Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

The effects of Matrigel on the developmental processes of mouse blastocysts

Authors
Mariya Zahiri 1
Maerefat Ghaffari 2
Behrooz Niknafs 3
Mahnaz Heidari 4
1 Histology Department, Faculty of Medicine, Tabriz Medical Sciences University, Tabriz, Iran
2 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tabriz, Iran
3 Laboratory of Histology & Cellular Biology, Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran
4 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Culturing embryos on Matrigel™, is one of the most suitable methods for study-ing in vitro embryonic developments. As Matrigel has not been used extensively in different species for embryonic development studies, this study was undertaken to determine the effects of Matrigel on the developmental processes of mouse blastocysts. Materials & Methods: To a number of female NMRI mice, hMG and HCG injections were made for ovulatory stimulation and then they mated with males from the same strain. Later on, blastocysts were obtained and randomly divided into 2 groups: 150 case blastocysts and 134 control blastocysts. Blastocysts were cultured for 48 hours in M16 medium, supplemented with 4mg/ml of bovine serum albumin (BSA). Later, the blastocysts were compared with the blastocysts cultured in Matrigel plus the same medium. Developmental studies were carried out every 24 hours for 2 days. The data was analyzed by SPSS software and the results were tested by chi-squared. Results: After 24 hours, a significantly higher ratio of embryos reached the hatched blastocysts stage Ι in the case group (74%), compared with that of the control group (52.2%), (p < 0.05). At the same time the percentage of fragmented blastocysts in the control group was 11.9% which was significantly higher than the case group (2%), (p < 0.05). After 48 hours, 41% of blastocysts cultured in the control medium, developed to stage I, the value being significantly more than the blastocysts in the case group (p < 0.05). Moreover, after the same period of time (48 hours), the percentage of stage II hatched blastocysts in the case group (79%) was higher than the control groups (59%), (p < 0.05). Conclusion: Matrigel use in enriched culture media can increase development and growth of mouse blastocysts. It also seems that ultrastructural studies of cultured embryos or immunocyto-chemical studies from this regard would be beneficial in understanding the processes involved.
Keywords
Blastocyst
Culture media
Embryo Development
Laboratory mouse
Matrigel

زمینه و هدف

با نگاهی اجمالی بر روند حاملگی در میان زوجین نابارور مشاهده می‌شود، علی‌رغم این که تکنیک‌های کمک باروری آزمایشگاهی (ART) بخش قابل ملاحظه‌ای از مشکلات آنها را حل نموده است، ولی همچنان دارای مواردی از عدم موفقیت است، به این ترتیب که میزان موفقیت لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF) در حدود 70-60% می‌باشد، در حالیکه میزان موفقیت حاملگی که به مفهوم لانه‌گزینی موفق جنین می‌باشد، در حدود 30-20% در هر انتقال گزارش شده است (1). این تفاوت می‌تواند مربوط به وجود اختلال در مراحل حوالی لانه‌گزینی باشد. بدون شک عوامل مختلفی در بروز این اختلالات دخیل می‌باشند و رفع آنها نیازمند انجام بررسی‌های بیشتر در زمینه ارتقاء تکنیک‌های کمک باروری آزمایشگاهی می‌باشد. موفقیت در این تکنیکها به عواملی از جمله شرایط محیط کشت وابسته است. در صورت عدم وجود این شرایط، کیفیت جنینها تحت تأثیر قرار گرفته و در نتیجه باعث از دست رفتن قابلیت حیات آنها می‌شود (2). همچنین نتایج مطالعات حاکی از آن است که شرایط و زمان انتقال جنین به داخل رحم نیز از اهمیت خاصی برخوردار می‌باشد؛ به طوری که انتقال جنینها در مراحل تکاملی پیشرفته‌تر (مورولا و یا بلاستوسیست)، به جهت هماهنگی بیشتر با تکامل اندومتر، منجر به افزایش شانس لانه‌گزینی می‌شود. بنابراین فراهم آوردن محیطی مناسب برای حفظ جنین‌های حاصل از IVF، به مدت طولانی‌تر مورد نیاز می‌باشد (3).

