زمینه و هدف

ناباروری یکی از مشکلات اساسی مردانی است که دچار ضایعة نخاعی (SCI) می‌گردند. عدم انزال مناسب و کاهش کیفیت مایع منی به عنوان دلایل اصلی ناباروری در این بیماران می‌باشد (1). مطالعات انسانی و حیوانی متعددی صورت پذیرفته که همگی نشان‌دهندة کاهش کیفیت اسپرم در افراد مبتلا به SCI می‌باشند (4-1). کم شدن قابلیت حیات، کاهش میزان تحرک، ضعف در نفوذ به موکوس سرویکس و افزایش درصد اسپرم با ناهنجاری‌های مورفولوژیکی از موارد قابل ذکر در نمونه‌های اسپرم مردان SCI می‌باشد (2،3،5). تغییرات کیفی و کمی اسپرم در وضعیت SCI، در ارتباط مستقیم با اختلال اسپرماتوژنز می‌باشد (8-6). اولین بار در سال 1950، Bors متوجه تغییراتی در ساختار بافت‌شناسی بیضة بیماران ضایعة نخاعی شد. در این افراد کاهش تولید سلول‌های جنسی و اختلال فرایند انزال دیده شد. وی علت این اختلالات را به هم خوردن تعادل هورمونی در محور هیپوتالاموس، هیپوفیز، بیضه بیان کرد (9).

Brindley در سال 1982 نشان داد که تغییر در فعالیت بیضه بدنبال SCI می‌تواند در اثر اختلال در تنظیم درجه حرارت بیضه به دنبال قطع عصب‌دهی آن باشد. افزایش درجه حرارت بیضه می‌تواند سبب بروز اختلالاتی در اسپرماتوژنز گردد (10). در مطالعة دیگری که در سال 1994 توسط Linsenmeyer صورت پذیرفت، به دنبال ایجاد ضایعة نخاعی در سطح T9 در رت، ناهنجاری‌های متعددی همانند اسپرماتوژنز ناقص، تحلیل اپیتلیوم ژرمینال، تأخیر در تخلیه اسپرم و تغییرات دژنراتیو در اسپرماتید مشاهده شد (2). Huang نیز در سال 1995 پس از ایجاد ضایعة نخاعی در رت و اندازه‌گیری تغییرات هورمون‌های هیپوتالاموس، هیپوفیز و بیضه، مکانیزم اصلی اختلالات اسپرماتوژنز و کاهش کیفیت اسپرم در وضعیت SCI حاد را تغییرات موقت در هورمون‌های مذکور بیان نمود (6). وی در مطالعة دیگری که در سال 1998 انجام داد، قطع عصب‌دهی را مکانیزم اصلی اختلالات اسپرماتوژنز در وضعیت SCI مزمن عنوان نمود (8). به طور کلی با توجه به شواهد موجود، علی‌رغم اتیولوژی ایجاد اختلال در عملکرد بیضه، بروز ناهنجاری‌های متعدد در اسپرماتوژنز را می‌توان به عنوان نتیجة مهم ضایعة نخاعی بیان کرد. یکی از مراحل اساسی فرآیند تولید سلول‌های جنسی نر، ایجاد تراکم کروماتین در طی تمایز اسپرماتید به اسپرم و سپس در طی عبور اپیدیدیمی اسپرم می‌باشد. مطالعات ارتباط مستقیمی بین تراکم مطلوب کروماتین و سلامت ساختار DNA و میزان باروری اسپرم نشان داده‌اند (12،11). در بیضه پستانداران طی فاز اسپرمیوژنز، هیستون‌های متصل به DNA توسط پروتئین‌های بازی به نام پروتامین جایگزین گردیده و این امر سبب ایجاد تراکم در کروماتین و توقف فعالیت نسخه‌برداری می‌شود. در فاز اپیدیدیمی ضمن عبور اسپرمها، گروه‌های تیول (-SH) پروتامینها اکسید می‌شود و در بین و داخل این مولکولها، باندهای دی‌سولفیدی فراوانی تشکیل می‌گردد. وجود این پلهای دی‌سولفیدی جهت ایجاد تراکم نهایی و پایداری فیزیکی و شیمیایی کروماتین ضروری است. (14،13). در مطالعه‌ای که بر روی روند ایجاد تراکم کروماتین اسپرم در رت صورت گرفت، مشخص شد که کروماتین اسپرم‌های موجود در سر اپیدیدیم دارای 84% تیول آزاد و کروماتین اسپرم‌های موجود در ناحیة دم این ارگان دارای 14% تیول آزاد می‌باشند. وجود این تفاوت بیانگر ایجاد باندهای دی‌سولفیدی به میزان 5/1میلیارد به ازاء هر اسپرم، ضمن عبور از اپیدیدیم می‌باشد (15). به دنبال ایجاد تراکم مطلوب کروماتین، DNA دو رشته‌ای اسپرم توسط نوکلئوپروتئینها احاطه می‌شود و از عوامل مخربی همچون اسیدها، حرارت، پروتئازها، DNAse، گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و پاک‌کننده‌ها در امان می‌ماند (15). بنابراین هرگونه اختلال در فرآیند ایجاد تراکم کروماتین اسپرم، می‌تواند سبب ایجاد ضایعه در DNA گردد و پتانسیل باروری اسپرم را متأثر می‌سازد. مطالعات، نشان دهنده افزایش درصد اسپرم‌هایی با کروماتین غیر طبیعی (12) و DNA ناهنجار (16،11) در افراد نابارور نسبت به افراد بارور می‌باشد. Evenson در سال 1980 بیان کرد که هرگاه در بیش از 30% اسپرمها، ناهنجاری‌های DNA همانند شکست و یا دناتوره شدن وجود داشته باشد، نمونه مذکور نابارور محسوب می‌شود (17). علی‌رغم اهمیت فراوان فرآیند متراکم شدن کروماتین و تمامیت ساختار DNA اسپرم در باروری، این موضوع در بیماران SCI کمتر مورد توجه قرار گرفته است. درحالیکه با در نظر گرفتن بیولوژی SCI، دلایل زیادی مبنی بر ایجاد ضایعات کروماتین در اسپرم این افراد وجود دارد. قطع عصب‌دهی و افزایش درجه حرارت بیضه، اختلال فونکسیون اپیدیدیمی و سیستم انتقالی اسپرم، افزایش میزان ROS از جمله عواملی هستند که می‌توانند بر فرآیند بلوغ هسته اسپرم در وضعیت SCI تأثیرگذار باشند (18،19، 10-7).

