زمینه و هدف

بارداری یک پروسه پیچیده است و نیاز به تغییرات فیزیولوژیک در کل بدن مادر و همچنین در سطوح مختلف سیستم ایمنی دارد. اخیراً مشخص شده است که در طی بارداری سلول‌های در گردش سیستم ایمنی مادر از نظر تعداد، فنوتیپ، عملکرد و توانایی تولید فاکتورهای محلول مانند سایتوکینها دچار تغییر می‌شوند. در بارداری یک حالت تحمل ایمنی انتخابی و یا تعدیل پاسخ‌های ایمنی همراه با پاسخ‌های قوی ضدمیکروبی وجود دارد. به هر حال شواهد زیادی وجود دارد که نشان می‌دهد عملکرد سیستم ایمنی مادر می‌تواند توسط ریزمحیط‌های هورمونی و سایتوکینی تغییر یابد. علاوه بر مهار ایمنی موضعی، وضعیتی از مهار ایمنی سیستمیک نیز وجود دارد که به‌دلیل وجود فاکتورهای تنظیمی در سرم فرد باردار است. فعالیت اصلی این فاکتورها مثل سایتوکینها، پروستاگلاندینها، هورمونها و ... بیشتر به‌صورت موضعی و در سطح تماس مادر و جنین است و هرگونه اثرات سیستمیک این فاکتورها می‌تواند به علت پدیده سرریز باشد (1).

اثرات بارداری بر روی عملکرد سلول‌های ایمنی مادر از جنبه‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفته‌ است. در این زمینه سلول‌های دندریتیک نیز که به‌عنوان مهمترین سلول‌های عرضه کننده آنتی‌ژن فعالیت نموده و می‌توانند پاسخ سلول‌های T دست نخورده را القاء کنند، اهمیت به سزایی دارند (2). از جمله ویژگی‌های سلول‌های دندریتیک بیان آنزیم IDO در شرایط خاص است. سلول‌های دندریتیک با استفاده از این مکانیسم و مکانیسم‌های متعدد دیگر پاسخ‌های ایمنی را کنترل می‌کنند. آنزیم IDO تریپتوفان را تبدیل به کینورنین می‌کند که کمبود تریپتوفان و همچنین تولید متابولیت‌های سمی کینورنین باعث کاهش پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T می‌شوند (3).

اهمیت آنزیم IDO در بارداری، اولین بار بوسیله Munn و همکاران مشخص شد. آنها نشان دادند که تلقیح مهار کننده اختصاصی آنزیم IDO یعنی 1ـ متیل تریپتوفان به موش‌های باردار آلوژن، باعث سقط جنین در آنها می‌شود (4). تحقیقات قبلی نشان دادند که سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار باعث مهار پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T در محیط MLR آلوژنیک می‌شوند (5)؛ لذا هدف این تحقیق بررسی عملکرد آنزیم IDO و مکانیزم احتمالی مهار پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T از طریق این آنزیم می‌باشد.

روش بررسی

1ـ روش تهیه سرم موش در اواسط بارداری: از تکنیک تشخیص پلاک واژینال برای تعیین سن بارداری استفاده شد. برای ایجاد بارداری آلوژنیک، موش‌های ماده Balb/c با موش‌های نر (نژاد C57BL/6) جفت‌اندازی شدند. موش‌های ماده تا 3 روز متوالی هر روز صبح از نظر تشکیل پلاک واژینال مورد بررسی قرار گرفتند. در تمام موش‌های ماده پلاک مثبت، وجود اسپرم نیز در ترشحات واژن از طریق تهیه اسمیر واژینال بررسی گردید. روز مشاهده اسپرم در اسمیر واژینال به‌ عنوان روز 5/0 بارداری در نظر گرفته شد.

خونگیری از قلب موش‌های ماده Balb/c در اواسط بارداری (11ـ9 روزگی) انجام ‌گرفت و سرم آن جدا گردید. سرم بدست آمده با فیلتر 22/0 استریل و در فریز 70- درجه تا زمان استفاده نگهداری گردید.