در تحقیقات متعدد، از محیط‌های مختلف تأمین کننده تغذیه و انرژی لازم برای بهبود روند تکامل جنینها و بررسی مراحل مختلف لانه‌گزینی استفاده شده است؛ علی‌رغم وجود موفقیت‌های نسبی، این تحقیقات دارای محدودیت‌هایی هم بوده‌اند (4). محققان براساس تئوری‌های مختلف بر آن بوده‌اند تا کشت جنینها به صورت هم‌کشتی با سلول‌های اپی‌تلیالی اندومتر (5) و یا بافت لوله رحم (6) و یا کشت بر روی ترکیبات ماتریکس خارج سلولی (7) را نیز تجربه نمایند؛ چرا که در محیط داخل بدن میانکنش‌ موجود بین جنین در حال تکامل، با این ترکیبات از اهمیت فراوانی برخوردار است (8). این امکانات به محققین اجازه می‌دهند تا با بررسی عوامل متفاوت، فاکتورهای دخیل در افزایش میزان تکامل جنین را شناسایی نموده و در نهایت با لحاظ نمودن آنها میزان موفقیت لانه‌گزینی و در نتیجه بارداری را افزایش دهند (5). از جمله این سیستم‌های کشت می‌توان از کشت بر روی ماتریژل نام برد. ماتریژل مخلوطی از اجزاء غشاء پایه می‌باشد که شامل لامینین ، کلاژن نوع چهار، پروتئوگلیکان، هپاران سولفات ، انتاکتین ، نیدوژن و همچنین فاکتور رشد و فاکتور فعال‌کننده پلاسمینوژن بافتی می‌باشد، که از نوعی تومور بافت همبند موش به نام ESH استخراج شده است (9).

تاکنون مطالعات مختلفی در مورد اثر ماتریژل بر تکامل جنین‌های جمع‌آوری شده از لوله فالوپ و همچنین جنین‌های حاصل از IVFانجام شده است، که نتایج متفاوتی از آنها حاصل شده است. برخی مطالعات حاکی از آن است که ماتریژل به عنوان محیط مناسبی برای پیشبرد رشد و تکامل جنینها می‌باشد (9). مطالعات معدودی نیز بر بی‌اثر بودن و حتی بر اثر مهاری آن بر رشد و تکامل جنینها اذعان دارند (10). هدف از این مطالعه بررسی اثر ماتریژل بر روی تکامل جنین‌های جمع‌آوری شده موش، در محیط داخل آزمایشگاهی می‌باشد.

روش بررسی

حیوانات و دریافت جنین: ابتدا موش‌های نژاد NMRI با سن 6 تا 8 هفته از حیوانخانه مرکزی رازی خریداری و به مدت یک هفته در حیوانخانه پژوهشکده ابن‌سینا در درجه حرارت  C25 و در شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی بدون محدودیت غذائی نگهداری شدند. سپس به هر یک از موشها IU5/7 hMG (Merional, IBSA, Switzerland) و پس از 48 ساعت IU5/7 hCG (Oregon,Holand) به طریق داخل صفاقی تزریق شد. پس از آن موش‌های ماده به مدت یک شب در قفس موش‌های نر قرار داده شدند و صبح روز بعد از نظر تشکیل پلاک واژینال مورد بررسی قرار گرفتند. موش‌های پلاک مثبت، حامله تلقی شدند و در حدود 110 ساعت بعد از تزریقhCG به روش جابجایی مهره‌های گردنی، دچار قطع نخاع شده و بعد از باز نمودن شکم آنها، بلاستوسیست‌های کامل با استفاده از محیط M16 که بر اساس پروتکل Edashing تهیه شده بود، به روش فلاش کردن از شاخ رحم، جمع‌آوری شدند. این محیط کشت حاوی کلرور سدیم، کلرور پتاسیم، فسفات پتاسیم، سولفات منیزیوم، سدیم لاکتات، گلوکز، آنتی بیوتیک و بیکربنات سدیم می‌باشد (11). معیار انتخاب بلاستوسیست‌های کامل روش درجه‌بندی Schoolcraft‌ و Gardner‌ بود (2).

در این سیستم درجه‌بندی، بلاستوسیست کامل به بلاستوسیستی اطلاق می‌شود که بلاستوسل کاملا محوطه جنین را اشغال نماید.

بلاستوسیست‌های حاصل به دو گروه تقسیم شدند. 134 عدد بلاستوسیست به عنوان گروه کنترل به مدت 48 ساعت در محیط کشت M16 غنی شده با mg/ml BSA4، به عنوان محیط‌ مناسب برای تکامل جنین در مرحله بعد از تشکیل بلاستوسیست، کشت‌داده شدند (12) و 150 عدد بلاستوسیست گروه آزمایش نیز بلافاصله بعد از فلاش نمودن، بر روی ماتریژل (Biomedical, USA) منتقل و توسط محیط کشت غنی شده مشابه گروه کنترل، حمایت شد.

