انجماد شاخه‌ای از علم کرایوبیولوژی است که به حفظ و نگهداری طولانی مدت سلول در دمای بسیار پایین می‌پردازد (1). مکانیسم انجماد بر این پایه استوار است که هرگاه آب موجود در سلول در اثر کاهش مناسب حرارت به یخ تبدیل گردد، به گونه‌ای که بدون آسیب به سلول، به طور مؤثر حرکات مولکولی را متوقف کند، فرآیندهای بیوشیمیایی سلول به تعویق افتاده و یا متوقف می‌شود و در نتیجه بقا سلول افزایش می‌یابد (1). مهمترین اصل در فرآیند انجماد، کاهش آسیب در اثر تشکیل بلورهای یخ داخل سلولی و نمک‌های سمی موجود در سلول است که با سرد کردن آهسته و خروج آب داخل سلولی تا حد مناسب ، قبل از سردکردن یا طی آن، به همراه یک جایگزین مناسب انجام می‌شود (2). تاریخچه انجماد اسپرم به حدود 200 سال قبل برمی‌گردد. در سال 1776، Spellazani گزارش کرد که مایع سمینال یخ‌زده حیوان در برف، پس از دوباره رساندن به حرارت محیط (ذوب) تحرک اسپرم خود را بدست آورده است. در سال 1866، Metegazza متوجه شد که تعداد کمی از اسپرم‌های مایع منی که به مدت طولانی در حرارت C15- ذخیره شده بود پس از ذوب دوباره تحرک خود را بدست آورده‌اند (5-3). بعدها بانک اسپرم برای نگهداری اسپرم‌های حیوانات انسان پیشنهاد گردید (3). درسال 1937، Jahnel به طور اتفاقی مشاهده کرد که بخشی از اسپرماتوزوئیدهای انسان با ذخیره‌سازی در حرارت‌های C79-، C196- و C269- زنده می‌مانند (6). آزمایشات اولیه با مایع سیمن یخ زده انسان، بازده تحرک پس از ذوب را در حدود10% گزارش نمودند (3). به هرحال بازده تحرک و بقا اسپرمها در غیاب محیطهای نگهدارنده بسیار محدود است (5) و پیشرفت روند انجماد با کشف اتفاقی گلیسرول به عنوان نگهدارنده مناسب برای اسپرم‌های گاو توسط Polge و همکاران در سال 1949 آغاز گردید (7). اولین نوزاد حاصل از اسپرم منجمد شده انسان در سال 1953 متولد شد (8). محیط GEYC که امروزه جهت انجماد اسپرم انسان استفاده می‌شود؛ در ابتدا توسط Ackerman در اواخر دهه 1960 معرفی گردید (1). طی30 سال گذشته پیشرفت‌های چشمگیری در زمینه تشکیل بانک اسپرم، استفاده از روش‌های مختلف انجماد و محیطهای مختلف رخ‌داده است. انجماد اسپرم برنامه‌ای روتین جهت سهولت دسترسی به مایع سمینال اهداءکنندگان، جهت تلقیح در موارد وازکتومی یا شیمی درمانی و نیز در سال‌های اخیر در بیماری ایدز، می‌باشد. از این رو بهینه نمودن میزان بقاء اسپرم در برنامه‌های انجماد بسیار ضروری به نظر می‌رسد. یکی از عوامل اساسی مؤثر در میزان بقاء اسپرم طی انجماد، محیط و روش مورد استفاده جهت حفظ و نگهداری اسپرم می‌باشد (9). امروزه استفاده از اسپرم اهداء کننده (AID) جهت تلقیح مصنوعی و تلقیح توسط اسپرم شوهر (AIH) به طور روتین انجام می‌گردد (10) و انجماد اسپرم- تخمک و جنین انسان طی مراحل مختلف اولیه تا بلاستوسیست یکی از اهداف اصلی برنامه IVF می‌باشد. سه محیط متداول که بیشتر در انجماد اسپرم مورد استفاده قرار می‌گیرند، شامل محیط HSPM ، GEYC و محیط TYBG می‌باشند (11، 3). با توجه به اینکه روند انجماد، سبب کاهش ظرفیت باروری اسپرمها از طریق آسیب به غشاء سلولی و نیز آسیب به تحرک اسپرمها و تغییر در مورفولوژی و آسیب آکروزومی، آسیب به DNA و درستی ساختمان و عملکرد اسپرم می‌گردد؛ چند سالی است که ارزیابی روش‌های مختلف انجماد جهت بررسی تأثیر آنها در تحرک اسپرم انجام گرفته است. از طرف دیگر، محیطهای نگهدارنده مختلف اسپرمها را از اثرات منفی در روند انجماد حفاظت می‌کنند. بسیاری از مراکز از بافرهای TES-Tris حاوی زرده تخم‌مرغ (محیط TYBG) و HSPM و نیز برخی از مراکز از محیطهای دیگری همچون GEYC استفاده می‌کنند. اگرچه تمامی محیطهای نگهدارنده، اسپرم را از نظر کیفیت تاحدودی حفظ می‌کنند؛ ولی هرگز بهترین محیط جهت انجماد اسپرم شناخته نشده و هیچ روش استاندارد انجماد اسپرم معرفی نشده است (12، 9) و لذا ارائه روش مناسب انجماد و نیز استفاده از محیط مناسب بر اساس یافته‌های تجربی ضروری به نظر می‌رسد. بنابراین هدف اصلی این مطالعه بررسی میزان بقا و تحرک اسپرم در سه محیط مختلف شامل HSPM، TYBG و GEYC با دو روش مختلف انجماد شامل روش انجماد آهسته با دستگاه (روش دستگاهی) و روش انجماد در فاز بخار ازت مایع (روش غیردستگاهی) می‌باشد که هر دو جزء فرآیند انجماد به روش سرد کردن آهسته است. این مطالعه اثرات محیطهای فوق و روش انجماد روی تحرک اسپرم و بقاء اسپرم را مورد ارزیابی قرار می‌دهد.
