شدن توانایی حیات سلولها می‌گردد(25) و لذا می‌توان گفت که در تجربه حاضر قطعه‌قطعه شدن زیاد DNA در بلاستوسیست‌های منجمد شده می‌تواند هم به دلیل اثر سمیت شیمیایی ضدیخ و هم به دلیل تغییرات شدید حرارتی و برودتی باشد که احتمالاً بر روی بروز ژن‌های مسئول قطعه‌قطعه شدن DNA در جنین مثل
BCl2 و Bax تأثیرمی‌گذارد(27). نتایج بررسی حاضر نشان داد که انجماد شیشه‌ای باعث افزایش میزان آپوپتوزیس در بلاستوسیست‌های موش می‌شود. بنابراین نتایج فوق ارتباطی را ما بین کاهش زنده ماندن جنین بدنبال انجماد و افزایش میزان آپوپتوزیس در بلاستومرها نشان می‌دهد. بنابراین هر عاملی که از رشد و تکامل نرمال سلولها جلوگیری کند، زمینه را برای بروز آپوپتوز در آنها فراهم می‌نماید.
از معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی، درمانی تبریز برای تامین هزینه انجام این مطالعه و آقایان دکتر مسگری، مهندس دادپور که به ترتیب در استفاده از امکانات حیوانخانه مرکز تحقیقات کاربردی دارویی دانشگاه و تهیه عکس‌های میکروسکوپی نهایت همکاری را داشتند، تقدیر و تشکرمی‌نمایم.