آماده‌سازی محیط مورد استفاده برای گروه کنترل: روز قبـل از دریافت بلاستوسیست بـرای غـنی‌نمـودن محیـط، مقـدار منـاسبـی از محیـط کشت M16را در یـک فـالـکون ریخـته و mg/ml4 پودرBSA (Sigma, USA)، به آن افزوده شد. در یک پتری استریل مورد استفاده برای IVF، قطره‌های 50 میکرولیتری به تعداد 5-4 قطره، گذاشته شد و روی آن با روغن معدنی استریل (Sigma,USA) پوشانده شد. بسته به تعداد موشها و تعداد احتمالی بلاستوسیستها، تعداد ظروف کشت پتری آماده شده متغیر بود. سپس این ظروف به انکوباتور  C37 و CO2 5% منتقل شدند. از این ظروف برای انتقال و شستشوی بلاستوسیستها و همچنین نگهداری گروه کنترل استفاده شد.

انتقال بلاستوسیستها روی ماتریژل: آماده‌سازی بستر مناسب برای گروه مورد، براساس پروتکل‌های توصیه شده توسط شرکت BD انجام شد، که به شرح زیر می‌باشد: ماتریکس خارج سلولی یا ماتریژل که از قبل در لوله‌های با حجم ml1 جدا شده و در فریزر  C20- نگهداری می‌شد را از فریزر خارج نموده و فرصت داده شد در دمای اتاق از حالت منجمد خارج شود.

از طرف دیگر میلی سل نوع CM با قطر منافذ m4/0 (Millipore,USA) در داخل پلیت کشت 24 حفره‌ای (BD,USA) گذاشته شد و حدود l200 از ماتریکس خارج سلولی (ماتریژل) درون میلی سل ریخته شد.

از آنجایی که ماتریژل در دمای اتاق و همچنین در دمای  C37 به سرعت منعقد می‌شود، در صورتی که انجام این مراحل به کندی انجام پذیرد، احتمال ژله‌ای شدن ماتریژل وجود دارد. همچنین در کلیه مراحل انجام کار ماتریژل بایستی به آرامی جابه‌جا شود، زیرا به علت دارابودن مقادیر بالای پروتئین به سرعت کف می‌کند و ایجاد این کف و حباب اضافی، باعث پدید آمدن مشکل در انجام مراحل بعدی می‌شود. در مرحله بعد پلیت 24 حفره ای به مدت 2 الـی 3 ساعت به انکوباتور  C37 با CO2 5% منتقل شد تا بستر مناسب برای اتصال بلاستوسیستها ایجاد شود. بعد از 2 الی 3 ساعت، پلیت از انکوباتور خارج گردیده و به روی صفحه گرم دارای دمای متناسب با بلاستوسیستها قرار داده شد.

با پیپت دهانی تحت هدایت استریو میکروسکوپ، بلاستوسیست‌های کامل جمع‌آوری و با حداقل محیط، روی ماتریژل قرار داده شد. در ادامه کار به پلیت روی صفحه گرم حدود l200 محیط مغذی روی ماتریژل و همچنین به میزان ml1 در فضای بین میلی‌سل و دیواره پلیت اضافه گردید. به طور معمول در هر میلی‌سل حدود 10 عدد بلاستوسیست انتقال داده شد تا ارزیابی نهایی راحت‌تر انجام گیرد. سپس پلیت به انکوباتور  C37 و CO2 5% منتقل شد.

رشد و تکامل جنینها در گروه‌‌های مورد و کنترل بعد از 24 و 48 ساعت از کشت، زیر میکروسکوپ نوری فاز معکوس (Olympus, Japan) مورد بررسی و توسط دوربین دیژیتالی متصل به آن (Olympus, Japan)، مورد عکس‌برداری قرار گرفت.

روش‌های آماری: تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSSانجام شد. به این صورت که از آزمون 2 برای مقایسه نسبت روند تکامل دو گروه آزمایش و کنترل، پس از طی 24و 48 ساعت استفاده شد.