مواد و وسایل مورد نیاز شامل نی ، ضامن ، ویزوتیوب ، گابلت ، کین و کین‌استر (CryoBio System, France)، تانک نگهداری و دستگاه فریز (Cryo440-1.7, Mode Kryo 10) هر دو ساخت شرکت Planer انگلستان، بافر TES (T-1030)، دکستروز (D-9434)، پنی‌سیلین- G، استرپتومایسین (S-0890)، سیترات سدیم (S-4641)، گلوکز (G-6152)، گلایسین (G-8898) تهیه شده از شرکت Sigma (USA)، بافر Tris (108382)، فروکتوز (105323)، گلیسرول 104093)، تهیه شده از شرکت Merck (Germany)، محیط آماده HSPM (Fertipro Sperm FreezeTM, France) تهیه‌گردید.
1- تهیه نمونه‌های مایع سمینال: تعداد 22 نمونه مایع سمینال از افراد طبیعی بعد از 5-2 روز خودداری از نزدیکی، در ظروف یکبار مصرف استریل جمع‌آوری‌گردید. نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در دمای C37 قرار داده شدند تا از حالت لخته خارج شوند. آنالیز مایع سمینال مطابق استاندارد WHO انجام گرفت (13). غلظت اسپرم (تعداد اسپرم در هر میلی‌لیتر) قبل از انجماد و میزان تحرک (درصد اسپرم‌های متحرک به کل اسپرمها) بر روی نمونه‌های تازه و نیز بعد از ذوب ارزیابی گردید. میزان بازیافت اسپرم متحرک تحت عنوان فاکتور بقاء (CSF) به صورت زیر تعریف شد:
هر نمونه سیمن به 3 قسمت تقسیم گردید و هر قسمت با یک محیط تهیه شده به روش زیر، مخلوط گردید. مخلوط نمونه با هر یک از محیطها به دو بخش تقسیم گردیدند. بخشی از نمونه با هر یک از سه محیط مختلف به روش انجماد در فاز بخار ازت مایع و بخش دیگر به روش انجماد آهسته توسط دستگاه منجمد گردید.
2- طرز تهیه محیطها:
- محیط :HSPMاین محیط که حاوی آلبومین سرم انسانی به غلظت g/l 9/4 و گلیسرول20% (v/v) می‌باشد به صورت تجاری وآماده مصرف، استفاده گردید که به صورت 7/0: 1 (ml7/0 محیط نگهدارنده +ml1 مایع سمینال) با نمونه سیمن مخلوط گردید (14، 11-9،1).
- محیط TYBG : این محیط که حاوی زرده تخم مرغ و گلیسرول می‌باشد، برای حجم ml100 به صورت زیر تهیه می‌شود: بافر TES با غلظت mM 176، بافر Tris با غلظت mM 80 و دکستروز با غلظت mM 9 . مقدار احتساب شده برای ml100 از مواد فوق در حدود ml50 آب مقطر حل شد و سپس به غلظت 8% (v/v) گلیسرول، U/ml1000 پنی‌سیلین G و µg/ml 1000 استرپتومایسین سولفات اضافه گردید. پس از تنظیم4/7=pH به حجم ml100 رسانده شد. محلول نهایی با استفاده از فیلتر µm22/0 صاف و به حجم‌های کوچک ml8 منجمد گردید. موقع استفاده به غلظت 20% (v/v) زرده تخم‌مرغ تازه اضافه شد (به ml8 از محیط ml2 زرده تخم مرغ) و نمونه‌های سیمن به صورت 1:1 با این محیط مخلوط گردید (14،11،9،1).
- محیط GEYC : این محیط نیز که حاوی زرده تخم‌مرغ و گلیسرول می‌باشد، برای حجم کلی ml100 به صورت زیر تهیه شد: g2 سدیم تری‌سیترات، gr 8/0 گلوکز، gr8/0 فروکتوز و gr2/0 گلایسین در حدود ml50 آب مقطر حل گردید و ml3/21 گلیسرول به آن اضافه و پس از تنظیم 4/7pH= با آب مقطر به حجم نهایی ml100 رسانده شد. این محیط پس از تقسیم به حجم‌های کوچک ml9 در C70- تا یک سال پایدار می‌باشد. موقع استفاده به غلظت 25% (v/v) زرده تخم‌مرغ (به ml 9 از این بافر ml 3 زرده تخم‌مرغ تازه) اضافه گردید با این محیط نیز نمونه‌های سیمن به صورت 1:1 مخلوط شدند (10-9، 3، 1).