از سرم موش ماده غیرباردار نیز به‌عنوان کنترل استفاده شد.

2ـ تخلیص سلول‌های دندریتیک از طحال موش: در هر آزمایش بسته به تعداد سلول‌های دندریتیک مورد نیاز از 2 تا 3 موش استفاده شد. ابتدا موش‌های Balb/c نخاعی شده و با قیچی استریل پوست ناحیه شکم برش زده شده و طحال برداشته شد. بافر هضم‌کننده شامل آنزیم کلاژناز (Roche,Germany) به غلظت mg/ml1 و DNase (Roche,Germany) به غلظت g/ml20 به طحال تزریق گردید. سوسپانسیون سلولی حاصل، در یک لوله فالکون جمع‌آوری و بر روی یخ قرار داده شد. باقیمانده بافت طحال توسط قیچی تیز به قطعات کاملاً ریز تبدیل شد و سپس ml 3-2 بافر هضم‌کننده روی آن اضافه گردید و به مدت نیم ساعت در انکوباتور C37 حاوی 5% CO2 گذاشته شد. پس از پایان انکوباسیون به قطعات بافتی mM5 EDTA اضافه گردید و سوسپانسیون سلولی بدست آمده از الک سلولی عبور داده شد و با سوسپانسیون سلولی حاصل از تزریق آنزیمی مخلوط گردید. مخلوط سلولی 2 بار با mM5 PBS-EDTA شسته شده و تعداد سلول‌های حاصل و نیز میزان حیات آنها با استفاده از لام نئوبار و با روش تریپان بلو برآورد گردید. پس از دومین شستشو، محلول رویی به دقت خارج گردید و رسوب سلولی با محیط کشت حاوی 2% FCS (Gibco, England) و mM 5 EDTA مخلوط گردید. مخلوط حاصل به آرامی روی نایکودنز (Axis-Shield, Norway) ریخته شد و به مدت 15 دقیقه در دور g600 و دمای C4 سانتریفیوژ گردید. سلول‌های با دانسیته پایین که شامل سلول‌های دندریتیک و تعدادی لنفوسیت و مونوسیت بودند توسط پی‌پت پاستور به آرامی جمع‌آوری شدند و یک بار با mM 5 PBS-EDTA سرد و 2 بار با PBS سرد در دور g 330 شسته شده، شمارش گردیده و میزان حیات آنها محاسبه گردید. رسوب سلولی حاصل با محیط 1640-PRMI ((Gibco,England حاوی 10% FCS مخلوط گردید و به مدت 2 ساعت در دمای C37 و 5% CO2 کشت داده شد. در این مرحله سلول‌های دندریتیک و ماکروفاژها به کف پلیت می‌چسبند. بعد از کشت دو ساعته، سلول‌های غیرچسبان با RPMI گرم چندین بار به آرامی شسته شدند که با مشاهده کف پلیت توسط میکروسکوپ معکوس در صورت وجود ناخالصی عمل شستشو تکرار گردید. با توجه به شکل خاص سلول‌های دندریتیک، درصد خلوص در این مرحله به بیش از 75% رسید. به سلول‌های باقی مانده در کف پلیت، محیط گرم حاوی 10% FCS اضافه گردید و پلیت‌ها 16-12 ساعت در انکوباتور C37 و 5% CO2 قرار داده شدند. پس از کشت شبانه، سلول‌های دندریتیک از ته پلیت جدا شده و شناور می‌شدند که به آرامی جمع‌آوری شده و 2 بار با PBS سرد شسته شدند و پس از شمارش به‌عنوان سلول‌های دندریتیک جهت بررسی فلوسایتومتری و آزمایش MLR مورد استفاده قرار گرفتند (6).

