Influence of cryoprotectants on DNA fragmentation of in vitro produced porcine blastocysts

Rajaei, Farzad; Otoi, Takshij

Influence of cryoprotectants on DNA fragmentation of in vitro produced porcine blastocysts

Authors

Farzad Rajaei ¹

Takshij Otoi ²

¹ Cell Culture Laboratory, Department of Anatomy, Qazvin University of Medical Sciences, Ghazvin, Iran

² Department of Reproduction, Faculty of Veterinary, Yamaguchi University, Yamaguchi, Japan

Abstract

Introduction: The aim of the present study was to investigate the effects of different cryoprotectants (CPs) on DNA fragmentation of in vitro produced blastocysts to determine an appropriate cryoprotectant for embryo cryopreservation. Therefore, the precise aims of the study were to assess the toxic effects of different cryoprotectants in terms of survival rate and to evaluate the effects of different CPs on DNA fragmentation in in vitro produced porcine blastocysts. Ethylene glycol, 1,2 propanediol and glycerol are common cryoprotectants widely used for embryo cryopreservation in different animals as well as humans. Materials & Methods: 197 porcine blastocysts were produced in vitro and 160 blastocysts were random-ly selected and divided into 4 groups. 40 blastocysts were placed in phosphate buffer solution (PBS) with-out any cryoprotectants for 1 hour in room temperature (23-25C) as the control group. The rest of the blastocysts were exposed to 3 different cryoprotectants (10% solutions) ethylene glycol (EG), 1, 2 pro-panediol (PG) and glycerol (Gly) for 1 hour in a 3- step method in room temperature. The survival rate was assessed after culture in NCSU-37 medium for 24 hours as the proportion of recovered embryos with the reformation of blastocele observed by stereomicroscopy at 40 magnifications. The apoptotic indices were evaluated after staining by TUNEL technique to label apoptotic nuclei and later were counter-stained by propidium iodide (PI) to label all nuclei and were analyzed by fluorescent microscopy. Then, the sur-vival rate was compared with the data obtained from the control group. Through ANOVA and Fishers exact test the data were analyzed while employing StatView software and the level of significance was considered as 0.05%. Results: Exposing porcine blastocysts to different cryoprotectants results in an increase in DNA fragmentation, although the apoptotic index in blastocysts with blastocele compared to those without them were lower in the study, disregard of the kind of cryoprotectant. Conclusion: It is concluded that CPs can decrease the survival rate of porcine blastocysts by increasing the percentage of DNA fragmentation but EG has the least effect on DNA fragmentation.