3- روش انجماد: روش کلی کار با هر یک از سه محیط بدین ترتیب بود که پس از رساندن محیطها به دمای آزمایشگاه، بر روی یک حجم از مایع سیمنال، حجم مورد نیاز از محیط نگهدارنده، قطره قطره و به آرامی (با سرعت حدود ml/min 8/0) به نمونه مایع سمینال اضافه و خوب مخلوط گردید. نمونه به مدت 10 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد؛ سپس مخلوط محیط و نمونه را به داخل نی‌های 25/0 میلی‌لیتری کشیده شد، با باقی گذاشتن حدود cm1 هوا در دو طرف نی‌ها، دهانة نی توسط ضامن بسته شد. کار به صورت دوتایی انجام گردید یعنی برای هر نمونه با هر یک از سه محیط نگهدارنده مختلف و هر یک از روش‌های غیردستگاهی یا دستگاهی، دو عدد نی منجمد گردید. در روش انجماد در فاز بخار از یک فلاسک دو جداره جهت فریز کردن استفاده شد و جهت نگهداری نی‌ها بر روی بخار نیز از سینی شبکه‌ای مکعب مستطیل در ابعاد مناسب استفاده گردید. دو عدد نی از هر نمونه و از هریک از سه محیط مختلف به مدت 30 دقیقه روی بخار ازت مایع به فاصله حدود cm 25 از مایع ازت به حالت افقی قرار داده شدند (کاهش حرارت از حرارت اتاق به حرارت C80- و با سرعت انجماد /min C10-)، سپس کل نی‌ها در داخل ازت مایع فرو برده شد و در تانک ازت مناسب ذخیره گردید ( C196-). دو عدد نی دیگر از هر نمونه و با هر یک از سه محیط مختلف توسط دستگاه انجماد به صورت زیر منجمد گردید:
1) کاهش درجه حرارت از C25+ تا C6- با سرعت سردکردن /min C2
2) نگه‌داشتن در درجه حرارت C6- برای مدت 10 دقیقه
3) کاهش حرارت از C6- تا حرارت C30- با سرعت انجماد C/min3/0
4) کاهش حرارت از C30- تا حرارت C196- با سرعت انجماد /min C40-
5) قرار دادن نی‌ها در نیتروژن مایع.
4- ذوب مجدد اسپرم: نمونه‌ها پس از یک هفته بعد از مرحله انجماد، ذوب گردید. جهت ذوب، نی‌های مورد نیاز از نیتروژن مایع خارج و پس از تاخیر 10 ثانیه‌ای در محیط آزمایشگاه، برای مدت 5 دقیقه در بن ماری C37 قرار داده شدند. سپس ضامن نی‌ها برداشته شد و با بریدن انتهای دیگر نی نمونه سیمن خارج و مورد ارزیابی و آنالیز قرار گرفت.
5- آنالیز آماری: آنالیز آماری با استفاده از برنامه SPSS ویرایش 11، آزمون t-test جهت مقایسه تحرک اسپرمها قبل از انجماد و بعد از ذوب با دو روش مختلف انجماد و آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی LSD جهت مقایسه تحرک اسپرمها قبل از انجماد و بعد از ذوب با سه محیط مختلف انجام گرفت. سطح معنیداری 05/0 در نظر گرفته شد و میزان CSF نمونه‌ها قبل از انجماد و بعد از ذوب طی دو روش مختلف و با سه محیط مقایسه گردید.
در این مطالعه سه محیط HSPM،TYBG ، GEYC، طی دو روش مختلف انجماد مورد ارزیابی قرار گرفتند. تحرک اولیه در 22 نمونه مایع سمینال قبل از انجماد و بعد از ذوب در جدول و نمودار شمارة 1 آورده شده است.
براساس این نتایج میانگین درصد تحرک اسپرم قبل از فریز کردن 29/813/46% بود؛ اما این میانگین پس از ذوب طی روش انجماد آهسته با دستگاه با محیطهای HSPM (59/16%)، محیط GEYC (57/431/16%) و محیط TYBG (75/404/16%) و نیز طی روش انجماد در فاز بخار ازت با محیطهای HSPM (55/495/16%)، محیط GEYC (14/513/14%) و محیط TYBG (47/418/14%) کاهش چشمگیری نشان می‌دهد.
بهترین تحرک اسپرم پس از ذوب در روش انجماد آهسته با دستگاه (روش برنامه‌ریزی شده) حاصل شد. همانطوریکه جدول شمارة 1 نشان می‌دهد؛ اگرچه تفاوت قابل ملاحظه‌ای در میانگین درصد تحرک اسپرم در محیط HSPM بین دو روش دستگاهی (59/16%) و فاز بخار ازت (55/495/16%)؛ وجود ندارد؛ اما میانگین درصد تحرک اسپرم پس از ذوب با دو محیط GEYC و TYBG طی روش انجماد در فاز بخار ازت نسبت به روش دستگاهی کاهش داشت (به ترتیب 14/513/14% با محیط GEYC در روش فاز بخار ازت در مقابل 57/431/16% با همین محیط در روش دستگاهی و نیز 47/4 18/14% با محیط TYBG در روش فاز بخار ازت در مقابل 75/4 04/16% با همین محیط در روش دستگاهی) و تفاوت معنیداری بین روش دستگاهی و فاز بخار ازت با هر یک از دو محیط GEYC (001/0=P) و TYBG (007/0=P) وجود دارد. بنابراین روش دستگاهی به عنوان انتخاب اول جهت انجماد، پیشنهاد می‌شود.
