15-10% از زوجها در سنین باروری با مشکل ناباروری مواجه هستند. ناباروری با علت مردانه حدود 50% از علل این ناباروریها می‌باشد (2،1). هرچند بیش از یک قرن، آنالیز مایع منی (SA) به عنوان آزمایشی روتین و ساده جهت ارزیابی توانایی باروری مردان به کار رفته است؛ با این وجود در بسیاری از موارد پارامترهای تعداد، قدرت تحرک و مورفولوژی اسپرم، (براساس روش‌های استاندارد سازمان جهانی بهداشت (WHO) (3))، نمی‌توانند به عنوان فاکتورهای پیش‌بینی کنندة توانایی باروری مردان محسوب گردند و در تصمیم‌گیری درمان زوج‌های نابارور و انتخاب نوع درمان به کار روند. بنابراین طی مطالعات متعدد، به کارگیری آزمایشات عملکردی اسپرم (SFT) پیشنهاد شده و در موارد ارزیابی کلینیکی در خصوص پیش‌بینی قدرت باروری افراد پیشنهاد شده است. تست‌های متعددی بر مبنای عملکرد فیزیولوژی و مولکولی اسپرم در روند لقاح معرفی شده‌اند، از جمله توانایی اتصال اسپرم به لایه شفاف اطراف تخمک در اولین مرحله لقاح، قدرت نفوذ شیمیایی اسپرم و به عبارتی توانایی انجام واکنش اکروزومی(AR) ، ارزیابی وضعیت DNA و کروماتین اسپرم را می‌توان نام برد. در تحقیقات متعددی ارزش کلینیکی و قدرت پیش‌گوئی‌کننده این تستها با میزان لقاح و توان باروری اسپرم به اثبات رسیده است (8-4). به نظر می‌رسد عملکرد مناسب اسپرم دارای ارتباط کامل با کروماتین طبیعی آن باشد. روش‌هایی که روی غلظت و پایداری کروماتین اسپرم می‌باشد از سایر تست‌های عملکردی مورد توجه بیشتری قرارگرفته است (9). در این بین استفاده از رنگ فلوروکروم اکریدین نارنجی به روش معمولی و نیز بررسی ساختار کروماتینی اسپرم (SCSA) مورد توجه قرار گرفته است.
از آزمایش‌های عملکردی اسپرم که برای پیش آگهی از درصد لقاح کاربرد دارد، آزمایش طبیعی بودن DNA اسپرم با روش معمولی است. اساس این روش بر این نکته متکی است که اگر افزایش تراکم کروماتین در طی مراحل ساخته شدن اسپرم به درستی انجام نگرفته باشد، هنگامی که در معرض مواد اسیدی نظیر اسید استیک قرار می‌گیرد. دو رشته DNAو اسپرم از یکدیگر جدا شده و به DNA تک رشته‌ای تبدیل می‌شود. اسپرمهای دارای این خصوصیت قابلیت لقاح کمتری دارند (10).
سنجش طبیعی بودن DNA اسپرم با روش‌های مختلفی چون استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی با آنیلین بلو اسیدی (11)، آکریدین نارنجی (12)، مطالعات میکروسکوپ الکترونی (13)، سنجش پایداری هسته اسپرم توسط فلوسیتومتری (14) و استفاده از برومید اتیدیوم (15) نیز امکان‌پذیر می‌باشد. در تحقیق حاضر از الگوی اتصال DNA اسپرم با ترکیب فلوروکروم آکریدین نارنجی به عنوان معرف طبیعی یا غیرطبیعی بودن DNA اسپرم استفاده گردید. علاوه بر این در این تحقیق ارزش تشخیصی میزان DNA دو رشته‌ای اسپرم در پیش‌بینی موفقیت IVF مورد ارزیابی قرار گرفت.