نتایج

بررسی مورفولوژی جنینها در دو گروه کنترل و آزمایش: بررسی جنینها با میکروسکوپ فاز معکوس نشان داد که مورفولوژی بلاستوسیست‌های متسع در گروه‌های کنترل و آزمایش مشابه هم می‌باشند. به این ترتیب که حفره بلاستوسل کاملاً متسع می‌باشد و زونا پلوسیدا به صورت یک لایه نازک اطراف جنین را احاطه می‌نماید. همچنین سلول‌های تروفوبلاست به صورت دوکی شکل دیده می‌شوند (شکل 1).

مورفولوژی بلاستوسیست‌های فراگمنته در هر دو گروه به صورت بلاستومرهای هیپرپیگمانته با سایزهای نامساوی می‌باشد. در واقع جنینها به صورت توده‌های نامنظم و گاه با وجود ساختارهای واکوئلی دیده می‌شوند (شکل 2).

شکل 3، نشان‌دهندة بلاستوسیست در حال جوانه‌زدن می‌باشد که مورفولوژی این مرحله نیز در گروه کنترل و آزمایش یکسان است. به‌طوری که پوشش زونا در حال از بین رفتن و بلاستومرها در حال خروج از آن دیده می‌شوند. قابل توجه این که جوانه‌زدن بلاستو-سیست، فرایندی تدریجی است، به طوری که در زمان‌های متفاوت و در جنینها با قابلیت‌های متفاوت، مراحل بینابینی نیز دیده می‌شود که به جهت هماهنگی بیشتر در جهت توصیف مراحل، از آنها صرف نظر شده است.

همانطور که در شکل 4 مشاهده می‌شود، بلاستو-سیست‌های جوانه زده مرحله اول در گروه کنترل و آزمایش، به صورت بلاستوسیست‌هایی می‌باشد که کاملاً از پوشش زونا پلوسیدای خود خارج شده‌اند و توده سلولی داخلی و خارجی و حفره بلاستوسل به خوبی قابل رؤیت می‌باشد.

مورفولوژی بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله دوم در دو گروه مورد مطالعه، متفاوت بود. به این ترتیب که در جنین‌های گروه کنترل، توده سلـولی داخلی و تروفواکتودرم قابل رؤیت بوده، حفره بلاستوسل کوچک و همچنین کمی پراکندگی سلولی اطراف توده جنینی شناسایی می‌شود (شکل 5) و در گروه آزمایش، سلول‌های توده سلولی داخلی، به خوبی قابل رؤیت نبوده، ولی سلول‌های تروفواکتودرم قابل مشاهده می‌باشند (شکل 6).

لازم به ذکر است که اطلاق لفظ بلاستوسیست‌های متسع، در حال جوانه‌زدن و همچنین بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله اول که همان بلاستوسیست‌های جوانه‌زده کامل می‌باشد براساس سیستم درجه‌بندی Gardner و Schoolcraft می‌باشد(2).

میزان رشد و تکامل جنینها در گروه کنترل: همانطور کـه در جدول 1 مشاهده می‌شود، در طی 24 ساعت نخست، در گروه کنترل، 2/8% بلاستوسیستها در مرحله بلاستوسیست متسع، 6/27% در مرحله بلاستوسیست در حال جوانه‌زدن و 2/52% به صورت بلاستوسیست کاملاً جوانه‌زده مرحله اول بودند. همچنین 9/11% بلاستوسیستها، فراگمنته بودند.

طی 48 ساعت بعد از کشت، در این گروه 41% آنها به صورت بلاستوسیست‌ جوانه زدة مرحلة اول و 59% به صورت بـلاستـوسـیـست جوانــه زده مرحله دوم بودند.

میزان رشد و تکامل جنینها در گروه آزمایش: در طی 24 ساعت نخست تعداد بلاستوسیست‌های متسع 3/1%، بلاستوسیست‌های در حال جوانه‌زدن 7/22%، بلاستوسیت‌های جوانه‌زده مرحله اول 74% و میزان بلاستوسیست‌های فراگمنته 2% بود.

بعد از 48 ساعت، تعداد بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله اول 23% و تعداد بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله دوم 74% بود.

براساس این نتایج پس از گذشت 24 ساعت از کشت، درصد بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله اول، در گروه آزمایش نسبت به گروه کنترل، به‌طور معنی‌داری بالاتر بود (05/0p<)، از طرفی تنها 2% بلاستوسیستها در گروه آزمایش فراگمنته شدند. براساس جدول 2، پس از گذشت 48 ساعت از کشت، در گروه آزمایش، بلاستوسیست‌هایی که روند تکاملی را تا مرحله بلاستوسیست جوانه‌زده مرحله دوم طی نمودند به طور معنی‌دار، نسبت به گروه کنترل بالاتر بود (05/0p<).