بنابراین با توجه به کاهش باروری در مردان ضایعه نخاعی و تغییر احتمالی کیفیت کروماتین و DNA اسپرم در این افراد به عنوان یکی از دلایل کاهش، مطالعه‌ای با هدف بررسی تأثیر ضایعه نخاعی بر دو فاز بیضه‌ای و اپیدیدیمی ایجاد تراکم کروماتین اسپرم بدنبال یک دوره اسپرماتوژنز در مدل حیوانی رت در مرکز تحقیقاتی- درمانی ناباروری شهید صدوقی یزد و گروه آناتومی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی صورت پذیرفت.

روش بررسی

حیوانات: تعداد 45 رت نر بالغ از نژاد wistar با وزن g350-300 را به سه گروه SCI، شم و کنترل تقسیم و به مدت حداقل چهار هفته قبل از شروع آزمایش در شرایط نوری و حرارتی کنترل شده نگهداری شدند.

الف) گروه SCI : تعداد 15 رت توسط تزریق داخل عضلانی کتامین (mg/kg80) و زایلازین (mg/kg 10) بیهوش شدند (20)، پس از مشخص شدن سطحی مهره T10 توسط لمس، پوست حیوان تراشیده و تحت شرایط استریل با ایجاد برش و برداشتن لایه‌های عضلانی و استخوان مهره سینه‌ای مذکور، عمل لامینکتومی در زیر استریو میکروسکوپ (Zeiss, Germany) انجام گردید. سپس مهره‌های T9 و T11 توسط فورسپس مناسب ثابت شده و طناب نخاعی به همراه پوشش سخت شامه جهت ایجاد ضایعه نخاعی ضربه‌ای مشخص گردید. وزنه فلزی g15 به شکل میله و با سطح مقطع mm2 از ارتفاع cm10 رها گردید، که پس از برخورد به نخاع و ایجاد SCI بلافاصله از محل برداشته شد. بروز ضایعه نخاعی با مشاهده خونریزی و کبودی توسط میکروسکوپ استریو مورد تأیید قرار گرفت. در مرحله بعد به دنبال شستشوی محل توسط سرم فیزیولوژی، لایه‌های عضلانی و پوست توسط نخ بخیه دوخته شدند. مراقبت‌های پس از عمل شامل ضد عفونی نمودن محل زخم توسط محلول بتادین و آب اکسیژنه 2%، تزریق زیر جلدی ml10 ‌ سرم فیزیولوژی و تزریق داخل عضلانی mg/kg 3/33 آنتی‌بیوتیک سفازولین و قراردادن حیوان بر روی تشک الکتریکی صورت پذیرفت. (21، 7) بدنبال ایجاد SCI، از روز دوم به مدت حداقل2 هفته، روزانه دو مرتبه تخلیة ادرار توسط ماساژ و کمپرس مثانه انجام گردید. در طی هفته اول نیز استریل نمودن محل زخم و تزریق آنتی‌بیوتیک ادامه داشت. حیوانات گروه SCI به مدت 56 روز (بیش از یک دوره اسپرماتوژنز در رت) به صورت انفرادی در قفس تمیز مورد مراقبت‌های ویژه قرار گرفتند.

ب) گروه شم: تعداد 15 رت، تنها مورد عمل جراحی لامینکتومی قرار گرفتند و مراقبت‌های ویژه پس از عمل بجز تخلیه مثانه، در این گروه نیز صورت گرفت. این حیوانات به مدت 56 روز به صورت انفرادی در قفس‌های تمیز نگهداری شدند.

ج) گروه کنترل: تعداد 15 رت بدون انجام هیچ عمل جراحی و یا تزریق، به مدت 56 روز به صورت انفرادی در قفس نگهداری شدند.