این مطالعه مقطعی- تحلیلی طی مدت 10 ماه (آبان 1381 تا مرداد ماه 1382)، روی افراد مراجعه‌کننده به مرکز تحقیقاتی درمانی ناباروری دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد و بیمارستان مادر یزد انجام شد. زوجین پس از ارائه توضیحات در مورد مطالعه و اخذ رضایت برحسب میزان لقاح بیش از 50% و یا کمتر از 50% وارد مطالعه شدند. مجموعاً 100 سیکل درمانی IVF ارزیابی شد. معیارهای ورود به مطالعه شامل آنالیز اسپرم طبیعی براساس معیارهای سازمان جهانی بهداشت (1999) عدم وجود، ناباروری با علت زنانه داشتن حداقل 3 تخمک در مرحله متافاز П بود. هر نمونه پس از حداقل 2 و حداکثر 7 روز خودداری از تماس جنسی در ظروف پلاستیکی استریل جمع‌آوری و در انکوباتور C37 نگه‌داری شد. با استفاده از سرنگ یک بار مصرف، حجم نمونه‌ها اندازه‌گیری گردید. بلافاصله پس از مایع شدن ، یک قطره از مایع منی که به خوبی مخلوط شده بود، بین لام ولامل قرار گرفت و در زیر میکروسکوپ، با بزرگنمایی 100 و400 مورد بررسی قرار گرفت. تعداد کل اسپرم به کمک لام نئوبار محاسبه گردید. تحرک (کل، سریع، آهسته و درجا) و مورفولوژی چشمی اسپرم مورد ارزیابی قرارگرفت. جهت بررسی مورفولوژی اسپرم علاوه بر روش چشمی، یک گسترش نازک بر روی لام از هر بیمار 2 لام تهیه گردید. پس از خشک شدن نمونه‌ها در مجاورت هوا وتثبیت آنها براساس روش پاپانیکولا رنگ‌آمیزی صورت گرفته و پس از کدگذاری در زمان مشخص به لحاظ مورفولوژی با بزرگنمائی 1000 مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه مورفولوژی اسپرمها براساس تقسیم‌بندی سازمان جهانی بهداشت به چهار گروه طبیعی، دارای ناهنجاری‌های سر، دم و قطعه میانی تقسیم شد.
هنگام شمارش اسپرمها، هر نمونه توسط محقق دو بار و در طی روزهای متوالی مورد بررسی قرار گرفت و در صورتی که تفاوت میزان درصد اسپرمهای دارای مورفولوژی طبیعی در دو بار بیش از 10% بود نمونه مجدداً به وسیله فرد دومی شمارش می‌شد و در صورتی که تفاوت میانگین 3 بررسی، کمتر از 10% بود، میانگین آنها گزارش می‌شد.
جهت بررسی طبیعی بودن DNA اسپرم، از هر نمونه تعداد 2 اسمیر نازک، تهیه شد. گسترشها در هوای آزاد با فیکساتور کارنوی (Merck, Germany) تثبیت گردید. سپس درون بافری متشکل از ml30 اسید سیتریک M1/0 با ml5/2 از Na2HPO4,7H2O M3/0 با 5/2pH= قرار گرفتند. آنگاه با استفاده از نارنجی آکریدین (Sigma,USA) به مدت 5 دقیقه رنگ‌آمیزی و با استفاده میکروسکوپ فلورسانس با بزرگنمایی 400 و با طول موج nm490-450 اسپرمهای رنگ‌آمیزی شده برای هر نمونه حداقل 200 اسپرم مورد شمارش قرار گرفت (Ziess, AxioPhot, Germany). اسپرمهای دارای DNA طبیعی (دو رشته‌ای) سبز و آنهایی که DNA تک رشته‌ای داشتند قرمز یا نارنجی دیده می‌شدند اما حالت‌های DNA بینابینی، رنگی حد واسط سبز و قرمز داشتند (1992Liu,) (16).
محاسبه درصد لقاح با تقسیم تعداد سلول‌های تخم حاصل بر تعداد تخمک‌های متافاز IIاولیه وضرب نتیجه حاصل در عدد 100 به دست آمد. این بخش توسط پرسنل آزمایشگاه جنین‌شناسی مرکز انجام شد و در طول تحقیق بدون اطلاع از نتایج لقاح، آزمایشات بخش اول روی اسپرم مردان انجام می‌گرفت و در پایان نتایج حاصله با نتایج لقاح مقایسه می‌گردید.