مطالعه حاضر نشان می‌دهد که اگرچه تفاوت قابل ملاحظه‌ای بین میانگین درصد تحرک اسپرم پس از ذوب و مقایسه دو به دوی محیطها طی روش دستگاهی وجود ندارد (به ترتیب 59/16%=HSPM، 57/431/16%=GEYC و 75/404/16%=TYBG)؛ اما در روش فاز بخار ازت میانگین درصد تحرک پس از تاوینگ در محیط HSPM (55/495/16%) به عنوان یک محیط نگهدارنده بیشتر از دو محیط GEYC 14/513/14%) و TYBG (47/418/14%) بوده و تفاوت معنیداری (آنالیز واریانس یکطرفه) بین محیط HSPM و دو محیط GEYC (05/0=P) و محیط TYBG (05/0=P) وجود دارد.
مقایسه میانگین درصد تحرک پس از ذوب اسپرم‌های منجمد شده در محیط GEYC و TYBG به عنوان محیطهای نگهدارنده، طی روش فاز بخار ازت نشان می‌دهد که تفاوت معنیداری بین میانگین‌های درصد تحرک دردو محیط GEYC (14/513/14%) و محیط TYBG (47/418/14%) در روش فاز بخار ازت وجود ندارد. بهرحال میانگین درصد تحرک اسپرم‌های منجمد شده در محیط HSPM به عنوان یک محیط نگهدارنده، اختلاف معنیداری را در مقایسه با میانگین درصد تحرک اسپرم پس از ذوب در دو محیط دیگر نشان می‌دهد، بنابراین محیط HSPM، محیط مناسبتری جهـت انجماد اسپـرم نسبـت به دو محیط GEYC و TYBG می‌باشد.
همچنین زمانیکه تعداد نمونه‌های مایع سمینال به دو گروه با درصد تحرک بالای 50% و زیر 50% تقسیم گردید. میانگین درصد تحرک اسپرمها برای 5 نمونه با تحرک بالای 50% قبل از انجماد 56% بود؛ ولی میانگین درصد تحرک و میانگین بازده تحرک ( یا میزان بقا) پس از ذوب طی روش دستگاهی با محیطهای HSPM، GEYC و TYBG ( به ترتیب برابربا 2/24% با میانگین بازده تحرک 99/122/43 در محیط HSPM، 2/20% با میانگین بازده تحرک 18/6 98/35 در محیط GEYC و 8/21% با میانگین بازده تحرک 89/492/38 در محیط TYBG) و نیز طی روش فاز بخار ازت با محیطهای HSPM ، GEYC و TYBG (به ترتیب برابر با 8/22% با میانگین بازده تحرک49/374/40 در محیط HSPM، 6/20% با میانگین بازده تحرک 9/572/36 در محیط GEYC و2/19% با میانگین بازده تحرک 32/53/34 در محیط TYBG) افزایش چشمگیری نسبت به 17 نمونه با میانگین درصد تحرک زیر 50% نشان می‌دهد؛ بطوریکه در 17 نمونه با میانگین درصد تحرک زیر 50%، میانگین درصد تحرک قبل از انجماد 24/43% (03/0P=) بود و نیز میانگین درصد تحرک و میانگین بازده تحرک پس از ذوب طی روش دستگاهی با محیطهای HSPM (76/14% با میانگین بازده تحرک 49/473/33، 01/0P=)، محیط GEYC (18/15 با میانگین بازده تحرک 59/668/33، 05/0P =) و محیط TYBG (35/14% با میانگین بازده تحرک 83/579/32، 01/0P =) و نیز طی روش غیردستگاهی با محیطهای مذکور به ترتیب HSPM (24/15% با میانگین بازده تحرک 34/595/34، 01/0P=)، محیط GEYC (24/12% با میانگین بازده تحرک 13/591/26، 004/0P=) و محیط TYBG (7/12% با میانگین بازده تحرک 11/688/28، 02/0P=) می‌باشد.
مطالعات زیادی نشان داده‌اند که روند انجماد و ذوب مجدد نمونه مایع سمینال سبب کاهش فعالیت متابولیک اسپرمها و آسیب به غشای پلاسمایی آنها و در نتیجه کاهش اسپرم‌های دارای عملکرد طبیعی جهت استفاده در روش‌های لقاح خارج رحمی می‌گردد (15، 14). بنابراین، استفاده از نگهدارنده‌های مناسب و روش صحیح انجماد در حفظ و سلامت اسپرم بسیار مهم تلقی می‌گردد (14).
برخی محققین نشان داده‌اند که روش‌های انجماد دستگاهی، کیفیت اسپرم را بهتر از انجماد با استفاده از فاز بخار حفظ می‌کند (17، 16). اما برخی دیگر هیچ اثر مثبتی، حداقل برای اسپرم‌های انسان یافت نکرده‌اند (18). در مطالعه حاضر نشان داده شد که انجماد به روش برنامه‌ریزی شده آهسته (دستگاهی)، بهتر از انجماد در فاز بخار ازت مایع (غیردستگاهی) می‌تواند به عنوان روشی جهت انجماد اسپرم به کار رود. همانطوریکه داده‌ها نشان می‌دهند بهترین تحرک اسپرم پس از ذوب در روش انجماد دستگاهی و برنامه‌ریزی شده بدست می‌آید؛ بنابراین روش دستگاهی به عنوان انتخاب بهتر جهت انجماد اسپرم انسان پیشنهاد می‌گردد.