نمونه گیری: پس از هشت هفته، به دنبال بیهوش نمودن حیوانات توسط زایلازین و کتامین در هر سه گروه، ناحیه اپیدیدیم طی عمل جراحی جدا شده و در محیط کشت T6 قرار گرفتند.

با فشردن و تکان دادن آرام بافت اپیدیدیم، اسپرمها به صورت swim- out وارد محیط کشت شدند (19). ظروف دهان گشاد محتوی سوسپانسیون اسپرم به مدت 30 دقیقه در انکوباتور °C37 با فشار 5% CO2 قرار داده شدند.

آنالیز اسپرم: جهت بررسی مورفولوژی اسپرم، با قراردادن یک قطره از نمونه‌های هر سه گروه در گوشه لام، اسمیر تهیه گردید. پس از خشک شدن در هوا، توسط متانول ثابت و با روش گیمسا، رنگ‌آمیزی شدند. در نهایت تعداد 100 اسپرم طبیعی و غیر طبیعی مورد شمارش قرار گرفتند.

جهت بررسی تحرک اسپرمها، مقدار l10 از هر نمونه توسط سمپلر برداشته و در محفظه Mackler chamber تخلیه شد. در بررسی میکروسکوپی نمونه‌ها با بزرگنمایی 20 برابر طبق دستورالعمل WHO، اسپرمها به سه گروه تحرک پیشرونده، تحرک درجا و غیرمتحرک تقسیم شدند و بر این اساس صد اسپرم مورد شمارش قرار گرفتند (22).

ارزیابی کیفیت کروماتین / DNA اسپرم:

الف) رنگ‌آمیزی آنیلین بلو (AB) : پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسید آمینه‌های لیزین می‌باشد که با رنگ‌های اسیدی همانند AB واکنش می‌دهد و آبی رنگ می‌شود. بنابراین اسپرم‌هایی که پس از ایجاد تراکم در کروماتین خود دارای هیستون اضافی باشند با این رنگ‌آمیزی مشخص می‌شوند (24،23). برای انجام این تست پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا، توسط فیکساتیو گلوتارآلدئید 3% در بافر فسفات (ml14 NaH2PO4 با غلظت M2/0+ ml36 Na2HPO4 دارای غلظت M2/0، 2/7 pH=) به مدت 30 دقیقه عمل ثابت شدن صورت پذیرفت. در مرحله بعد نمونه‌ها توسط محلول 5% آنیلین‌بلو در اسید استیک 4% (5/3=pH) به مدت 5 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر و مونته کردن توسط چسب انتالن، لامها را با میکروسکوپ نوری و عدسی 100 مورد بررسی قرار داده و با شمارش صد اسپرم، تعداد اسپرم‌های بی رنگ (بالغ) و آبی رنگ (نابالغ) در هر نمونه تعیین گردیدند (25).

ب) رنگ آمیزی کرومومایسین A3 (CMA3) : رنگ فلورسنت CMA3 با مولکول پروتامین جهت اتصال به شیار کوچک DNA رقابت می‌نماید و به طور غیرمستقیم میزان کمبود پروتامین را در ساختار کروماتین نشان می‌دهد. اسپرم‌هایی با نقصان پروتامین توسط CMA3 رنگ می‌گیرند و ضمن بررسی با میکروسکوپ فلورسنت به رنگ زرد درخشان دیده می‌شوند. این اسپرمها در واقع اسپرم‌هایی با کروماتین نابالغ محسوب می‌گردند (26، 25).

برای رنگ‌آمیزی کرومومایسین، پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک نمودن در هوا، لامها توسط فیکساتیو کارنوی (متانول- اسید استیک گلاسیال به نسبت 3:1) به مدت 10 دقیقه در یخچال ثابت و سپس توسط l100 محلول CMA3 ‌به مدت 10 دقیقه رنگ‌آمیزی شدند. در مرحله بعد پس از شستشو توسط بافر مک‌الوین (سیترات فسفات) و مونته کردن با چسب انتالن لامها با میکروسکوپ فلورسنت (Zeiss, Germany) Axiplane و فیلتر مناسب (460-470nm) بررسی شدند. با شمارش یک صد اسپرم، تعداد اسپرم‌های زرد فلورسنت درخشان (CMA3+) و اسپرم‌های فاقد درخشندگی (CMA3-) در هر نمونه مشخص گردید (26،25).

ج) تست بررسی پایداری کروماتین توسط (SDS) و رنگ‌آمیزی تولوئیدن بلو (TB) : جهت ایجاد پایداری در کروماتین به هنگام عبور اسپرم از اپیدیدیم باندهای دی‌سولفیدی (S-S) در بین و داخل مولکول‌های پروتامین تشکیل می‌شود. پاک‌کننده SDS پس از تخریب غشاء هسته اسپرم، می‌تواند باندهای دی‌سولفیدی را احیاء نماید و سبب تشکیل گروه‌های آزاد تیول در کروماتین گردد. هرچه پایداری کروماتین کمتر باشد، تعداد بیشتری از باندهای دی‌سولفیدی توسط SDS شکسته می‌شود و سر اسپرم تورم بیشتری پیدا می‌کند؛ به همین دلیل به کارگیری SDS را "تست خروج از تراکم" نیز می‌نامند. بسته به میزان خروج از تراکم کروماتین می‌توان اسپرمها را رتبه بندی نمود (25،27،28).