3- جداسازی گره لنفاوی و تخلیص سلول T به‌وسیله ستون نایلون وول : ابتدا یک موش C57BL/6 نخاعی شد و تحت شرایط استریل غدد لنفاوی براکیال آن جدا شد. سپس گره‌های جدا شده له شد تا تمام سلول‌های آن خارج شود. سوسپانسیون سلولی بدست آمده از الک سلولی عبور داده شد و 2 بار با PBS استریل به مدت 10 دقیقه در دور g300 شستشو گردید. سلولها در این مرحله شمارش شده و تعداد و میزان حیات آنها بررسی شد. در مرحله بعد l 500 از سوسپانسیون سلولی آماده شده روی ستون نایلون وول استریل که قبلاً دمای آن به C37 رسانده شده بود برده شد. ستون حاوی سلول به مدت 45 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد. پس از انکوباسیون، سلول‌های متصل نشده به ستون به آرامی خارج شده در یک لوله فالکون جمع‌آوری گردید. سلول‌های جمع‌آوری شده برای 10 دقیقه در g330 سانتریفیوژ و شستشو داده شده، شمارش شدند. پس از بررسی درصد خلوص سلول‌های بدست آمده با روش فلوسایتومتری، این سلولها در آزمایش MLR مورد استفاده قرار گرفتند.

4ـ آنالیز فلوسایتومتری: از سلول‌های دندریتیک حاصل پس از کشت شبانه، سوسپانسیون سلولی با غلظت cell/ml 106×1، تهیه شد سپس l100 از این سوسپانسیون در دو لوله ریخته شد و لوله‌ها در بشر حاوی یخ قرار داده شد. به لوله تست l 1 آنتی‌بادی ضد CD11c موش با منشاء هامستر کونژوگه با PE (BD,U.S.A) و به لوله دیگر، کنترل ایزوتیپ مربوطه اضافه شد. لوله‌ها 45 دقیقه روی یخ انکوبه شدند. پس از انکوباسیون نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتری FACS (Partech, Germany) در سازمان انتقال خون تهران آنالیز گردید.

از سلول‌های T حاصل یک سوسپانسیون با غلظت cell/ml 106×1 در بافر فلوسایتومتری تهیه شد. l100 از سوسپانسیون سلولی به 2 لوله فلوسایتومتری منتقل گردید. به لوله تست l5 آنتی‌بادی ضد CD3 موش با منشاء رت نشاندار با PE (Serotec, U.K) و به لوله دیگر، کنترل ایزوتیپ مربوطه اضافه گردید و لوله‌ها به مدت 45 دقیقه روی یخ انکوبه شد. پس از انکوباسیون سلولها، نتایج توسط دستگاه فلوسایتومتری آنالیز گردید.

5ـ واکنش MLR آلوژنیک و بررسی اثر سرم موش باردار بر سلول‌های دندریتیک در القای پرولیفراسیون سلول‌های T: سلول‌های دندریتیک طبق روش گفته شده از موش Balb/c ماده جدا شدند و در کشت شبانه با سرم موش باردار و غیرباردار با غلظت 5/2% مجاور گردیدند و سپس rad 3000 اشعه داده شدند.

غلظت‌های cell/ml 105×2، cell/ml 105×1، cell/ml 104×5 و cell/ml 104×5/2 از سلول‌های دندریتیک مجاور شده با سرم موش باردار و غیرباردار در محیط کامل RPMI تهیه گردید. لنفوسیت T از غدد لنفاوی موش C57BL/6 جدا شد. غلظت cell/ml 106×1 از سلول‌های T در محیط کامل RPMI تهیه گردید.

از تمامی غلظت‌های تهیه شده از سلول‌های دندریتیک، l 100 به حفره‌های پلیت 96 خانه‌ای U شکل به‌صورت 3 تایی اضافه شد. از سوسپانسیون سلول‌های T تهیه شده نیز l 100 به حفره‌های حاوی سلول‌های دندریتیک با غلظت‌های مختلف اضافه گردید. به‌عنوان کنترل منفی، سلول‌های دندریتیک تنها و سلول‌های T تنها به‌صورت 3 تایی در حفره‌های پلیت 96 خانه‌ای کشت داده شدند و به‌عنوان کنترل مثبت نیز PHA (Gibco,England) با غلظت g/ml5 به کشت لنفوسیت‌های T اضافه گردید. تمامی نمونه‌ها برای مدت 72 ساعت کشت داده شدند. پس از این مدت تایمیدین نشاندار (3H-Thymidine) (Amersham, U.K.) با غلظت ci/well 1 به هر حفره اضافه گردید. 18-16 ساعت بعد سلولها توسط دستگاه Cell harvester (Titertec, UK) جمع‌آوری شدند و تکثیر سلول‌های T برحسب شمارش در دقیقه (CPM) با دستگاه بتا کانتر (Wallac, 14410, Germany) اندازه‌گیری شد.