Keywords

Apoptosis

Blastocyst

Cryoprotectants

Cytotoxicity

DNA Fragmentation

pig

زمینه و هدف

تعداد سلولها و میزان آپوپتوزیز نشانه‌های مفیدی از سلامت و تکامل جنین می‌باشند. مرگ سلولی حتی در طول تکامل اولیه جنینی در محیط‌های In vivo و In vitro (IVM ، IVF و IVC ) اتفاق می‌افتد (1). در بلاستوسیست‌های سالم، بعضی از سلولها ناشی از محرک‌های مختلف مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی را طی کرده که منجر به تنظیم تعداد سلولها یا حذف سلول‌های آسیب‌دیده در طول تکامل جنین می‌شود (2). علی‌رغم اثرات مفید آپوپتوزیز، در صورتی که تعداد و نسبت سلول‌هایی که وارد آپوپتوزیز می‌گردند افزایش یابد، اثرات مخرب و مضری بر تکامل و لانه‌گزینی جنین دارد (3). عوامل استرس‌زای محیطی نظیر افزایش pH داخل سلولی، سمیت محلولها و غلظت‌های سمی Ca2+ ممکن است منجر به آپوپتوزیز در بلاستومرها گردد (4). مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی که آپوپتوزیز نامیده می‌شود (5)، شکلی از مرگ سلولی است که توسط دو شاخص اصلی از نکروز مشخص می‌شود. شاخص اول، ویژگی‌های مورفولوژی نظیر کاهش حجم سلول، متراکم شدن کروماتین، فراگمنته شدن هسته‌ای و در نهایت تشکیل اجسام آپوپتوزی است و شاخص دیگر، شکست و قطعه قطعه شدن DNA می‌باشد که DNA بوسیله یک اندونوکلئاز وابسته به یون کلسیم و منیزیوم به قطعات اولیگونوکلئوزومی قطعه قطعه می‌شود. امروزه از روشی بنام TUNEL برای رنگ‌آمیزی سلول‌های آپوپتوزی (میزان شکست DNA) به طور رایج استفاده می‌شود. در این روش انتهای قطعات DNA شکسته شده بوسیله آنزیم دی‌اکسی ترانسفراز انتهایی (TDT) با نوکلئوتیدهای جدید تغییر داده شده (فلوئورسین-dUTP) نشاندار می‌شوند و بنابراین انتهای شکسته شدة قطعات DNA دو زنجیره‌ای، مستقل از زنجیره قالب نشان‌دار شده و در زیر میکروسکوپ فلوئورسانس قابل رویت می‌شود (7،6). در این روش حتی سلول‌های مراحل اولیه آپوپتوزیز نشان‌دار می‌شوند (5). این تکنیک در اندازه‌گیری کمی مرگ سلولی در جنین، که دارای تعداد سلول‌های معدودی بوده و بنابراین مقادیر کمی DNA دارد بسیار مفید است (8،7). تاکنون به منظور جلوگیری از تشکیل یخ داخل سلولی از ضدیخ‌های فراوانی جهت انجماد جنین‌های مرحله قبل از لانه‌گزینی استفاده شده است؛ ولی با این وجود تعداد زیادی از جنینها پس از ذوب به دلایل مختلفی از جمله نوع ضد یخ مورد استفاده و به دنبال آن شکست DNA جنین در اثر سمیت ضدیخ از بین می‌روند. اتیلن گلیکول (EG)، 1و2 پروپاندیول (PD) و گلیسرول (GLY) به طور وسیعی برای انجماد جنین در حیوانات گوناگون و همچنین انسان استفاده می‌شوند (9). مرگ بلاستومرها بعد از انجماد، به دلیل تشکیل یخ در حین انجماد و ذوب پس از آن، تورم اسمزی و سمیت شیمیایی ضدیخ می‌باشد (11،10). اخیراً نشان داده شده است که تعداد سلول‌های آپوپتوزی جنین‌های منجمد شده پس از ذوب در مقایسه با جنین‌های منجمد نشده بیشتر است (12،13). با این وجود اطلاعات کمی در مورد اثرات ضدیخها بر مرگ سلولی بلاستومرها در جنین وجود دارد. براساس مطالعات قبلی، شکست DNA در طی پدیده انجماد مورد بررسی قرار گرفته است؛ ولی اینکه شکست DNA به دلیل عوامل برودتی می‌باشد یا عامل ضدیخ، هنوز مورد بحث می‌باشد.

هدف از مطالعه حاضر، ارزیابی اثرات ضد یخ‌های متفاوت بر روی میزان شکست DNA بلاستوسیستها به دنبال قرار گرفتن در معرض ضدیخ‌های مختلف به منظور تعیین ضدیخ مناسب برای انجماد جنین و مشخص کردن مکانیسم‌های آسیب به جنین قبل از انجماد بود. به دلیل محدودیت‌های موجود در استفاده از جنین انسان و به دلیل شباهت زیاد مراحل تکاملی جنین انسان با جنین خوک، در این مطالعه از جنین خوک استفاده شد.

روش بررسی

تعداد 197 بلاستوسیست خوک به روش In vitro تولید شدند و به طور تصادفی به چهار گروه تقسیم گردیدند.