تولوئیدن‌بلو رنگ‌های متاکروماتیک است که پس از احیاء باندهای دی‌سولفیدی در کروماتین توسط SDS و در دسترس قرار گرفتن DNA ، به گروه فسفات آن متصل می‌گردد. بدیهی است که هرچه میزان تراکم کروماتین کمتر باشد، رنگ‌پذیری DNA توسط TB افزایش می‌یابد. در نهایت ضمن بکارگیری رنگ مذکور می‌توان طیفی از رنگها شامل آبی روشن، بنفش و ارغوانی، به دست آورد (28،24). استفاده از TB به همراه رتبه‌بندی اندازه سر اسپرم به مراتب دقیق‌تر از اندازه‌گیری سر اسپرم به تنهایی می‌باشد (حداقل در مورد رت).

برای انجام تست SDS، مقدار l 100 از نمونه هر حیوان برداشته شد و به l 400 SDS 1% در بافر بورات M 05/0 (ml88 NaOH M1/0+ ml2/4 ترابورات سدیم M25/0+ ml400 آب مقطر، 9pH=) اضافه گردید. پس از انکوبه شدن نمونه‌ها در دمای C37 به مدت 120 دقیقه با اضافه کردن حجم مساوی گلوتار آلدئید 5/2% در بافر بورات M05/0، از ادامه واکنش ممانعت به عمل آمد (25).

در مرحله بعد اسمیرهای حاصله از سوسپانسیون فوق در هوا خشک شد و توسط مخلوط مساوی اتانول– استن در  C4 به مدت 30 دقیقه ثابت شدند. هیدرولیز اسیدی نمونه‌ها توسط اسید کلریدریک 1/0 نرمال، به مدت 5 دقیقه در  C4 انجام شد و سپس سه بار و هر بار به مدت 2 دقیقه توسط آب مقطر شستشو گردید.

رنگ‌آمیزی توسط محلول 5% تولوئیدن‌بلو (Merck, Germany) در بافر 50% مک‌الوین به مدت 10 دقیقه انجام شد (28،24).

جهت ارزیابی نمونه‌های فوق با میکروسکوپ نوری، میزان 1% اسپرمها در هر لام شمارش شد و اسپرمها براساس اندازه و رنگ سر رتبه بندی شدند. اسپرم با کروماتین طبیعی (آبی روشن) و بدون تورم در سر تحت عنوان So، اسپرم با کروماتین نسبتاً ناهنجار (آبی تیره) و سری نسبتاً متورم تحت عنوان S1، اسپرم با کروماتین ناهنجار (بنفش) و سری متورم تحت عنوان S2 و بالاخره اسپرم با کروماتین بسیار ناهنجار (ارغوانی) و سری بسیار متورم تحت عنوان S3 در نظر گرفته شد.

د) رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO) : این رنگ فلورسنت جهت تمایز DNA دو رشته‌ای سالم از DNA تک رشته‌ای دناتوره شده به کار می‌رود. AO با DNA سالم زیر میکروسکوپ فلورسنت سبز رنگ و با DNA تک رشته‌ای قرمز رنگ می‌شود. پس از تهیه اسمیرو خشک نمودن در هوا فیکساسیون اسمیرها توسط محلول کارنوی (متانول- اسیداستیک به نسبت1: 3) به مدت حداقل 2 ساعت (ترجیحاً Overnight) انجام گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت mg19/0 در بافر سیترات فسفات به مدت 10 دقیقه بر روی لام ریخته‌شد. پس از شستشوی لامها توسط آب جاری و قرار دادن لامل روی آنها، توسط میکروسکوپ فلورسنت با فیلتر nm460 بررسی شد (25،24).

بررسی آماری: پس از جمع‌آوری داده‌ها، آنها را کدگذاری نموده و اطلاعات به کامپیوتر وارد گردید. با استفاده از آزمون‌های آماری آنالیز واریانس ANOVA برای مقایسه سه گروه و تست LSD برای مقایسه دوبه دو گروهها تجزیه و تحلیل آماری با 05/0P< صورت پذیرفت.

درمورد تست CMA3 به دلیل عدم توزیع طبیعی داده‌ها از آزمون‌های غیر پارامتری Kruskal-wallis برای مقایسه سه گروه و Mann-Whitney برای مقایسه دوبه دو گروهها استفاده گردید. تمام داده‌ها به صورت میانگین± انحراف معیار می‌باشند. در گزارش داده‌ها از جداول و شاخصهای آماری به صورت MSD و برای تحلیل از آزمون‌های آماری آنالیز واریانس یکطرفه ودر صورت نیاز آزمون تعقیبی LSD و آزمون‌های غیرپارامتری من‌ویتنی و کروسکال والیس استفاده شده است. سطح معنی‌داری 05/0= در نظر گرفته شد و از نرم افزار آماری SPSS ویرایش 11 استفاده گردید.