6ـ بررسی تأثیر سرم موش باردار روی القاء آنزیم IDO در سلول‌های دندریتیک در محیط MLR آلوژنیک:

به منظور ردیابی آنزیم IDO در محیط کشت از دو روش استفاده شد:

الف‌ـ استفاده از مهارکننده اختصاصی آنزیم IDO: آزمایش MLR با استفاده از سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار در اواسط بارداری انجام شد. سپس به منظور بررسی حضور آنزیم IDO در محیط، مهارکننده اختصاصی این آنزیم یعنی 1ـ متیل -D تریپتوفان (Sigma,USA) با غلظت‌های 100، 200، 300، 400 و M500 به کشت همزمان لنفوسیت‌های T و سلول‌های دندریتیک اضافه شد. بعد از 72 ساعت از کشت سلولها و اضافه نمودن تیمیدین 3H، 18 ساعت بعد سلولها جمع‌آوری شدند و نتایج با بتاکانتر خوانده شد.

ب‌ـ بررسی متابولیت‌های آنزیم IDO به روش HPLC: بعد از کشت 72 ساعته مایع رویی (l 150) کشت MLR به دست آمد. از دو حالت مورد بررسی (سلول‌های دندریتیک مجاور شده با سرم غیرباردار و سرم باردار) جمع‌آوری گردید و پروتئین‌های اضافی آن با متانول (Merck, Germany) رسوب داده شد. الکل نمونه‌ها تحت تأثیر خلاء خشک شد و نمونه‌ها در l 100 آب دیونیزه حل شدند و برای بررسی مقدار تریپتوفان و کینورنین موجود در آنها به‌وسیله دستگاه HPLC (ACTA Purifier) (Pharmacia, Seweden) آماده شدند. ستون مورد استفاده ستون C18 آنالیتیک فاز معکوس بود (C18 ion exchanger).

در ابتدا برای بدست آوردن زمان خروج تریپتوفان و کینورنین از ستون، استانداردهای تریپتوفان و کینورنین (Sigma,U.S.A.) در غلظت‌های مختلف شامل 50، 25، 5/12، 25/6 و g/ml 125/3 در آب دیونیزه تهیه شد. سپس l 100 از هر استاندارد به ستون C18 فاز معکوس تزریق شد. فاز متحرک شامل آب و استونیتریل بود که از غلظت 40-0% به مدت 20 دقیقه روی ستون برده شد. جذب تریپتوفان و کینورنین در طول موج‌های 225، 254 و 280 نانومتر توسط دستگاه HPLC خوانده شد. زمان خروج استاندارد کینورنین و تریپتوفان از ستون به ترتیب 5/6 و 8 دقیقه پس از تزریق بود. سپس نمونه‌های آماده شده به مقدار l100 به داخل ستون C18 تزریق شد و با توجه به زمان خروج نمونه‌های استاندارد، حداکثر مقدار تریپتوفان و کینورنین در نمونه‌های مورد نظر تشخیص داده شد و سطح زیر منحنی تریپتوفان و کینورنین در هر دو حالت بررسی گردید (7).

7ـ آنالیز آماری: آنالیز آماری توسط نرم افزار SPSS ویرایش 11 انجام گرفت. در این مطالعه از آزمون غیرپارامتری Mann-Whitney برای بررسی اختلاف بین گروهها استفاده گردید. حدود اطمینان در تمامی آزمایشات 95% در نظر گرفته شد و 05/0p< معنی‌دار محسوب گردید. تمامی آزمایشات به صورت سه تایی بوده و هر آزمایش 5 بار تکرار گردید. نتایج به صورت میانگین و انحراف معیار Mean±SD پنج آزمایش مستقل ارائه شده‌اند.