برای آنالیز نتایج حاصل از نرم افزار SPSS نسخه 5/11 استفاده شد. ابتدا همبستگی بین لقاح و هر یک از فاکتورهای اسپرمی به دست آمد. سپس نمونه‌های با لقاح موفق به دو گروه با لقاح مساوی یا کمتر از 50% و بیشتر از 50% دسته‌بندی شده و آنگاه آنالیز واریانس بین میانگین‌های هر پارامتر در سه نمـونه انجام شد. همچنین برای پیشگویی لقاح از آنالیـز ROC استفاده گردید.
در این مطالعه مجموعاً 100 نمونه مورد بررسی قرار گرفت؛ ولی از آنجایی که تفسیر نتایج تابع آزمایش‌های متعددی در مراحل مختلف بود، حدود 16 نمونه در پایان تحقیق از مطالعه خارج شدند که مناسب نبودن نمونه‌های تهیه شده جهت آنالیز DNA، لغو سیکل درمانی به علت عدم استحصال تخمک و یا بدست آمدن تخمک‌های نامناسب از علل آن بودند، بنابراین تجزیه و تحلیل‌های آماری روی 84 نمونه صورت پذیرفت. اگر پس از تمام آزمایشات به دلایلی،IVF صورت نگرفته و یا نتیجه لقاح مشخص نبود، نمونه از روند تجزیه و تحلیل خارج می‌شد. ارتباط معنی‌داری بین سن افراد بیمار (مردان 2/34/33 سال) و میزان لقاح IVF (متوسط 6/353/72) وجود نداشت. براساس نتایج لقاح، نمونه‌ها به سه گروه با عدم موفقیت کامل لقاح (TFF) و در مواردیکه لقاح وجودداشت به گروه موفقیت بالای 50% و گروه با لقاح کمتر از 50% تقسیم گردید. از میان فاکتورهای مختلف آنالیز مایع منی در بررسی مورفولوژی با رنگ‌آمیزی پاپانیکولا، اسپرمهای دارای ناهنجاری‌های دم و اسپرمهای دارای حرکت درجا دارای ارتباط معنی‌داری با لقاحIVF بودند (05/0p<) نتایج مربوط به سیکل‌های TFF در مقایسه با دو نمونه دارای لقاح 50%FR< و لقاح 50% FR> در ارتباط با ناهنجاری‌های دم در سطح 05/0p< اختلاف معنی‌داری وجود داشت (جدول شمارة 1). DNA در 55% نمونه‌ها از نوع دو رشته‌ای، 28% تک رشته‌ای و 17% در وضعیت بینابینی قرار داشتند. نتایج حاصل از بررسی وضعیت DNA اسپرم نشان داد که بین میزان لقاح و DNAدو رشته‌ای ارتباط معنی‌داری وجود دارد (05/0p<). میزان DNA دورشته‌ای در دو گروه براساس نتایج لقاح IVF، 8/28+2/42 و4/27+ 2/60 به ترتیب در سیکل‌های با لقاح کمتر از 50% و لقاح بیش از 50% مشاهده گردید (05/0p<).
بررسی اطلاعات حاصل از سنجش طبیعی بودن DNA اسپرم با استفاده از ROC نشان داد زمانی که نقطة برش برای لقاح، 50% در نظرگرفته شود، نقطة برش برای DNA دو رشته‌ای 25/47% خواهد بود.
بدین معنی که اگر میزانDNA دو رشته‌ای بیش از 25/47% باشد، میزان لقاح در IVF بیش از 50% است (نمودار شماره 1).
ثابت شده است که اسپرم مردان نابارور میزان بالاتری در ناهنجاری کروموزومی، پایداری کمتری نسبت به دناتوره شدن توسط سدیم دودسیل سولفات (SDS) (17)، عدم تراکم DNA و کروماتین (18) و افزایش شکست DNA (19) دارا می‌باشد.