نتایج

در این آزمایش تعداد 5 رت مردند. از این تعداد سه رت درطی عمل جراحی و ایجاد ضایعه نخاعی و دو رت دیگر در اثر پارگی مثانه در ضمن تخلیه ادرار از بین رفتند.

الف) پارامترهای اسپرم: با توجه به جدول شماره 1، میانگین درصد اسپرم‌های با تحرک پیشرونده (سریع و آهسته) و مجموع تمامی درجات حرکتی در گروه SCI نسبت به دو گروه شم و کنترل کاهش معنی‌داری داشت. در حالیکه این تفاوت در مورد تحرک درجا در بین سه گروه معنی‌دار نبود. در مقایسه دو به دو گروهها، تحرک پیشرونده و مجموع تمامی درجات حرکتی در بین دو گروه شم و کنترل، بدون تفاوت ولی در بین دو گروه SCI و شم دارای تفاوت معنی‌داری بودند. در بررسی پارامتر مورفولوژی (جدول شماره 1) میانگین درصد اسپرم‌هایی با مورفولوژی غیرطبیعی در گروه SCI افزایش معنی‌داری را نسبت به گروه‌های شم و کنترل نشان داد. مقایسه دو به دو گروهها نشان‌دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در بین گروه‌های کنترل و شم و تفاوت معنی‌داری در بین گروه‌های شم و SCI بود.

(در بررسی پارامترهای اسپرم 05/0P< در نظر گرفته شد).

ب) ارزیابی کیفیت کروماتین / DNA اسپرم: با توجه به جدول شماره 2 تست‌های AB و CMA‌3 (شکل شمارة 1 و2) تفاوت معنی‌داری در بین سه گروه نشان نداد. در مقایسه دو به دو گروهها نیز تفاوت معنی‌داری در بین گروه‌های شم و کنترل و همچنین در بین گروه‌های شم و SCI مشاهده شد. در تست SDS و رنگ‌آمیزی TB، ابتدا برای هر نمونه میزان Total score طبق رابطه زیر محاسبه گردید.

Total score = (Soo) + (S1 1) + (S22) + (S3 3) مطابق جدول دو، اسکور توتال در بین گروه SCI و گروه‌های کنترل و شم تفاوت معنی‌داری داشت. همچنین صرف میانگین مجموع اسپرم‌هایی با تورم سر (S1+S2+S3) در گروه SCI نسبت به دو گروه افزایش معنی‌داری را نشان داد (شکل شمارة 3).

در مقایسه دو به دو گروهها، پارامترهای Total score و مجموع اسپرم‌هایی با تورم سر، در بین گروه‌های شم و کنترل بدون تفاوت بود؛ در حالیکه این دو پارامتر در بین گروه SCI و گروه شم تفاوت معنی‌داری را نشان داد.

در مورد تست AO، با توجه به جدول شماره 2، تفاوت معنی‌داری در بین گروه SCI و گروه‌های شم و کنترل مشاهده گردید (شکل شمارة 4). به عبارتی در گروه ضایعه نخاعی، میانگین اسپرم‌هایی با DNA غیرطبیعی افزایش معنی‌داری را نسبت به دو گروه دیگر نشان داد. در مقایسه دو به دو گروهها، تفاوت معنی‌داری در بین گروه‌های کنترل و شم مشاهده نشد. در حالیکه بین گروه‌های SCI و شم، این تفاوت معنی‌دار بود (در تمام قسمت‌های بررسی کروماتین اسپرم (05/0P<) در نظر گرفته شد).

بحث

از آنجائیکه بیماران ضایعه نخاعی از نظر عوامل ایجاد کننده، شدت ضایعه و مدت زمان بیماری در وضعیت مشابهی نمی‌باشند و با توجه به شباهت زیاد فرآیند اسپرماتوژنز و بلوغ اسپرم در انسان و رت، جهت انجام بررسی کنترل شده، در مطالعة حاضر از مدل حیوانی رت استفاده گردید. در بخش نتایج، اسپرم حیوانات SCI پارامترهای مورفولوژی و تحرک متفاوتی را نسبت به گروه‌های شم و کنترل نشان دادند.

به عبارتی میزان تحرک پیشرونده، کل اسپرم‌های متحرک و درصد اسپرم‌های با مورفولوژی طبیعی به طور معنی‌داری در گروه SCI نسبت به دو گروه دیگر کاهش پیدا کرده بود. این یافته توسط دیگر محققان نیز در مطالعات انسانی و حیوانی به دست آمده است (1،2،4،9،10).

Billups در سال 1990 با انجام عمل جراحی سمپاتکتومی در رت و بررسی اسپرم‌های ناحیه دم اپیدیدیم، مشاهده نمود که سرعت حرکت این اسپرمها در محیط کشت به‌ طور معنی‌داری کاهش یافته است (29).