جمع‌آوری اووسیتها و بلوغ در محیط کشت: تخمدان‌های خوک پس از تهیه از کشتارگاهی در شهر کیتاکیوشو ژاپن، بلافاصله در داخل سرم فیزیولوژی با درجه حرارت °C 35 به آزمایشگاه منتقل گردید. اووسیتها بوسیله یک سرنگ ml10 با سرسوزن 18 از فولیکول‌های با قطر mm6-3 آسپیره شده و در محلول تغییر یافته PBS (Nihonzenyaku, Japan) حاوی IU/ml 100 پنی‌سیلین G (Sigma, Germany) و mg/ml 1/0 استرپتومایسین سولفات (Sigma, Germany) قرار گرفت. تنها از اووسیت‌های با اووپلاسم یکنواخت و سلول‌های کومولوس متراکم در این تحقیق استفاده شد. برای بلوغ اووسیتها از روش Kikuchi و همکاران (14) استفاده گردید. به طور خلاصه در حدود 50 کمپلکس اووسیت- کومولوس به مدت 22-20 ساعت در l500 از محیط کشت بلوغ 37- NCSU حاوی 10% مایع فولیکولی خوک (V/V) و mM 6/0 سیستئین (Sigma, Germany)، mM 1 dbcAMP (Sigma, USA)، m 50 β- مرکاپتواتانل (Wako, Japan)، IU/ml 10 گنادوتروپین کوریونی اسب یا eCG (Teikokuzoki, Japan)، IU/ml 10 گنادوترو-پین کوریونی انسانی یا hCG (Teikokuzoki, Japan) و g/ml50 جنتامایسین (Sigma, Germany) قرار گرفتند. کمپلکس اووسیت- کومولوس مجدداً در محلول NCSU-37 بدون dbcAMP و هورمون به مدت 24 ساعت کشت داده شد. تمام کشتها در دمای °C5/38 و در انکوباتور مرطوب حاوی 5% گاز CO2 انجام شد.

IVF و کشت جنین: IVF براساس روش Kikuchi و همکاران (14) با کمی تغییر انجام شد. اسپرم‌های تهیه شده از خوک که براساس روش Yuge و همکاران (15) منجمد شده بود، ذوب و به مدت 15 دقیقه در محیط کشت 199-TCM حاوی املاحEarle's (Gibco, NY, USA) با 8/7=pH انکوبه شد. سپس l10 از اسپرم‌‌های فوق به l90 از محیط کشت لقاح حاوی mM 90 کلرید سدیم، mM 12 کلریدپتاسیم، mM 25 بیکربنات سدیم، mM 5/0 سولفات سدیم، mM 5/0 سولفات منیزیم، mM 5/0 فسفات دی‌هیدروسدیم، mM 10 لاکتات‌ سدیم، mg/ml 3 آلبومین سرم گاوی، mM5 کافئین و mg/ml 50 جنتامایسین (تمام مواد از شرکت Sigma آلمان تهیه شده است.) قرار گرفتند. غلظت نهایی اسپرم در حدود /ml 106×1 تنظیم شد. اووسیتها همراه با اسپرمها به مدت 5 ساعت در انکوباتور قرار گرفتند.سپس سلول‌های کومولوس و اسپرم‌های متصل به اووسیت‌های لقاح یافته به صورت مکانیکی با چند بار پیپت کردن جدا و تخمک‌های لقاح یافته به محیط کشت انتقال داده شدند. زایگوت‌های فرضی در محیط کشت NCSU-37 حاوی mg/ml 4 BSA، mM 17/0 پیروات سدیم (Sigma, Germany)، mM 7/2 لاکتات سدیم و g/ml50 جنتامایسین کشت داده شدند. 72 ساعت پس از لقاح، تمام جنین‌های تقسیم یافته به محیط کشت تازهNCSU-37 حاوی mg/ml 4 BSA، mM 55/5 D- گلوکز (Sigma, Germany) و g/ml 50 جنتامایسین منتقل شدند. جنین‌های تقسیم شده به مدت 4 روز تا مرحلة بلاستوسیست کشت داده شدند. بلاستوسیست‌های با مورفولو‍ژی طبیعی در روز 7-6 پس از لقاح انتخاب شدند، به منظور اجتناب از سوگیری در نمونه‌برداری، جنین‌های با اندازه مساوی انتخاب و به طور تصادفی در گروه‌های مورد مطالعه قرار گرفتند.