البته در 48 ساعت پس از کشت، تعداد بلاستوسیست‌های موجود در گروه کنترل که به مرحله بلاستوسیست جوانه‌زده مرحله اول رسیدند نسبــت بـه گـروه آزمـایش به طـور معنی‌داری بالاتر بود (05/0p<).

بحث

در مطالعه حاضر به منظور ایجاد شرایط مناسب و مشابه با ماتریکس خارج سلولی موجود در اندومتر رحم، از ماتریژل همراه با محیط‌های کشت مغذی برای رشد و تکامل جنین حوالی زمان لانه‌گزینی استفاده شد.

جهت انجام لانه‌گزینی موفق، انجام میانکنش میان بلاستوسیست و اندومتر رحم (به خصوص ترکیبات ماتریکس خارج سلولی آن) از اهمیت فراوانی برخوردار است. جهت انجام این میانکنشها هر دو جزء بلاستو-سیست و اندومتر رحم باید آمادگی لازم را کسب نمایند (13) که از جمله آنها می‌توان به بیان اینتگرین‌های خاص (14) و یا ظهور گیرنده‌های مشخص برای فاکتورهای رشد مترشحه از بلاستوسیست و یا ماتریکس خارج سلولی (15)، اشاره کرد.

در این مطالعه برای دستیابی به حالت فیزیولوژیک و مشابه با داخل بدن و همچنین به دلیل حفظ حریم قانونی در استفاده از نمونه‌های انسانی، از بلاستوسیست‌های موش که از نظر مراحل تکاملی قرابت نزدیکی با جنین انسان دارند، استفاده گردید و نشان داده شد که کشت جنین موش در بستر حاوی ماتریژل همراه با محیط مغذی موجب بهبود روند تکاملی جنین می‌شود. به این ترتیب که تعداد بیشتری از جنینها جوانه زده و مورفولوژی متکامل‌تری را ایجاد می‌نمایند.

این مطالعه نشان داد که میزان بلاستوسیست‌های در حال جوانه‌زدن و جوانه‌زده مرحله اول در گروه آزمایش به طور معنی‌داری بالاتر از گروه کنترل بود. همچنین میزان بلاستوسیست‌های فراگمنته در گروه آزمایش به طور معنی‌دار کمتر از گروه کنترل بود. این نتایج با یافته‌های Lazzaroni و همکاران (9) وDesai و همکاران (16) به ترتیب با استفاده از ماتریژل همراه با محیـط HTF همـراه با BSA 5/1% و ماتـریژل همـراه با PPP 5% مطابقت داشت.

به نظر می‌رسد در طی 24 ساعت نخست، اثر ماتریژل به طور عمده، پیشبرد روند تکامل جنینها به مرحله جوانه‌زدن می‌‌باشد، به طوری که فعالیت پروتئازی جنین اولیه که در جهت پاره نمودن لایه زونا پلوسیدا می‌باشد، از ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و سوبسترا متأثر می‌شود (16).

براساس نتایج این مطالعه پس از گذشت 48 ساعت از کشت، درصد بلاستوسیست‌های جوانه‌زده مرحله دوم در گـروه آزمایش، بیشتر از گروه کنترل بود. درحالیکه درصد بلاستوسیست‌های در حال جوانه‌زدن و جوانه‌زده مرحله اول، در گروه کنترل، بالاتر از گروه آزمایش بود. به نظر می‌رسد در گروه آزمایش، اکثر بلاستوسیستها، این مراحل را در ساعات قبل طی نموده‌ باشند.

در این مطالعه با پیشرفت جنینها و تبدیل آنها به بلاستوسیست جوانه‌زده مرحله دوم مورفولوژی جنینها در دو گروه کنترل و آزمایش با هم متفاوت بود.

به طوریکه در گروه آزمایش، سلول‌های توده سلولی داخلی، به خوبی قابل رؤیت نبوده، ولی سلول‌های تروفواکتودرم قابل مشاهده بودند و قطر جنین کاهش داشت. در گروه کنترل، توده سلـولی داخلی و تروفواکتودرم قابل رؤیت بود و با تکثیر خود، بلاستوسل را احاطه نموده و حجم آن را کوچکتر نموده بود.