گروه تحقیقاتی Linsenmeyer نیز در سال 1999 با ایجاد ضایعه نخاعی در سطح T9 رت، نشان دادند که زمان عبور اسپرم از سر به دم اپیدیدیم به طور معنی‌داری در گروه تجربی نسبت به گروه شم افزایش می‌یابد. آنها تأخیر در انتقال اسپرم را یکی از دلایل اصلی کاهش کیفیت سیمن، خصوصاً کاهش تحرک اسپرم در وضعیت SCI بیان داشتند (30). در مطالعه دیگری که توسط Hung در سال 2003 بر روی رت‌های SCI صورت گرفت، میزان تحرک اسپرم‌های اپیدیدیمی متناسب با شدت ضایعه دچار کاهش شده بود (4). مطالعات گسترده‌ای که بر روی کیفیت سیمن مردان ضایعه نخاعی صورت گرفته است، همگی در تأیید نتایج حاصل از این تحقیق، نشان دهنده کاهش تعداد اسپرم، کاهش تحرک و افزایش تعداد اسپرم با مورفولوژی ناهنجار می‌باشند (3-1).

در بخش دوم این مطالعه ضمن آزمایشات ارزیابی کیفیت کروماتین هسته اسپرم، تفاوت معنی‌داری در دو تست AB و CMA3 بین گروه SCI و دو گروه دیگر مشاهده نگردید. از آنجائیکه تست AB نشان دهنده وجود هیستون اضافی و تست CMA3 نشان دهنده وجود نقصان پروتامین طی جایگزینی هیستون- پروتامین در فاز بیضه‌ای ایجاد تراکم کروماتین اسپرم می‌باشند، می‌توان اظهار نمود که این مرحله از اسپرماتوژنز توسط ضایعه نخاعی تحت تأثیر قرار نمی‌گیرد. Hou در سال 1995 با بررسی سیمن بیماران SCI و رنگ‌آمیزی اسپرم آنها توسط Acidic Aniline Blue بیان کرد که ضایعه نخاعی تأثیری بر فاز اسپرمیوژنز فرآیند ایجاد تراکم کروماتین ندارد (31).

CMA3 یک تست بسیار اختصاصی و حساس جهت نشان دادن تراکم کروماتین طی اسپرمیوژنز می‌باشد. در یک مطالعة حیوانی، که بلوغ هسته و میزان پروتامینه شدن کروماتین اسپرم موش توسط CMA3 مورد بررسی قرار گرفته بود. در وضعیت طبیعی اسپرم‌های موش ضمن گذرانیدن فرآیند بلوغ هسته در بیضه، بتدریج پروتامینه شده و از تعداد اسپرم‌های +CMA3 بتدریج کاسته ‌شد. این میزان در اسپرم‌های اپیدیدیمی حدود صفر درصد گزارش گردیده است (32).

در مطالعه حاضر نیز وضعیتی مشابه با بررسی فوق دیده شد. به‌عبارتی می‌توان اظهار کرد که فرآیند پروتامینه شدن کروماتین اسپرم در رت توسط ضایعه نخاعی متأثر نشده و روند طبیعی خود را سپری نموده است.

در تست SDS ورنگ‌آمیزی T‌B، تفاوت معنی‌داری بین گروه SCI و دو گروه شم و کنترل مشاهده گردید. این بدان معناست که در گروه ضایعه نخاعی درصد اسپرم‌های با تورم سر و رنگ متاکروماتیک افزایش یافته است. هنگام استفاده از محلول یک درصد SDS، باندهای دی‌سولفیدی بیشتری در اسپرم‌های با کروماتین ناپایدار شکسته شده و این امر باعث می‌گردد که مولکول DNA پوشش نوکلئوپروتئینی خود را ازدست داده و گروه‌های فسفات بیشتری در دسترس رنگ TB قرار بگیرند.

بدیهی است که هرچه میزان پایداری کروماتین کمتر باشد، میزان تورم هسته و رنگ‌پذیری DNA افزایش خواهد یافت (28و24). از آنجائیکه تشکیل باندهای دی‌سولفیدی و ایجاد پایداری در کروماتین اسپرم طی فاز اپیدیدیمی ایجاد تراکم کروماتین صورت می‌پذیرد، می‌توان اظهار نمود که ضایعه نخاعی بر این مرحله تأثیر نامطلوب گذاشته و سبب افزایش درصد اسپرم‌هایی با کروماتین ناپایدار می‌گردد.

با توجه به نتایج مطالعه فعلی ضمن بکارگیری تست AO در گروه SCI میانگین اسپرم‌هایی با DNA غیـرطبیعـی و دناتـوره، افـزایش معنی‌داری را نسبت به به گروه‌های دیگر نشان داد.

بطورکلی میزان پایداری کروماتین و ساختار DNA اسپرم در وضعیت ضایعه نخاعی کمتر مورد توجه قرار گرفته است و اطلاعات موجود ناقص و گاه در تناقص می‌باشند. Engh در سال 1993 ضمن بررسی سیمن مردان SCI توسط تکنیک فلوسایتومتری با مشاهده افزایش تعداد اسپرم‌هایی با شکست DNA بیان کرد که در این بیماران ناهنجاری‌هایی در فرآیند تراکم کروماتین و ساختار DNA اسپرم بوجود می‌آید (33). نتایج حاصل از مطالعة حاضر نیز مؤید نتایج Engh می‌باشند.