قرار دادن جنینها در معرض ضدیخ: به منظور بررسی آسیب وارده به بلاستوسیست در طی قرارگرفتن جنینها در معرض ضدیخ، بلاستوسیستها در محلول‌های 10% ضدیخ اتیلن گلیکول (Wako, Japan) ، 1و2 پروپاندیول (Wako, Japan) و گلیسرول(Wako, Japan) در یک روش 3 مرحله‌ای در درجه حرارت اتاق (°C25-23) قرار گرفتند. به طوریکه در ابتدا به مدت 5 دقیقه در محلول ضدیخ 3/3% و سپس به مدت 5 دقیقه در محلول ضدیخ 6/6% و در نهایت به مدت 1 ساعت در محلول ضدیخ 10% در درجه حرارت اتاق و در تاریکی قرار گرفتند. حلال مورد استفاده برای همه ضدیخها، PBS Gibco, NY, USA)) بود که به آن 3/0% BSAاضافه شد. بعد از قرار گرفتن بلاستوسیستها در غلظت نهایی از هر نوع ضدیخ، ضدیخها مجدداً در یک روش 3 مرحله‌ای از بلاستوسیستها خارج شدند. برای اینکار در ابتدا به مدت 5 دقیقه در محلول ضدیخ 6/6% و سپس به مدت 5 دقیقه در محلول ضدیخ 3/3% و در نهایت در محلول PBS بدون ضدیخ در درجه حرارت اتاق قرار گرفتند. در زمانی که بلاستوسیست‌های گروه تجربی در معرض محلول‌های افزایشی، تعادلی و کاهشی ضدیخ قرار می‌گرفتند، بلاستوسیست‌های گروه کنترل فقط در محلول PBS قرار گرفتند. بعد از خارج شدن ضدیخ، جنینها در محیط کشت NCSU-37 حاوی mg/ml 4 BSA، mM 55/5 D- گلوکز و g/ml50 جنتامایسین تحت روغن معدنی به مدت 24 ساعت کشت داده شدند. پس از 24 ساعت کشت، شواهد مورفولوژی زنده ماندن بلاستوسیستها، براساس تشکیل حفره بلاستوسل توسط استریومیکروسکوپی با بزرگنمایی 40 ارزیابی گردید. به منظور بررسی آپوپتوزیز تمام بلاستوسیست‌های دارا یا فاقد حفره بلاستوسل بعد از ارزیابی مورفولوژیک با تکنیک TUNEL مورد بررسی قرار گرفتند.