نتایج این مرحله از تکامل جنینها از نظر مورفولوژی با یافته‌های مورفولوژی حاصل از بررسی Carverو همکاران (17) مطابقت دارد. آنها تغییرات بلاستو-سیست‌های جوانه‌زده انسانی را بر روی لایه‌ای از سلول‌های استرومایی اندومتر انسان همراه با محیط کشت DMEM بررسی نمودند. نتایج مورفولوژی مطالعة این محققان نشان داد که در محیط کشت، بلاستوسیستها، برای مدتی به صورت متسع باقی مانده و سپس به داخل لایه استرومایی نفوذ می‌کردند. به این ترتیب که بلاستوسیستها بعد از گذشت 10 الی 15 ساعت، به سرعت منقبض شده و توده سلولی داخلی در آنها قابل شناسایی نبوده و قطر بلاستوسیستها نیز کاهش دارد. همانطور که مشاهده می‌شود، در مطالعه Carver و همکاران، این تغییرات تکاملی در فاصله زمانی کوتاهتری نسبت به مطالعه حاضر ایجاد شده است که می‌تواند به دلیل تفاوت نوع کشت، نوع و مرحله تکاملی جنین‌های کشت داده شده و محیط مورد استفاده باشد.

از یافته‌های دیگر بررسی حاضر، وجود گستردگی‌های سلولی در حواشی جنینها در نمونه‌های کنترل، طی بررسی‌های انجام شده در طی 48 ساعت بود. در حالیکه حواشی جنینها در نمونه‌های مورد آزمایش فاقد این گستردگیها بودند. با استناد به نتایج تحقیقات Desai و همکاران، به نظر می‌رسد این گستردگی‌های سلولی، نتیجه تکثیر سلولی جنین باشد. که در نمونه کنترل به دلیل اینکه بستر جنینها از فضای کافی برخوردار نیست، سلول‌های حاصل از تکثیر مجبور به پراکنده شدن بر روی کف دیش می‌باشند ولی در نمونه آزمایش با توجه به نبود این پراکندگی‌های سلولی می‌توان اذعان داشت که سلول‌های حاصل از تکثیر در بستر ماتریژل نفوذ یافته‌اند (16). ‌در تأیید این یافتهCarver و همکاران در تحقیق مربوط به هم‌کنشی جنین انسان (که در فوق به آن اشاره گردید)، با بررسی‌های ایمونوهیستوشیمی از نظر وجود سیتوکراتین نشان دادند که بلاستو-سیستها در این مـرحله، شروع به تکثیر و نفوذ به لایه استرومایی می‌نمایند. البته در آن مطالعه، نتایج این هم‌کنشی با گروه کنترل مقایسه نشده بود (17).

از طرفی یافته‌های Armant و همکاران (18) نیز، نتایج بررسی مورفولوژیک مطالعة حاضر را مورد تأیید قرار می‌دهد. آنها فعالیت تهاجمی سلول‌های تروفوبلاست موش را در طی لانه‌گزینی در محیط داخل آزمایشگاه مورد بررسی قرار دادند. آنها برای این کار بلاستو-سیستها را روی ماتریکس خارج سلولی کشت دادند. منشاء ماتریکس خارج سلولی، اندومتریوم موشها با سن حاملگی 4 روز بوده است. بلاستوسیت‌های موش که روی این ماتریکس کشت داده شدند، در طی 3 روز به آن متصل شده و سلول‌های تروفوبلاستی شروع به مهاجرت در میان ماتریکس نمودند. در حالی که بلاستوسیت‌هایی که روی پلاستیک کشت داده شده بودند، این روند را نشان نمی‌دادند. به این ترتیب که سلول‌های تکثیری بلاستوسیست‌های کشت شده روی پلاستیک، نظم خود را از دست داده و به صورت پراکنده دیده می‌شدند، در حالیکه در گروهی که روی ماتریکس کشت داده شده بودند، ساختار کلی جنین و نظم آن حفظ شده بود.