Kempinas در سال 1998 ضمن انجام سمپاتکتومی در رت و بررسی اسپرم‌های اپیدیدیمی حیوان با روش فلوسایتومتری و رنگ‌آمیزی AO، بیان داشت که هیچ شواهدی مبنی بر ایجاد ضایعه در DNA اسپرم بدنبال قطع عصب‌دهی اتونوم بیضه وجود ندارد (19). حال آنکه Hirsch در سال 1999 با ایجاد ضایعه نخاعی در سطح T10 رت و بررسی کوتاه مدت و دراز مدت اسپرم‌های اپیدیدیمی حیوان، با روشی مشابه با مطالعه Kempinas، تفاوت معنی‌داری را در ساختار DNA اسپرم، بین گروه SCI و گروه شم مشاهده نمود (7). دلیل احتمالی تفاوت در نتایج حاصل از مطالعات فوق می‌تواند مربوط به تفاوت در روش قطع عصب‌دهی و در نتیجه وسعت منطقه متأثره باشد. بطوریکه Kempinas با برداشتن گانگلیون مزانتریک تحتانی عمل سمپاتکتومی را انجام داد؛ حال آنکه Hirsch با انجام ضایعه نخاعی توسط وزنه وضعیت اختلال در عصب‌دهی را بوجود آورده است. روشی که در مطالعه حاضر بکار گرفته شد، همانند روش Hirsch بود و نتایج حاصل نیز در هر دو مطابقت نشان می‌دهند.

در طی عبور اسپرم از اپیدیدیم ضمن ایجاد باندهای دی‌سولفیدی، میزان رنگ‌پذیری DNA کاهش می‌یابد، فاکتورهایی که سبب اکسیداسیون ناقص گروه‌های تیول و بروز ناپایداری در کروماتین اسپرم می‌شوند، قادرند در افزایش حساسیت DNA نسبت به عوامل دناتوره‌کننده (همانند اسید، حرارت) شرکت داشته باشند. به عبارتی کاهش پایداری کروماتین سبب افزایش ضایعات DNA اسپرم می‌گردد؛ چرا که با کاهش پایداری کروماتین و در دسترس قرار گرفتن DNA، میزان حساسیت این مولکول به اسید یا حرارت افزایش یافته و توسط رنگ AO قرمز می‌شود (36-34). در مطالعه فعلی نیز ضمن به کارگیری تست‌های SDS و AO تفاوت معنی‌داری در بین گروه‌ها SCI و گروه‌های دیگر مشاهده شد.

از بین عواملی که سبب کاهش کیفیت اسپرم در وضعیت SCI می‌شوند، دو عامل افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن ROS و قطع عصب‌دهی می‌توانند در بروز اختلالات کروماتینی اسپرم بیشترین سهم را داشته باشند. نقش کیفیت پایین پلاسمای سیمن مردان ضایعه نخاعی در کاهش کیفیت اسپرم به اثبات رسیده است (39-37،29، 18،10، 7).

مطالعة نشان می‌دهد که میزان ROS سیمن بیماران SCI نه تنها از افراد بارور بلکه از افراد نابارور با دلایل غیر از ضایعه نخاعی نیز بیشتر می‌باشد (18). ROS توسط اسپرمها (خصوصاً اسپرم‌های غیرطبیعی) و گلبول‌های سفید به داخل مایع سیمن ترشح می‌شود.

ازآنجائیکه ضایعه نخاعی سبب ایجاد لکوسایتوسپرمی (40) و تتراتوسپرمی (41) می‌شود، کاهش کیفیت اسپرم وابسته به ROS در بیماران SCI و حیواناتی که به صورت تجربی دچار ضایعات نخاعی شده‌اند، دور از انتظار نمی‌باشد. گونه‌های فعال اکسیژن با کاهش ATP داخلی سلول، تأثیر بر غشاء سیتوپلاسمی و ساختار DNA اسپرم می‌توانند سبب کاهش تحرک، کاهش قابلیت حیات، افزایش ناهنجاری‌های مورفولوژیکی و بروز ضایعات در کروماتین و DNA اسپرم گردند (40،41). در مطالعه حاضر نیز اگرچه میزان ROS اندازه‌گیری نشده است؛ ولی با توجه به نتایج دیگر محققان، کاهش کیفیت اسپرم و ایجاد اختلال در تراکم کروماتین و ساختار DNA اسپرم رت‌های SCI را می‌توان به افزایش ROS نسبت داد. از طرف دیگر مطالعات نشان دهنده وجود ارتباط مستقیم بین اختلال در ساختار کروماتین و کاهش کیفیت اسپرم می‌باشند (16،17،42). بنابراین می‌توان اظهار نمود که بدنبال ضایعه نخاعی، گونه‌های فعال اکسیژن، اولاً سبب ایجاد اختلال در ماده ژنتیکی اسپرم گردیده و ثانیاًَ بر مورفولوژی و تحرک اسپرم نیز تأثیر نامطلوب خود را بجای می‌گذارند. علاوه بر این کاهش کیفیت اسپرم نیز می‌تواند نتیجه اختلالات کروماتینی محسوب ‌گردد.