رنگ آمیزی TUNEL وPI : رنگ‌‌میزی TUNEL و PI برای بررسی شکست DNA در بلاستوسیستها انجام شد (22). بدین ترتیب که ابتدا بلاستوسیستها، پس از شستشو با محلول دالبکو بافر فسفات حاوی 3/0% پلی‌وینیل الکل (mg/ml 3 PBS/PVA;) در محلول پارافرمالدئید 37% (wako, Japan) در PBS در طول شب در درجه حرارت °C4 فیکس شدند. به منظور افزایش نفوذپذیری پرده شفاف بعد از شستشو بلاستوسیستها با PBS/PVA، به مدت 40 دقیقه در محلول 1/0% تریتون X–100 (Sigma, Germany) قرار داده شدند. پس از شسشوی مجدد با PBS/PVA براساس دستورالعمل شرکت سازنده در محلول TUNEL (Boehringer, Mannheim, wako, Japan) به مدت یک ساعت در حرارت °C 37 آنکوبه گردیدند. برای نمونه کنترل منفی و به منظور اطمینان از عدم نشانه‌گذاری بدون آنزیم، تعدادی بلاستوسیست فقط در محلول فلوئورسنت و برای نمونه کنترل مثبت، تعدادی از بلاستوسیستها قبل از آنکوباسیون در محلول TUNEL، به مدت یک ساعت در g/ml50 محلول (Sigma, Germany) DNase I آنکوبه شدند. به منظور نشانه‌گذاری همه هسته‌ها پس از آنکوبه کردن بلاستوسیستها به مدت یک ساعت در محلول mg/ml 50 (Sigma, Germany) RNAse Aبلاستوسیستها با g/ml50 محلول PI (Sigma, Germany) به مدت 20 دقیقه، رنگ‌آمیزی زمینه‌ای گردید. پس از شستشو در محلول PBS/PVA بلاستوسیستها با فشار کم لامل در یک قطره 20 میکرولیتری محلول antibleaching (Oregon, USA) بر روی لام قرار گرفت و لامها در زیر میکروسکوپ فلوئوروسنت مورد بررسی قرار گرفتند.

روشهای آماری: نسبت هسته‌های آپوپتوزی با شمارش سلول‌های TUNEL مثبت به کل هسته‌های بلاستو-سیست (هسته‌های PI مثبت) در همان بلاستوسیست به عنوان شاخص میزان شکست DNA محاسبه گردید. با توجه به محدودیت داده‌های خام حاصل، ابتدا از تبدیل Arcsine استفاده نموده و تمامی آنالیزها بر روی داده‌های تبدیل شده صورت گرفت. داده‌ها با آنالیز واریانس و آزمون تعقیبی فیشر با استفاده از برنامه Statview مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تفاوت‌های در سطح 05/0 و کمتر از آن معنی‌دار تلقی گردید.

نتایج

براساس یافته‌های این مطالعه بلاستوسیست‌های خوک از گروه کنترل دارای پرده شفاف سالم و دست نخورده بوده و بلاستومرها کاملاً فضای داخل پرده شفاف را اشغال کرده‌اند (شکل 1) در حالیکه در گروه تجربی، بعضی از بلاستوسیستها چروکیده بوده و پس از 24 ساعت کشـت نتـوانستند مجـدداً حفره بلاستوسل اولیه خود را پیدا کنند (شکل2). تعداد 197 بلاستوسیست در روز 6 و7 بعد از IVF به منظور ارزیابی میزان شاخص شکست DNA جنین‌های خوک در معرض ضدیخ‌های مختلف قرار گرفتند. همانطوریکه در جدول 1 دیده می‌شود، وقتی هسته‌های با DNA دارای شکست و تعداد کل بلاستومرها در بلاستوسیستها بعد از قرار گرفتن در ضدیخ‌های مختلف و 24 ساعت کشت متعاقب آن با تکنیک TUNEL مورد بررسی قرار گرفتند، تفاوت معنی‌داری در تعداد کل بلاستومرها در بلاستوسیستها در بین گروه‌های مختلف مشاهده نشد (2/1±4/34، 4/8±4/36، 4/8±4/36، 4/8±6/38)؛ ولی بدون توجه به نوع ضد یخ، شاخص شکست DNA در بلاستو-سیست‌هایی که در معرض ضدیخ‌های مختلف قرار گرفته بودند، به طور معنی‌داری (05/0p<) از بلاستو-سیست‌های گروه کنترل بیشتر بود. در ضمن، میزان شاخص شکست DNA در بلاستوسیست‌هایی که دارای مورفولوژی طبیعی بودند- یعنی پس از 24 ساعت کشت توانستند مجدداً حفره بلاستوسل اولیه خود را ایجاد کنند- نسبت به بلاستوسیست‌های فاقد بلاستوسل و چروکیده، بدون توجه به نوع ضدیخ کمتر بود (جدول1).