البته علی‌رغم نتایجی که در فوق ذکر شد، برخی مطالعات، استفاده از ماتریژل را بر تکامل جنین بی‌تأثیر می‌دانند. در یک مطالعه از کشت جنین‌های موش در ماتریژل همراه با محیط HTF استفاده شد. نتایج، هیچ بهبودی را در روند تکامل جنینها در گروه آزمایش که حاوی ماتریژل بود نسبت به گروه کنترل که حاوی محیطHTF بود نشان نداد. در قسمت دیگری از همان مطالعه از محیطKSOM به جای HTFاستفاده شد. نتایج نشان داد که در گروه حاوی ماتریژل تکامل تخمک‌‌های لقاح یافته تا مرحله بلاستوسیست مهار شد (10).

البتـه دلیل وجـود ایـن تناقضـات در نتـایـج مطالعـات، می‌تواند به دنبال تفاوت در محیط کشت مورد استفاده همراه با ماتریژل (9) و گونه حیوانی مورد استفاده (10) باشد.

همچنانکه از نتایج مطالعه حاضر مشهود است، روند تکامل بلاستوسیست موش در مدل ماتریژل، از هماهنگی بیشتری برخوردار است و دارای درصد تکامل بالاتری نسبت به گروه کنترل می‌باشد. اثرات مثبت ماتریژل بر روی رشد جنین به خاطر ترکیب خاص آن می‌باشد. ماتریژل، ژلی حاصل از سارکومای موش به نام Engelbreth- Swarm- Holm می‌باشد که توموری غنی از پروتئین‌های ساختاری و فاکتورهای رشد می‌باشد که مشابه اجزاء ماتریکس اندومتریال است (9). بر اساس بررسی‌های مختلف، نشان داده شده است هر یک از اجزاء ماتریکس خارج سلولی قادر به بهبود وضعیت تکاملی جنین می‌باشد. از جمله ترکیبات موجود در ماتریژل که اثر آن به طور مجزاء مورد بررسی قرار گرفته است می‌توان به لامینین (19)، کلاژن نوع چهار، پروتئوگلیکان هپاران سولفات، انتاکتین، فیبرونکتین، نیدوژن، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (20) و فاکتورهای رشد اشاره نمود (17).

این اجزاء در محیط کشت، محیطی مشابه ماتریکس خارج سلولی رحم را پدید می‌آورند و احتمالا علاوه بر کمک به حفظ حیات جنین و تحریک رشد و تکامل آن، تمایز و بیان رسپتورهای غشایی و ترشح فاکتورهای رشد اختصاصی را نیز فراهم می‌نماید (9). البته از اثرات مثبت محیط کشت مورد استفاده نیز نمی‌توان چشم‌پوشی نمود، چرا که در این مطالعه بلاستو-سیست‌های کشت داده شده در قطره محیط کشت زیر روغن نیز مشمول روند تکامل با اندکی تأخیر نسبت به گروه آزمایش بودند. بنابراین ترکیبات محیط کشت مورد استفاده در این مطالعه که حاوی لاکتات (21)، گلوکز (22)، مکمل‌های سرمی، فسفات، آنتی‌بیوتیکها و بیکربنات (23) بودند نیز در بهبود تکامل جنین نقش دارند. در نتیجه بهبود تکامل جنینها در گروه آزمایش را می‌توان به اثر ترکیبی ماتریژل همراه با محیط مورد استفاده نسبت داد.

نتیجه‌گیری

در مجموع با توجه به نتایج حاصل از مطالعات می‌توان اینگونه نتیجه‌گیری نمود که استفاده از ماتریژل به عنوان بستری معادل ماتریکس خارج سلولی اندومتر، همراه با محیط کشت غنی شده می‌تواند منجر به بهبود روند تکاملی جنین گردد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از معاونت محترم پژوهش و فناوری جهاددانشگاهی جهت تأمین بخشی از اعتبار طرح

به شماره 21-696، همچنین از همکاران محترم پژوهشکده فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا جهت همکاری صمیمانه در اجرای این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.