نتایج

جداسازی سلول‌های دندریتیک و سلول‌هایT: در این مطالعه برای جداسازی سلول‌های کم چگال از نایکودنز فاقد سمیت برای سلولها استفاده شد.

نایکودنز مورد استفاده 2/12% بوده و سوسپانسیون سلولی به آرامی روی آن برده شد و به مدت 15 دقیقه در دمای C4 با دور g 600 سانتریفیوژ شد.

پس از سانتریفیوژ، سلول‌های دندریتیک به همراه مونوسیتها و مقداری لنفوسیت در حد فاصل نایکودنز و محیط کشت شناور می‌مانند.

نتایج حاصل نشان داد که از هر طحال حدود 10 تا 15 میلیون سلول تک هسته‌ای بدست می‌آید که در تمام موارد درصد حیات آنها بیشتر از 95% بود. خلوص سلول‌های دندریتیک حاصل بعد از کشت 2 ساعته با استفاده از میکروسکوپ معکوس حدود 70% تخمین زده شد. بعد از کشت 18 ساعته نیز سلول‌های دندریتیک شناور جمع‌آوری شدند و میزان خلوص آنها با استفاده از رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس توسط آنتی‌بادی اختصاصی سلول‌های دندریتیک موش (Anti-CD11c) و دستگاه فلوسایتومتر بیش از 285% تعیین شد (نمودار 1).

جداسازی و تخلیص سلول‌های T از غدد لنفاوی موش به‌وسیله تکنیک نایلون وول انجام گرفت. میزان خلوص سلول‌های T جدا شده با استفاده از دستگاه فلوسایتومتر و Anti-CD3، 290% تعیین شد. درصد زنده بودن سلول‌های حاصل در تمام موارد بیش از 95% بود. نمودار 2 میزان خلوص سلول‌های T جدا شده را توسط دستگاه فلوسایتومتر نشان می‌دهد.

نتایج حاصل از MLR آلوژنیک و سنجش پاسخ تکثیری: نتایج حاصل از میانگین CPM مقادیر متغیر سلول‌های دندریتیک نشان داد که وقتی نسبت سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم به لنفوسیت‌های T در MLR آلوژنیک یک دهم باشد، بیشترین اختلاف بین CPM نمونه‌های تیمار شده با سرم باردار و سرم غیرباردار مشاهده می‌گردد. بنابراین نسبت فوق‌الذکر، یعنی 104×1 سلول دندریتیک به ازای 105×1 عدد لنفوسیت T، به‌عنوان نسبت اپتیمم در تمامی آزمایشات MLR مورد استفاده قرار گرفت. نمودار 3 میزان پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T را در برابر مقادیر متغیر سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم در واکنش MLR آلوژنیک برحسب CPM نشان می‌دهد.

نتایج حاصل از پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های‌ T در مقابل سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار و غیرباردار برحسب CPM نشان می‌دهد که سرم موش باردار باعث مهار پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T، (275623609)، در مقایسه با سرم موش غیرباردار، (306148414)، می‌شود و تفاوت توزیع CPM نیز اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهد (000/0=p).

نتایج حاصل از تأثیر غلظت‌های مختلف 1– متیلD – تریپتوفان بر کشت همزمان سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار و غیرباردار و لنفوسیت‌های T آلوژن: به منظور بررسی غیرمستقیم عملکرد IDO در کشت سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار و غیرباردار، از مهارکننده اختصاصی آنزیم IDO یعنی 1ـ متیل تریپتوفان استفاده شد. 1ـ متیلD- تریپتوفان با غلظت‌‌های 100، 200، 300، 400 و M500 به کشت همزمان سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم موش باردار و غیرباردار اضافه گردید و طبق نتایج بدست آمده غلظت M300 از 1ـ متیل تریپتوفان به‌عنوان غلظت اپتیمم انتخاب شد و با توجه به اینکه در غلظت‌های بیشتر از آن پاسخ تکثیری کاهش نشان می‌داد، در سایر آزمایشات از غلظت M300 استفاده شد. نتایج CPM حاصل نشان داد که افزودن 1ـ متیل تریپتوفان به کشت همزمان سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم باردار و لنفوسیت T، افزایش پاسخ تکثیری معنی‌داری را ایجاد نمی‌کند (220/0=p). نمودار 4 مقایسه CPM در گروه سلول‌های دندریتیک تیمار شده با سرم باردار در حضور 1ـ متیل تریپتوفان و بدون 1ـ متیل تریپتوفان را نشان می‌دهد.