بحث

آپوپتوزیز یک مکانیسم مرگ سلولی آندوژن است که برای تکامل طبیعی و هموستاز بافتی لازم و ضروری است؛ ولی عمدتاً در طی کشت جنین در خارج از رحم به دلیل شرایط نامناسب اتفاق می‌افتد (17،16). روند آپوپتوزیز در پاسخ به انواع متفاوتی از محرک‌های غیرفیزیولوژیک نظیر حرارت، سموم، استرس‌های اکسیداتیو و پرتوهای آسیب رسان نیز فعال می‌شود (19،18). فشار اسموتیک نیز ممکن است به صورت هیدراتاسیون و دهیدراتاسیون، در طول مواجهه جنین با مواد ضدیخ باعث آسیب به جنین شوند (22-20). لذا در مطالعه حاضر به منظور کاهش فشار اسمزی، جنینها در طی 3 مرحله با افزایش غلظت ضدیخها در درجه حرارت اتاق در معرض این مواد قرار گرفتند؛ ولی با این وجود میزان زنده ماندن بلاستوسیست‌های خوک کاهش یافت. میزان شاخص هسته‌های با شکست DNA در بلاستوسیست‌هایی که در معرض ضدیخ‌های مختلف قرار گرفتند و به مدت 24 ساعت کشت داده شدند، بدون توجه به نوع ضدیخ به طور معنی‌داری (05/0p<) بیشتر از بلاستوسیست‌های گروه کنترل بود. در مطالعه دیگری که توسط نگارنده و همکاران انحام شد، اثرات انجماد شیشه‌ای، بر میزان آپوپتوزیز در بلاستوسیست موش مورد مطالعه قرار گرفت و به طور مشابهی نشان داده شد که بلاستوسیست‌های موش که به طریق شستشوی شاخ رحم به وسیله محیط کشت به دست آمده بودند پس از انجماد شیشه‌ای و ذوب، میزان شکست DNA در آنها (28/0±08/4) نسبت به گروه کنترل (22/0±93/4) به طور معنی‌داری بیشتر بود (13). تفاوت در میانگین شاخص آپوپتوزیز در تجربه قبلی نسبت به تجربه حاضر می‌تواند به دلیل تفاوت در نوع حیوان مورد تجربه، تفاوت در مدت زمان قرار گرفتن در ماده ضدیخ (30 دقیقه در مقابل 5 دقیقه) و بالاخره کیفیت بلاستوسیست باشد که در تجربه حاضر بلاستوسیست به روش In vitro تولید شده و براساس گزارش محققین، کیفیت بلاستوسیست‌های تولید شده به روش In vitro به دلیل اثرات زیانبار محیط کشت روی جنین و فقدان ترشحات پاراکرینی مترشحه از لوله‌های رحمی، پایین‌تر از کیفیت بلاستوسیست‌های تولید شده به روش In vivo بوده و بنابراین میزان شاخص آپوپتوزیز در بلاستو-سیست‌های تولید شده به روش In vitro بیشتر می‌باشد (23). میزان شاخص هسته‌های با شکست DNA در گروه EG نسبت به گروه‌های دیگر کمتر بود و این نشان‌ می‌دهد که EG کمترین میزان سمیت را بر روی جنینها دارد. به طور مشابهی Kasai و همکاران پس از قرار دادن جنین‌های مرحله مورولای موش در محلول‌های 30% ضدیخ در PBS (v/v)، و بررسی میزان زنده ماندن جنینها با ارزیابی پتانسیل تکامل آنها به بلاستوسیست در محیط کشت، نشان دادند که EG کمترین میزان سمیت را دارد و GLY وPD از نظر میزان سمیت بعد از آن قرار می‌گیرند؛ اگرچه محققین فوق ارتباط بین ضدیخ و شکست DNA را نشان ندادند (24). با این حال، تفاوت معنی‌داری در شاخص هسته‌های با شکست DNA در بین بلاستوسیست‌های در معرض ضدیخ‌های مختلف وجود ندارد.