  1. Ben-Rafael Z., Benadiva C.A., Ausmanas M., Barber B., Blasco L., Flickinger G.L., Masteroianni L. Dose of human menopausal gonadotropin influences the out-come of an invitro fertilization program. Fertil Steril. 1987;48:964.
  2. Kathy L., Sharpe T., Randall L.Z. Oocyte and pre- embryo classification. In the handbook of Assisted Reproduction Laboratory. Keel B.A., May J.V., De Jonge C.J. (Editors). 1st Edition, CRC Press, Florida. 2000;pp:188-193.
  3. de los Santos M.J., Mercader A., Galan A., Albert C., Romero J.L., Pellicer A. Implantation rates after two, three or five days of embryo culture. Placenta.2003;24: (suppl):S13-9.
  4. Quinn P., Kerin J.F., Warnes G.M. Improved pregnan-cy rate in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fluid. Fertil Steril.1985;44(4):493-8.
  5. Trew A.J., Lash G.E., Baker P.N. Investigation of an In Vitro model of trophoblast invasion. Biol Med.2000; 4(3):176-190.
  6. غفاری معرفت، آخوندی محمد مهدی، حیدری مهناز. بررسی اثرات محیط‌های کشت مختلف بر تکامل جنین و سلول‌های اپی‌تلیال لوله رحم انسان. فصلنامه باروری و ناباروری: سال چهارم(1381)، شماره1، صفحات 16-5.
  7. Campbell S., Rowe J., Jakson C.J., Gallery E.D.M. In vitro migration of cytotrophoblasts through a decidual endothelial cell monolayer. Placenta.2003;24:306-315.
  8. Murphy C.R. Uterine receptivity and the plasma memb-rane transformation. Cell Res.2004;14(4):259-267.
  9. Lazzaroni L., Fusi F.M., Doldi N., Ferrrari A. The use of Matrigel at low concentration enhances in vitro blastocyst formation and hatching in a mouse embryo model. Fertil Steril.1999;71(6):1133-1137.
  10. Dawson K.M., Baltz J.M., Claman P. Culture with Matrigel inhibits development of mouse zygotes. J Assist Reprod Genet.1997;14(9):543-8.
  11. Edashing K., Asano A., An T.Z., Kasai M. Restora-tion of resistance to osmotic swelling of vitrified mouse embryos by short term culture. Cryobiology. 1999;38(4):273-80.
  12. Baharvand H., Valojerdi M.R. Effect of glucose and phosphate on the development of one-cell NMARI mouse embryo in M16, CZB and T6 media. Physiol Pharmacol.1999;3(1).
  13. Goldman- Wohl D.G., Yagel S. Regulation of tropho-blast invasion: from normal implantation to pre- eclampsia. Mol Cell Endocrinol.2002;187(1-2):233-8.
  14. Spenceer T.E., Johnson G.J., Bazar F.W., Burghart R. C. Implantation mechanism: insights from the sheep. Reproduction.2004;128:657-668.
  15. Carson D.D., Bagchi I., Dey S.K., Enders A.C., Fazle-bas A.T. Review embryo implantation. Dev Biol.2000; 223:217-237.
  16. Desai N., Lawson J., Scarrow M., Kinzer D., Goldfarb J. Evaluation of the effect of interlukin-6 and human extracellular matrix on embryonic development. Hum Reprod.1999;14(6):1588-1592.
  17. Carver J., Martin K., Spyropoulou I., Barlow D., Sargent I., Mardon H. An in-vitro model for stromal invasion during implantation of the human blastocyst. Hum Reprod.2003;18(2):283-290.
  18. Armant D.R., Kameda S. Mouse trophoblast cell invasion of extracellular matrix purified from endomet-rial tissue: a model for peri-implantation development. J Exp Zool.1994;269(2):146-56.
  19. Karja N.W.K., Otoi T., Murakami M., Yuge M., Fahrudin M., Suzuki T. Effect of protein supplement to the hatching and hatched blastocyst stage of cat IVF embryo. Reprod Fertil Develop.1996;14(5):291-296.
  20. Menino A.R., Oclaray J.L. Enhancement of hatching and trophoblastic outgrowth by mouse embryos cultured in Whittens medium containing plasmin and plasminogen. J Reprod Fertil.1986;77:159-167.
  21. Sakkas D., Urner F., Menezo Y., Leppens G. Effect of glucose and fructose on fertilization, cleavage and viability of mouse embryos in vitro. Biol Reprod. 1993;49:1288-1292.
  22. Loutradis D., Drankakis P., Kalliandis K., Sofikitis N., Kallipolitis G., Millingos S., Makris N., Michalas S. Biological factors in cultuer media affecting in vitro fertilization, preimplantation embryo development, and implantation. Ann NY Acad Sci.2000;900:325-35.
  23. Scott L.A. Oocyte and embryo culture. In the handbook of Assisted Rep-roduction Laboratory. Keel B.L., May J.V., De Jonge C.J. (Editors). 1st Edition, CRC Press, Florida.2000;pp:197-220.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 7, Issue 1
Spring 2006
Pages 7-16