مشـکل دیگـر در رونـد انجماد مایـع سمینال این است که هنوز محیطی که از آسیب اسپرمها طی روند انجماد جلوگیری کند، وجود ندارد. آسیب به اسپرم‌های انسان را می‌توان بلافاصله با کاهش تحرک پس از ذوب تشخیص داد. افزودن ترکیبات نگهدارنده قبل از انجماد جهت بقا بهتر اسپرمها ضروری است. بیشتر کاهش تحرک اسپرم طی انجماد و ذوب مجدد به خاطر تماس اسپرم با نگهدارنده‌های محیط می‌باشد (19).
گلیسرول اولین و شایع‌ترین ترکیبی است که به عنوان نگهدارنده محیط انجماد با کسب نتایج مختلف برای انجماد مایع سمینال استفاده می‌شود. گزارشات ابتدایی ثابت کرده‌اند که بدون گلیسرول بقا اسپرمها پس از انجماد کاهش می‌یابد یا به صفر می‌رسد و مطالعات مختلف ضرورت و کارآیی آن را در فرآیند انجماد آشکار کرده‌اند (21-19،9،3). عموماً دامنه غلظت 5% تا 10% گلیسرول استفاده می‌گردد و غلظت نهایی حدود 5/7% (v/v) مطلوب به نظر می‌رسد (1). غلظت نهایی گلیسرول ممکن است در میزان بقا سلول‌های منجمد تأثیر بگذارد و اثرات سمی گلیسرول حتی در غلظت کمتر از 2% نیز گزارش گردیده است (22). همچنانکه غلظت گلیسرول افزایش می‌یابد، تحرک اسپرم کاهش می‌یابد. به هرحال اثرات سمی محدود گلیسرول روی اسپرمها به صورت آسیب‌های هایپراسموتیک در روند انجماد مشخص شده است (25-23، 19، 11). در این مطالعه نیز از گلیسرول در هر سه محیط HSPM، GEYC و TYBG استفاده شده است. همانطوریکه میانگین درصد تحرک نشان می‌دهند، این میزان در هر سه محیط نسبت به قبل از انجماد کاهش معنیداری دارد (تا حدود 30%). غلظت گلیسرول مورد استفاده تأثیر مستقیمی در میزان سمیت گلیسرول دارد (26). اکثر محققین غلظت اپتی مم گلیسرول را جهت کسب نتایج بهتر بقاء اسپرم‌های انسان 10-5% پیشنهاد کرده‌اند (31-27، 10، 3). غلظت نهایی گلیسرول در محیط GEYC به میزان 6/10% و در محیط TYBG به میزان 4% بود ولی در محیط HSPM به میزان 5/7% می‌باشد؛ لذا احتمالاً یکی از دلایل بهتر بودن محیط HSPM نسبت به دو محیط دیگر در این مطالعه، میزان غلظت کمتر گلیسرول مورد استفاده باشد. بنابراین پیشنهاد می‌گردد که حداکثر تا میزان 10% غلظت گلیسرول در تهیه محیط انجماد استفاده گردد.
مطالعات فراوانی انجام گرفته است تا تأثیر نگهدارنده‌های مختلف محیطهای انجماد نظیر زرده تخم‌مرغ، شیر، بافرهای دویونی (دارای یون‌های مثبت و منفی) ، سیترات، فروکتوز، بافر تریس، گلوکز، دکستروز، گلایسین را روی اسپرم مورد ارزیابی قرار دهند (26). قندها، عمومی‌ترین ترکیبات مورد استفاده در محیطهای انجماد سیمن جهت روند انجماد هستند (32، 24). اثرات مفید قندها احتمالاً بخاطر حفظ فشار اسمزی مایع خارج سلولی در حرارت مختلف طی انجماد و یا به عنوان منبع انرژی جهت متابولیسم اسپرمها می‌باشد. به هرحال به دلیل اینکه مایع سمینال انسان بلافاصله پس از جمع‌آوری رقیق و منجمد شده و پس از ذوب سریعاً مواد نگهدارندة آن شستشو می‌گردد، احتمال نقش قندها به عنوان منبع انرژی برای متابولیسم اسپرمها بسیار ضعیف می‌باشد. احتمالاً حفظ فشار اسمزی خارج سلولی توضیحی جهت توانایی رافینوز، گلوکز و سوکروز به عنوان مکمل‌های محیط برای اسپرم‌های انسان باشد (10). از ترکیبات حفظ‌کننده فشار اسمزی خارج سلولی در محیط TYBG تنها از دکستروز استفاده شده است؛ ولی در محیط GEYC از گلوکز، فروکتوز وگلایسین و در محیط HSPM نیز از گلوکز، سوکروز و گلایسین استفاده گردیده است. بنابراین بنظر می‌رسد که محیط GEYC و HSPM نسبت به محیط TYBG از نظر حفظ فشار اسمزی خارج سلولی دارای نگهدارنده‌های بهتری باشند. از آنجاییکه قند فروکتوز منبع انرژی بهتری برای اسپرمها می‌باشد، پیشنهاد می‌گردد جهت فشار اسمزی خارج سلولی و نیز به درجاتی ضعیفتر جهت حفظ انرژی برای اسپرمها از مجموعه‌های ترکیبات گلوکز، سوکروز، فروکتوز و گلایسین استفاده گردد که درمطالعه آینده ما در تهیه نگهدارنده محیط انجماد مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت. آنچه که به طور عمومی پذیرفته شده است این است که رقیق‌کننده‌های هایپرتونیک بهتر از رقیق کننده‌های هایپوتونیک هستند (32). تأثیر دهیدراتاسیون رقیق‌کننده‌های هایپرتونیک ممکن است شانس تشکیل کریستال‌های یخ داخل سلولی را کاهش دهد (24). مطالعات Mahadevan و همکاران (1983) نشان داد که افزودن سوکروز و گلایسین، در مقایسه با محیط ایزوتونیک MTM سبب بهبود بقا اسپرم‌های انسان گردید (10).