یافته‌های مطالعة حاضر نشان می‌دهد که مواجهه جنین‌های خوک با ضدیخ‌های مختلف، منجر به مسمومیت شیمیایی جنین‌های خوک شده و تعداد هسته‌های با شکست DNA را بدون توجه به نوع ضدیخ افزایش می‌دهد. در ضمن مطالعه حاضر نشان داد که شاخص هسته‌های با شکست DNA در ارتباط با مورفولوژی جنینها بعد از کشت به صورت In vitro می‌باشد؛ به طوریکه اکثر سلول‌های با هسته دارای شکست DNA در بلاستوسیست‌هایی بود که پس از مواجهه با ضدیخ و کشت مجدد نتوانستند حفره بلاستوسل اولیه خود را پیدا کنند و یا به عبارت دیگر میزان شکست DNA در جنین‌های فاقد بلاستوسل که در این مطالعه به عنوان جنین‌های مرده تلقی شدند نسبت به جنین‌های دارای بلاستوسل بیشتر است. Jurisicova معتقد است وقتی مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی به یک آستانه معینی برسد که برای تکامل و تکوین جنین مضر باشد منجر به مرگ جنین‌های آسیب دیده می‌شود (19). بنابراین نتایج نشان می‌دهد پس از 24 ساعت در میزان آسیب به DNA در جنینها که تشکیل مجدد بلاستوسیست‌های با حفره بلاستوسل مرتبط باشد.

نتیجه گیری

یافته‌های مطالعة حاضر نشان می‌دهد که قرارگرفتن بلاستوسیست‌های خوک در معرض ضدیخ‌های مختلف، منجر به افزایش تعداد هسته‌های با شکست DNA می‌شود. در ضمن شاخص هسته‌های با شکست DNA در ارتباط با مورفولوژی جنینها بعد از کشت به صورت In vitro بود.

مطالعه حاضر نشان داد که مرگ سلولی از نوع آپوپتوزیز می‌تواند به عنوان یکی از مکانیسم‌های مرگ بلاستومرها در بلاستوسیست پس از مواجهه با ضدیخ مطرح باشد و باعث کاهش میزان زنده ماندن جنین، لانه‌گزینی و تولد نوزاد زنده شود. به‌نظر می‌رسد ادامه تحقیقات در جهت پیدا کردن مکانیسم‌های آسیب به جنین، می‌تواند موجب موفقیت‌هایی در انجماد درART، نه تنها در زمینه حیوانی بلکه در انسان گردد.

تشکر و قدردانی

از آقای پروفسور سوزوکی استاد گروه تولیدمثل دانشگاه یاماگوچی ژاپن که جهت انجام این طرح نهایت همکاری را داشتند و از اداره بازرسی گوشت شهر کیتاکیوشو ژاپن بخاطر در اختیار گذاشتن تخمدان‌های خوک تقدیر و تشکر می‌شود.