در سال 1999، Evensonبه این نتیجه رسید که وضعیت DNA و کروماتین اسپرم با باروری در محیط خارج از بدن مرتبط است. وی اعتقاد داشت که اگرچه این آزمون با پارامترهای غلظت، تحرک و مورفولوژی گزارش شده براساس معیارهایWHO مرتبط نیست؛ ولی می‌تواند به عنوان فاکتوری مستقل در پیشگویی لقاح مؤثر باشد. مطالعات متعددی نشان داده است که درصد سلول‌های اسپرمی با اختلالات DNA در دو گروه مردان نابارور و مردانی که توانایی باروری طبیعی دارند به طور معنی‌داری متفاوت است (20، 16، 4،2). به طوریکهEvenson و همکاران آستانه ناباروری در سطح 30% را در خصوص طبیعی بودن DNA در گروه‌های نابارور گزارش نمودند. در مطالعه اخیر نتایج نشان داد که در سیکل‌های درمانی با لقاح 50% و بیشتر، سطح طبیعی بودن DNA حدود 47% می‌باشد. که با در نظر گرفتن نتایج حاصله از منحنی ROC (نمودار شماره 1) و سطح 30% قادر به پیش‌بینی موفقیت و یا عدم موفقیت لقاح در سیکل‌های درمانی، موافق با یافته‌های فوق می‌باشد؛ هرچند در تحقیق مورد اشاره از روش ارزیابی با استفاده از فلوسایتومتری استفاده شده بود. در تحقیق حاضر در خصوص شمارش اسپرم و درصد DNA تک رشته‌ای در گروه‌های مختلف ارتباط ضعیفی وجود داشت، ولی با توجه به اینکه در هر سه گروه به لحاظ شمارش نرمواسپرم بودند شاید نتوان به عنوان یک پارامتر جهت پیش‌بینی کیفیت DNA استفاده نمود. این نتیجه شبیه یافته‌های Irvine و همکاران در سال 2000 می‌باشد که در مطالعه آنها کیفیت پارامترهای اسپرمی با روش‌های مختلف تعیین و وضعیت DNA اسپرم مورد بررسی قرارگرفته است. درحالیکه در مطالعات دیگر ارتباطی بین کیفیت اسپرم بر مبنای معیارهای استاندارد سازمان جهانی بهداشت و نیز وضعیت DNA اسپرم دیده نشده و به عبارتی با استفاده از پارامترهای اسپرمی امکان پیش‌بینی کیفیت DNA و برعکس نبوده است (22،21).
حداقل سه مکانیزم جهت اختلال در DNA اسپرم پذیرفته شده است، که عبارتند از: 1) اختلال در تراکم کروماتین اسپرم در خلال فرآیند اسپرماتوژنز 2) شروع آپوپتوز در خلال فرآیند اسپرماتوژنز و یا در هنگام حرکت اسپرم در طول دستگاه تناسلی مردانه و یا زنانه 3) صدمات ناشی از رادیکال‌های آزاد که بکارگیری آنتی‌اکسیدانها می‌تواند باعث کاهش رادیکال‌های آزاد و نهایتاً کاهش اثرات منفی ROS و متعاقب آن کاهش شکست DNA گردد. هرچند علاوه بر مکانیزم‌های فوق می‌توان خطر ژنتیکی در بروز لقاح خارج رحمی در درمان مردان نابارور را نیز مورد توجه قرار داد و به این منظور استفاده از آنتی‌اکسیدانها در خلال سیکل درمانی بسیار مهم می‌باشد (24،23).
مطالعـات انجام شـده در سال‌های اخیر نشـان داده است که آسیبDNA اسپرم انسان اثر معکوس بر روی تکامل جنین حاصله در سیکل‌های درمانی خارج از رحمی دارد (25،7). در مطالعات ذکر شده اثرات آسیب DNA اسپرم بر تکوین بلاستوسیت در سیکل‌های درمانی IVF گزارش شده است؛ که درصد بالای آسیب اسپرم در سطح بالای 30% با چند هسته‌ای بودن بلاستومرها در سیکل‌های درمانی مرتبط بوده است. کیفیت DNA اسپرم در ارتباط با نتایج باروری سیکل‌های کمک باروری و نیز سیکل‌های IUI بود که در سیکل‌های اخیر نمونه‌هایی که بیش از 12% اسپرمهای با DNA غیرطبیعی داشته‌اند بارداری صورت نگرفته است (23). Hammadeh در سال 2001 گزارش نمود که DNA غیر متراکم قادر به لقاح نمی باشد. در مطالعات اخیر ثابت شده است که DNA نابالغ، حتی در صورتی که مستقیماً به داخل تخمک تزریق شود قادر به لقاح نمی‌باشد. در همین راستا Chapman در سال 2003 پیشنهاد نمود که متراکم شدن ناقص DNA فاکتور معنی‌داری در سنجش ناباروری مردانه می‌باشد. افزایش نرخ DNA تک رشته‌ای در افراد با باروری کمتر را می‌توان به نقص در عملکرد اپیدیدیم وبیضه ارتباط داد.نقص در عملکرد ژنها، سنتز پروتئینها و اختلال در انجام واکنش‌های بیوشیمیایی درگیر در فرآیند متراکم شدن DNA اسپرم از تئوری‌های پیشنهادی برای این پدیـده از دیـدگاه ملکولـی است و شناخت مکانیسم‌هـای دقیقتر، احتیاج به مطالعات بیشتر دارد.