نتایج بررسی متابولیت‌های آنزیم IDO به روش HPLC: جذب اجزاء خروجی از ستون HPLC در طول موج‌های 280، 254 و 225 نانومتر خوانده شد. از تریپتوفان و کینورنین نیز غلظت‌های 50، 25، 5/12، 25/6 و g/ml125/3 به‌عنوان استاندارد تهیه شد و زمان خروج هر نمونه از ستون بدست آمد. در شرایط بکار برده شده توسط گروه تحقیق حاضر کینورنین تقریباً در دقیقه 5/6 و تریپتوفان در دقیقه 8 از ستون خارج ‌‌شد.

پس از عبور دادن مایع رویی کشت مختلط لنفوسیت‌های T با سلول‌های دندریتیک مجاور شده با سرم موش باردار و غیرباردار، بررسی سطح زیر منحنی‌های تریپتوفان و کینورنین در این دو حالت اختلاف معنی‌داری را نشان نداد که می‌توان نتیجه گرفت که احتمالاً سرم موش باردار باعث القاء آنزیم IDO در سلول‌های دندریتیک نشده است. زیرا متابولیت‌های این آنزیم که تریپتوفان و کینورنین هستند در دو حالت مورد بررسی تفاوت معنی‌داری نشان نمی‌دهند.

نمودار5 به ترتیب نمونه‌ای از منحنی‌های خروج کینورنین و تریپتوفان از ستون C18 را در حالت‌های مختلف استاندارد، سرم غیرباردار و باردار نشان می‌دهد.

بحث

از نظر مبانی علم ایمونولوژی پدیده بارداری به سختی قابل تفسیر می‌باشد. با وجود آنتی‌ژن‌های پدری در سطح سلول‌های جفت و جنین و بیگانه بودن این آنتی‌ژنها برای سیستم ایمنی مادر، جنین توسط سیستم دفاعی مادر دفع نمی‌گردد. تحقیقات متعدد نشان داده‌اند که در طی بارداری سلو‌ل‌‌های سیستم ایمنی مادر از نظر تعداد، فنوتیپ، عملکرد و توانایی تولید سایتوکینها دچار تغییر می‌شوند (8) و پاسخ‌های ایمنی مادر به صورت موضعی و سیستمیک کنترل می‌گردد.

کنترل سیستمیک سیستم ایمنی مادر غالباً به‌دلیل وجود فاکتورهای تنظیمی در سرم فرد باردار است. اخیراً آنزیم IDO به‌عنوان یکی از عوامل مهارکننده پاسخ‌های ایمنی مادر در طی بارداری مطرح شده است که با کاهش تریپتوفان و تولید متابولیت‌های سمی کینورنین باعث مرگ و کنترل فعالیت سلو‌ل‌‌های B، T و NK می‌شود (9). در این زمینه سلو‌ل‌‌های دندریتیک به‌عنوان یکی از مهمترین سلو‌ل‌‌های تولید کننده آنزیم IDO، نقش مهمی در ایجاد تحمل مادر نسبت به جنین ایفا می‌کنند.

در این مطالعه تأثیر سرم موش بر روی القاء آنزیم IDO به‌وسیله سلو‌ل‌‌های دندریتیک مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که سرم موش باردار در اواسط بارداری توانایی سلو‌ل‌‌های دندریتیک را در القاء تحریک آلوژنیک لنفوسیت‌های T به‌طور معنی‌داری کاهش می‌دهد ولی احتمالاً سرم موش باردار باعث القاء آنزیم IDO در سلو‌ل‌‌های دندریتیک نمی‌شود زیرا پاسخ تکثیری لنفوسیت T در واکنش MLR در حضور مهارکننده آنزیم IDO تفاوت معنی‌داری را نشان نداد. بررسی متابولیت‌های IDO یعنی تریپتوفان و کینورنین در مایع رویی کشت MLR نیز تفاوت معنی‌داری را بین گروه باردار و غیرباردار نشان نداد.