بافر بودن محیطهای انجماد اسپرم جهت اجتناب از آسیب به اسپرم ضروری می‌باشد (1). زرده تخم‌مرغ به عنوان ترکیبی از فسفولیپید، لیپوپروتئین، کلسترول و تعداد متنوعی از ترکیبات دیگر به همراه بافر سیترات و بافر دو یونی TES-Tris که در محیط GEYC و TYBG به کار رفته‌اند، برای انجماد استفاده می‌شوند. بافرهای دو یونی حاوی زرده تخم‌مرغ، گلوکز و گلیسرول به صورت وسیع برای تهیه محیطهای انجماد اسپرم در گونه‌های مختلف پستانداران متداول شدند (34). در محیط GEYC حاوی زرده تخم مرغ بافر بودن محیط توسط سیترات و گلایسین تأمین می‌گردد. اما اخیراً ترکیبی از بافرهای دویونی TES وTris به همراه زرده تخم‌مرغ (محیط TYBG) و معمولاً به همراه گلیسرول استفاده می‌گردد (1). بافر دو یونی دیگر Hepes می‌باشد که به همراه آلبومین انسانی در محیط HSPM کاربرد دارد. چندین سال است که تأثیر زرده تخم‌مرغ در حفظ اسپرم در حرارت پایین شناخته شده است، ولی مکانیسمی که توسط آن، زرده تخم‌مرغ اسپرمها را از شوک سرما حفاظت می‌کند، هنوز به وضوح شناخته نشده است. زرده تخم‌مرغ اسپرمها را از اثرات تخریب کننده دمای پایین حفظ می‌کند و می‌تواند تغییرات ارگان‌های مهم در تحرک و متابولیسم اسپرم را کاهش دهد. پیشنهاد شده است که پایدار کردن غشاء اسپرم و یا حفظ فشار کلوئیدی محیط خارج سلولی ممکن است توسط محیط حاوی زرده تخم‌مرغ مورد تأثیر قرار گیرد. وجود ترکیبات لیپوپروتئینی با دانسیته پایین را نیز می‌توان به عنوان یک حمایت کننده در برابر شوک سرما به هنگام انجماد و ذخیره‌سازی در سرما، در نظر گرفت. احتمال می‌رود که بخش فسفولیپیدی، با دانسیته پایین موجود در زرده تخم‌مرغ سبب حفاظت اسپرمها طی تماس با حرارت پایین شوند و احتمال می‌رود که یک تعویض لیپیدی بین اسپرمها و زرده تخم‌مرغ و یا تأثیر محیط اشباع از اسید چرب، رخ داده باشد (14). زرده تخم‌مرغ که اغلب در محیطهای نگهدارندة انجماد جهت اسپرم‌های انسان مورد استفاده قرار می‌گیرد، علاوه بر اینکه یک محیط نگهدارندة انجماد به شمار می‌رود؛ بلکه سبب حفظ و انسجام بهتر غشای پلاسمایی اسپرم می‌گردد. در واقع برخی از محققین گزارش کرده‌اند که با استفاده از زرده تخم‌مرغ در غیاب گلیسرول می‌توان طول عمر و بقا مناسبی را به دست آورد (35). Emmens، Blockshaw و Sawada نشان دادند که اضافه کردن زرده تخم‌مرغ، مایع فولیکولی انسان، سرم خون انسان، شیر انسان یا گاو به مایع سیمن حاوی گلیسرول باعث افزایش بقاء اسپرمها می‌گردد (36، 29). مطالعات Mahadevan و همکاران نشان می‌دهد که بعضی ترکیبات در مایعات بیولوژیکی (احتمالاً آلبومین) اثرات مفیدی در طول عمر اسپرمها طی انجماد و ذوب مجدد در حضور گلیسرول دارد (10). برخی شواهد وجود دارند که نقش حفاظتی آلبومین را نشان می‌دهند (38، 37) و لذا مشخص می‌شود که حضور آلبومین سرم انسان و سوکروز (در محیط HSPM) نقش حفاظتی مشابه یا بهتری در مقایسه با محیط حاوی زرده تخم‌مرغ در حضور گلیسرول (مثل GEYC) برای اسپرم‌های انسان دارد (10). مطالعه حاضر نیز این گفته را تایید می‌کند و نشان می‌دهد که محیط HSPM حاوی آلبومین سرم انسانی به عنوان منبع پروتئین، نقش حفاظتی بهتری نسبت به دو محیط دیگر حاوی زرده تخم مرغ دارد.