علاوه بر این، در تحقیق اخیر با استفاده از آنالیز ROC، ارتباط بین DNA دو رشته‌ای و میزان لقاح مساوی یا کمتر از 50% و بیشتر از 50% (نقطة برش 50%) مورد بررسی قرار گرفت. در شرایطی که نقطة برش برای لقاح 50 در نظر گرفته شود بهترین نقطة برش برای DNA دو رشته‌ای 25/47% می‌باشد. Hoshiدر سال 1996 نشان داد هنگامی که میزان DNA دو رشته‌ای بیشتر از 50% باشد معمولاً IVF موفقیت‌آمیز است.
در تحقیق او هنگامی که میزان DNAدو رشته‌ای کمتر از 50% بود، میزان موفقیت درICSI نیز 26% بود.
Jeulin در سال 1986 با استفاده از رنگ‌آمیزی آنیلین بلو، تفاوت معنی‌داری درDNA دو رشته‌ای افراد با نرخ لقاح کمتر از 30% و بیشتر از 30% مشاهده نمود. از آنالیز رگرسیون فاکتورهای اسپرمهای دارای حرکت درجا، اسپرمهای دارای ناهنجاری در ناحیه دم و طبیعی بودن DNA ارزش پیشگویی کنندگی طبیعی بودن DNA بالاتر از سایر موارد است. بنابراین در مواردی که اسپرم دارای وضعیت طبیعی و یا اختلال ضعیف است و یا در سیکل‌های با علت نامشخص و درمان‌های ناموفق متعدد، به نظر می‌رسد توصیه به انجام تست‌های عملکردی نظیر طبیعی بودن DNA مفید باشد.
با توجه به نتایج تحقیق اخیر و نیز مطالعات مشابه، هرچند ارزیابی کیفیت DNA اسپرم در ارتباط ضعیف تا متوسط با شمارش اسپرم و یا مرفولوژی اسپرم می‌باشد، و در تحقیقات انجام شده مشابهت نتایج یکسان نبوده است، با این وجود قدرت پیش‌بینی‌کنندگی میزان لقاح و حتی تکامل تا مرحله بلاستوسیت و متعاقباً بارداری را دارا می‌باشد. با این وجود به نظر می‌رسد با توجه به پیچیدگی فرآیند لقاح آزمایش عملکرد اسپرم به تنهایی قدرت پیش‌بینی‌کنندگی لقاح را دارا نباشد و نتایج تحقیق حاضر تنها پیش‌بینی لقاح بالاتر از 50% و شکست کامل لقاح را متمایز می‌نمود، که با توجه به سادگی و ارزان بودن این تست می‌توان آن را در موارد شکست کامل و یا موفقیت با درصد کم در سیکل‌های درمانی به این قبیل زوجها پیشنهاد نمود.
نـویسندگان مقالـه از همـکاری جنـاب آقـایـان مهــرداد سلیمانی، حسین فضلی و سایر همکاران مرکز ناباروری یزد و آزمایشگاه امبریولوژی بیمارستان مادر تشکر و قدردانی می‌نماید. ضمناً، از بیمارانی که با رضایت در این تحقیق مشارکت نمودند، سپاسگزاری می‌شود.