Hardy K. Cell death in the mammalian blastocyst. Mol Hum Reprod.1997;3:919-925.
Jurisicova A., Rogers I., Fasciani A., Casper R.F., Varmuza S. Effect of maternal age and conditions of fertilization on programmed cell death during murine preimplantation embryo development. Mol Hum Reprod.1998;4:139-145.
Levy R.R., Cordonier H., Czyba J.C., Guerin J.F. Apoptosis in preimplantation mammalian embryo and genetics. Ital J Anat Embryol.2001;106:101-108.
Hochachka P.W. Defense strategies against hypoxia and hypothermia. Science.1986;231:234-241.
Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 1992;119(3):493-501.
Yamadori I., Yoshino T., Kondo E., Cao L., Akagi T., Matsuo Y., Minowada J. Comparison of two methods of staining apoptotic cells of leukemia cell lines. Terminal deoxynucleotidyl transferase and DNA polymerase I reactions. J Histochem Cytochem. 1998; 46(1):85-90.
Neuber E., Luetjens C.M., Chan A.W., Schatten G.P. Analysis of DNA fragmentation of in vitro cultured bovine blastocysts using TUNEL. Theriogenology. 2002;57(9):2193-202.
Pampfer S., Vanderheyden I., McCracken J.E., Vesela J., De Hertogh R. Increased cell death in rat blasto-cysts exposed to maternal diabetes in utero and to high glucose or tumor necrosis factor-alpha in vitro. Development.1997;124(23):4827-36.
Emiliani S., Van den Bergh M., Vannin A.S., Bira-mane J., Englert Y. Comparison of ethylene glycol, 1, 2- propanediol and glycerol for cryopreservation of slow-cooled mouse zygotes, 4-cell embryos and blas-tocysts. Hum Reprod.2000;15(4):905-10.
Fahning M.L., Garcia M.A. Status of cryopreservation of embryos from domestic animals. Cryobiology.1992; 29:1-18.
Friedler S., Giudice L.C., Lamb E.J. Cryopreserva-tion of embryos and ova. Fertil Steril.1988;49:743-64.
Marquez-Alvarado Y.C., Galina C.S., Castilla B., Leon H., Moreno-Mendoza N. Evidence of damage in cryopreserved and fresh bovine embryos using the Tunel technique. Reprod Domest Anim.2004;39(3): 141-5.
رجایی فرزاد، سلیمانی‌راد جعفر، نیک‌نفس بهروز، غفاری معرفت. اثرات انجماد شیشه‌ای بر میزان آپوپتوز در مرحله بلاستوسیست. فصلنامه پزشکی باروری و ناباروری، شماره اول، سال پنجم، زمستان 1382، صفحات: 22-14.
Kikuchi K., Kashiwazaki N., Noguchi J., Shimada A., Takahashi R., et al. Developmental competence after transfer to recipients of porcine oocytes Matured, fertilized, and cultured in vitro. Biol Reprod.1999;60: 336-40.
Yuge M., Otoi T., Nii M., Murakami M., Karja N.W., et al. Effects of cooling ovaries before oocyte aspira- tion on meiotic competence of porcine oocytes and of exposing in vitro matured oocytes to ambient tempera-ture on in vitro fertilization and development of the oocytes. Cryobiology.2003;47(2):102-8.
Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol.1980;68:251-306.
Leese H.J., Donnay I., Thompson J.G. Human assis-ted conception: a cautionary tale. Lessons from domes-tic animals. Hum Reprod.1998;4(Suppl):184-202.
Wyllie A.H. Apoptosis: an overview. Br Med Bull. 1997;53:451-465.
Jurisicova A., Varmuza S., Casper R.F. Programmed cell death and human embryo fragmentation. Mol Hum Reprod.1996;2:93-98.
Men H., Monson R.L., Parrish J.J., Rutledge J.J. Detection of DNA damage in bovine metaphase II oocytes resulting from cryopreservation. Mol Reprod Dev.2003;64:245-250.
Oda K., Gibbons W.E., Leibo S.P. Osmotic shock of fertilized mouse ova. J Reprod Fertil.1992;95:737-747.
Pedro P.B., Zhu S.E., Makino N., Sakurai T., Edashige K., Kasai M. Effects of hypotonic stress on the survival of mouse oocytes and embryos at various stages. Cryobiology.1997;35:150-158.
Brison D.R., Schultz R.M. Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha. Biol Reprod.1997;56:1088-1096.
Kasai M. Simple and efficient methods for vitrifica-tion of mammalian embryos. Anim Reprod Sci.1996; 42:67-75.