استفاده از سیترات در تهیه بافرهای محیط انجماد به این دلیل است که مایع سیمن یک بافر بی‌کربنات- فسفات شبیه سرم خون نیست بلکه یک بافر بی‌کربنات- سیترات است (9). امروزه محیطهای انجماد اسپرم از خاصیت بافری ترکیبات مایع منی تقلید نمی‌کنند؛ زیرا سیترات در pH بین 4/7-2/7 بافر ضعیفی بوده و بی‌کربنات نیز در مدت کوتاهی به صورت گاز وارد اتمسفر می‌شود. در عوض بیشتر محیطهای کشت بافت هنوز هم به تقلید از سرم خون، حاوی بی‌کربنات هستند. مطالعات Brotherton و همکاران نشان می‌دهد که می‌توان بافر Hepes را به عنوان بافری پایدار جایگزین بی‌کربنات پیشنهاد کرد. استفاده از محیطهای بافت حاوی بافر فسفات استاندارد که حاوی معرف فنل‌رد به عنوان نشانگر pH هستند، راه خوبی جهت مطمئن بودن از pH خنثی نمونه‌های سیمن می‌باشد. خروج یون‌های بی‌کربنات اسیدی به آتمسفر سبب می‌گردد تا pH به بالای 8 رسیده و رنگ محیط خصوصیت ارغوانی پیدا کند (3). در این مطالعه مایع سیمن در همان بافری که جهت کشت تخمک استفاده می‌شود (یعنی بافر Hepes)، با اضافه کردن گلیسرول، به همراه آلبومین سرم بعنوان منبع پروتئین و بدون زرده تخم‌مرغ، منجمد گردید و نتایج موفقیت آمیزی در IVF به دست آمد. این محیط، محیطی است که امروزه ترجیح داده می‌شود (3).
اما نتایج حاضر از بهتر بودن محیط HSPM نسبت به محیط TYBG مخالف دسته دیگر از مطالعاتی است که در مقایسه این دو محیط انجام شده است. مطالعات Prins و همکاران نشان می‌دهند که از میان سیستم‌های بافری تست شده، TYB-G دارای گلیسرول دارای بهترین بازده تحرک اسپرم انسان پس از ذوب می‌باشد. به نظر می‌رسد که نسبت یک ترکیب اختصاصی در هر محیط دارای اهمیت حیاتی باشد؛ زیرا استفاده از محیط TYB-G علی‌رغم تفاوت در نسبت ترکیبات محیط مثل گلیسرول یا زرده تخم‌مرغ، نتایج مشابهی را نشان می‌دهند. اختلاف اساسی بین محیط TYB باگلیسرول و بدون گلیسرول نشان می‌داد که وجود گلیسرول به عنوان یک ماده نگهدارندة در انجماد در این محیط جهت بقاء مناسب پس از انجماد حیاتی و ضروری می‌باشد. بازده بهتر اسپرمها زمانی مشاهده شد که از بافر TEST استفاده شد که احتمالاً بخاطر ظرفیت این بافر در برداشتن یون‌های هیدروژن در محیط اطراف و لذا کمک به روند دهیدراتاسیون باشد. بافر دیگر تست شده در این مطالعه بافر Hepes دارای گلیسرول بوده که افزایش بقاء اسپرمها را نشان داد؛ اگرچه بازده آن برای اسپرم‌های انسان بخوبی سیستم بافری حاوی گلیسرول نبوده است. بهرحال در مقایسه مستقیم با سیستم بافریTEST، دو سیستم بافری در محیطهای HSPM حاوی 15 % (v/v ) گلیسرول که به نسبت 1:1 با نمونه مایع سمینال مخلوط گردیده و محیط GEYC دارای بازده اسپرم کمتری بوده‌اند (9). مطالعات McGonagle و همکاران نیز نشان می‌دهد که محیطTYB-G بهتر از محیط GEYC جهت حفظ تحرک و حیات اسپرم می‌باشد (34). در ضمن نشان داده شده است که محیط TYB-G تاثیر مثبتی روی کیفیت اسپرم از نظر تحرک و ظرفیت باروری دارد (40، 39) و مطالعات Prins و همکاران نشان می‌دهد که محیط TYB محیط نگهدارنده بهتری نسبت به HSPM می‌باشد(9). همچنین مطالعات McCoshen و همکاران نشان داد که استفاده از اسپرم‌های منجمد شده در محیط TYB-G، با توجه به نتایج حاملگی مشابه مایع سیمن تازه می‌باشد (41) که ممکن است بخاطر طول عمر مناسب اسپرمها در محیطهای مورد استفاده باشد (9).