قطع عصب‌دهی بیضه به دنبال ضایعه نخاعی می‌تواند بر فرآیند اسپرماتوژنز تأثیر نامطلوب گذاشته و علاوه بر کاهش کیفیت اسپرم، می‌توانند سبب بروز ضایعاتی در ساختار DNA آن شود (7،30). از طرفی به دنبال قطع عصب‌دهی بیضه، درجه حرارت این ارگان بالا رفته و این امر می‌تواند علاوه بر ایجاد اختلال در اسپرماتوژنز سبب تغییر در ساختار طبیعی کروماتین گردد و حساسیت DNA را نسبت به عوامل دناتوره‌کننده افزایش دهد (10،34). در مطالعه حاضر نیز بدنبال ایجاد ضایعه نخاعی درصد اسپرم‌های دارای DNA ناهنجار، افزایش معنی‌داری را نسبت به گروه‌های دیگر نشان داد.

اپیدیدیم مجرایی است که اسپرم نابالغ ضمن عبور، فرآیند بلوغ را کامل نموده و در نهایت به اسپرمی متحرک و بالغ می‌گردد. مطالعة Golan و همکاران نشان می‌دهد که واکنش‌های پیچیده‌ای بین اسپرم‌های عبوری از یک طرف و مایع اپیدیدیمی، ریزمحیطها، ایی‌تلیوم اپیدیدیم و بافت بینابینی آن از طرف دیگر جهت انجام فعالیت‌های طبیعی این عضو صورت می‌پذیرد (36).

اپیدیدیم، خصوصاً ناحیه دم آن، اعصاب کلی نرژیک، آدرنژریک و غیرآدرنرژیک- غیرکولینرژیک فراوانی را از عقده‌ها و شبکه‌های عصبی متعدد دریافت می‌کند (43). بنابراین این سئوال مطرح است که آیا در ضمن ضایعه نخاعی و قطع عصب‌دهی اتونوم اپیدیدیم، فرآیند بلوغ اسپرم متأثر می‌شود؟ بررسی‌های انجام شده در حیوان آزمایشگاهی رت نشان می‌دهد که ضمن قطع عصب‌دهی اپیدیدیم توسط عوامل شیمیایی و یا عمل جراحی، فونکسیون طبیعی این عضو دچار اختلال می‌گردد (19). تشکیل باندهای دی‌سولفیدی جهت پایداری کروماتین و ایجاد تحرک در اسپرم دو وظیفه اصلی اپیدیدیم محسوب می‌شوند. بنابراین وجود باندهای (S-S) به اندازه کافی و مشاهده وضع طبیعی تحرک اسپرمها می‌توانند نشان دهنده فعالیت طبیعی این عضو باشند. در صورت اختلال در عصب‌دهی اپیدیدیم در وضعیت SCI و مختل شدن عملکرد طبیعی آن، فاز دوم تراکم کروماتین و میزان تحرک اسپرمها دچار اختلال گشته و این امر می‌تواند بر پتانسیل باروری اسپرم تأثیر نامطلوب بگذارد. در مطالعه حاضر نیز هر دو مارکر تراکم کروماتین هسته و میزان تحرک اسپرم توسط ضایعه نخاعی متأثر شده‌اند. لازم به ذکر است که به دلیل اعتبار تست SCSA در رت و همچنین پایداری بیشتر کروماتین اسپرم رت نسبت به انسان (44) می‌توان اظهار نمود که اولاً مدل حیوانی رت جهت ارزیابی کروماتین اسپرم بدنبال ضایعه نخاعی مدل مناسبی است و ثانیاً در صورت مشاهده تغییرات معنـی‌دار، مـی‌تـوان به طـور قطـع ایـن مـوضـوع را بـه نمونه‌های انسانی تعمیم داد.

نتیجه‌گیری

نتیجه کلی حاصل از مطالعه حاضر این است که ضایعه نخاعی مزمن سبب کاهش کیفیت پارامترهای اسپرم کاهش میزان تراکم کروماتین و افزایش میزان اسپرم‌های با DNA غیرطبیعی می‌گردد. در بیان علل این وضعیت می‌توان به قطع عصب‌دهی اتونوم، تاخیر در انتقال اپیدیدمی اسپرم و همچنین تاثیر نامطلوب عوامل اکسید کننده اشاره نمود. در نهایت پیشنهاد می‌گردد که در برنامه‌های کمکی تولید مثل بیماران ضایعه نخاعی تست‌های بررسی کروماتین اسپرم به عنوان تست‌های پیشگویی کننده میزان ناباروری بکار گرفته شوند.

تشکر و قدردانی

بـا تشکـر از ریـاست محتـرم مـرکـز تحقیقاتی- درمانی ناباروری شهید صدوقی یزد، جناب آقای دکتر افلاطونیان و با تشکر از جناب آقای مهرداد سلیمانی کارشناس محترم آزمایشگاه جنین‌شناسی که ما را در به ثمر رسانیدن این طرح صمیمانه یاری نمودند.