مطالعه دیگری نشان داد که باروری مایع منی منجمد شده در محیط HSPM و یا GEYC تفاوت معنیداری نداشت؛ ولی درصد سیکل منتج به حاملگی برای نمونه‌های منجمدشده در محیط HSPM در مقایسه با محیط GEYC بالاتر بود (10) و لذا پیشنهاد شده است که از این محیط به عنوان رقیق‌کننده نسبت به GEYC استفاده گردد. منافع HSPM شامل اینکه، برخلاف GEYC و TYBG، محیط HSPM استریل بوده، از نظر شیمیایی محیط تعریف شده‌ای بود و محتوی زرده تخم‌مرغ و یا هرگونه پروتئین‌های غیرانسانی نمی‌باشد و این به معنی اجتناب از آنتی‌بادی‌های احتمالی در پاسخ به تلقیح داخل رحمی اسپرم حاوی این پروتئین‌هاست. جالب است که یادآوری شود که Griffin و همکاران گزارش کرده‌اند که آنتی‌بادی علیه پروتئین‌های زرده تخم‌مرغ به دنبال تلقیح مکرر در گاوها مشاهده شده است (42). به هرحال Park وHunter گزارش کرده‌اند که نه تولید آنتی‌بادی و نه باروری هیچ کدام با تلقیح گاو توسط تنها زرده تخم‌مرغ به عنوان رقیق‌کننده تحت تأثیر قرار نگرفته بودند (43). برخلاف GEYC، نیاز به آماده‌سازی HSPM به صورت تازه و به طور هفتگی و یا در فاصله‌های زمانی کوتاه نیست. HSPM را می‌توان در C20- برای حداقل 3 ماه نگهداری کرد؛ اگرچه Jondet گزارش کرده است که محیط GEYC را نیز می‌توان برای چند ماه به صورت یخ زده ذخیره نمود (44). تولید تجاری HSPM و یا در فاصله‌های زمانی کوتاه عملی است. تعیین درصد تحرک اسپرم منجمد شده بعد از روند انجماد در محیط HSPM بدلیل دانسیته پایین‌تر آسانتر از محیط GEYC می‌باشد (10).
محیط HSPM مورد استفاده در این مطالعه دارای 5/6pH= می‌باشد که کمتر از دو محیط دیگر (4/7 pH=) می‌باشد. اگرچه اکثر محققین استفاده از محیطهای انجماد با 7=pH تا 4/7=pH را پیشنهاد کرده‌اند؛ اما گزارشی از تأثیر 4/7-7=pH روی بقاء اسپرم‌های انسان گزارش نگردیده است (10 ). با این وجود pH اپتی‌‌مم محیط HSPM در حدود 7-5/6 بود و Foote و همکاران گزارش کرده‌اند که 5/6=pH در بافر رقیق‌کننده محتوی Tris سبب افزایش باروری با مایع سیمن منجمد شده گاو شده است (45). اگرچه دلیل این امر شناخته شده نیست اما ممکن است مربوط به تغییرات واضح pH در طی روند انجماد باشد (46) و لذا کمتر بودن pH مورد نظر در محیط HSPM احتمالا بتواند دلیل دیگری برای بهتر بودن این محیط نسبت به محیطهای GEYC و TYBG جهت انجماد اسپرم باشد.
نتایج Stanic و همکاران ثابت می‌کند که در صورتیکه افرادی با معیارهای اسپرموگرام استاندارد اهداء کننده باشند، استفاده از مایع منی منجمد شده برای تلقیح مصنوعی می‌تواند نتایج بهتری را به همراه داشته باشد؛ زیرا بهبود تحرک در مایع منی منجمد شده ممکن است کارایی و بازده باروری را افزایش دهد(11). در این مطالعه نیز جهت بررسی تاثیر تحرک اولیه اسپرم در بازده تحرک (میزان بقاء) پس از انجماد، نمونه‌های مایع سمینال در دو گروه با درصد تحرک بالاتر از 50% و مساوی یا کمتر از 50% بصورت جداگانه مورد بررسی قرار گرفته است. بررسی نتایج ما نیز مطالب مذکور را تایید می‌کند و نشان می‌دهد که تفاوت معنیداری بین میانگین بازده تحرک با میزان بقا نمونه‌های با بیش از 50% تحرک اولیه و نمونه‌های با درصد تحرک اولیه مساوی یا کمتر از 50% قبل از انجماد و بعد از انجماد با استفاده از هر یک از محیطها و روش‌های انجماد وجود دارد (05/0P<). پس اگر از مایع سمینال تازه با بیش از 50% تحرک اولیه جهت انجماد استفاده گردد، بازده بالاتری را پس از انجماد و ذوب مجدد نشان خواهد داد. گزارشات Brotherton و همکاران نیز نشان می‌دهد که تحرک اسپرماتوزوئید انسان چه درصد تحرک و چه سرعت آن، در مایع انزالی تازه بستگی به شمارش اسپرم و درصد مورفولوژی طبیعی دارد. به جز در تعدادی موارد غیرطبیعی، زمانیکه شمارش اسپرم بالا باشد، درصد تحرک نیز بالا می‌باشد. همچنانکه نمونه‌های مایع سمینال بتدریج ضعیفتر می‌شوند، شمارش اسپرم، تحرک و مرفولوژی همگی کاهش می‌یابند؛ چرا که اینها پارامترهای جداگانه‌ای نیستند و همگی با همدیگر منعکس‌کننده کیفیت مایع انزال هستند.
با توجه به بحث مذکور می‌توان نتیجه‌گیری کرد که روش برنامه‌ریزی شده آهسته (دستگاهی) بهتر از انجماد در فاز بخار ازت مایع (غیردستگاهی) جهت انجماد اسپرم بوده و همچنین محیط HSPM به دلیل غلظت کمتر گلیسرول، حفظ فشار اسمزی مناسب، استفاده از بافر دویونی مناسب، استفاده از آلبومین سرم انسانی به عنوان منبع پروتئین و استفاده از محیط نگهدارنده مناسب، بهتر از دو محیط GEYC و TYBG جهت انجماد اسپرم می‌باشد.
بدینوسیله از همکاران محترم پژوهشکده ابن‌سینا و مرکز درمان ناباروری ابن‌سینا که ما را در انجام این مطالعه یاری نمودند قدردانی می‌شود.