مکانیسم‌های تولرانس یا تحمل، دور از موضع بارداری و به‌صورت سیستمیک و یا به‌طور موضعی و در سطح تماس مادرـ جنین اعمال می‌شوند. فاکتورهای مختلفی مانند هورمون‌‌های استروژن‌ـ پروژسترون، IL-10 ، TGF-، PGE2، AFP، Annexin II، ویتامین D3و… در سطح تماس مادرـ جنین تولید می‌شوند که قادر به سرکوب سیستم ایمنی مادر می‌باشند (10). این فاکتورها با غلظت بالا در سطح تماس مادرـ جنین یافت می‌شوند و سرریز آنها در گردش خون در مهار ایمنی سیستمیک مؤثر است. مطالعات انجام شده روی سرم خانم‌های باردار نشان داده است که سرم افراد باردار روی عملکرد سلو‌ل‌‌های T اثر مهاری دارد که ناشی از فاکتورهای مهاری موجود در سرم است. این اثر مهاری در هر دو سیستم MLR آلوژنیک و اتولوگ دیده شده است (11). ویتامین D3 نیز یکی دیگر از فاکتورهایی است که مشخص شده مانع بلوغ سلو‌ل‌‌های دندریتیک مشتق از مونوسیتها شده و بیان MHC II، CD80، CD86، CD40 و CD83 را روی این سلو‌لها کاهش می‌دهد. همچنین توانایی سلو‌ل‌‌های دندریتیک مجاور شده با ویتامین D3 برای برداشت آنتی‌ژن محلول و نیز تحریک آلوژنیک و اتولوگ سلو‌ل‌‌های T به نحو قابل ملاحظه‌ای کاهش می‌یابد (12).

Huck و همکارانش در سال 2005 تأثیر هورمون‌‌های مرتبط با بارداری را روی فنوتیپ و عملکرد سلول‌های دندریتیک مشتق از PBMC بررسی کردند. آنها نشان دادند که سلول‌های دندریتیک بالغ و نابالغ تحت تأثیر پروژسترون و استرادیولها بیان بالایی از IL-10 داشته و سلول‌های دندریتیک بالغ تحت تأثیر پروژسترون و hCG یا استرادیول کاهش معنی‌داری را در تولید IL-18 نشان می‌دهند. ولی تفاوت معنی‌داری در بیان شاخص‌های سطحی و همچنین توانایی تحریک سلو‌ل‌‌های ‏T در آنها مشاهده نشد (13). مطالعه دیگری در سال 2006 نیز نشان داد، پروژسترون باعث کاهش بلوغ سلو‌ل‌‌های دندریتیک می‌شود و اندوسیتوز سلو‌ل‌‌های دندریتیک را نیز افزایش می‌دهد (14).

مطالعات Polanczyk و همکارانش در سال 2006 نیز نشان داده است که استروژن تولید سایتوکین‌های التهابی مانند IL-12 و IFN- را در سلول‌های عرضه‌کنندة آنتی‌ژن کاهش، اما تولید IL-10 را افزایش می‌دهد. همچنین بلوغ سلو‌ل‌‌های دندریتیک مشتق از مغز استخوان در مجاورت استروژن باعث افزایش فعالیت سلو‌ل‌‌های Treg و مهار مستقیم پاسخ‌های لنفوسیت T می‌شود (15).

اخیراً آنزیم IDO به‌عنوان یک عامل مهم در بقاء بارداری مورد توجه محققان قرار گرفته است. مطالعات Tatsumi و همکارانش نقش مهم آنزیم IDO را در مهار پاسخ تکثیری لنفوسیت T در in vitroو همچنین مهار پاسخ لنفوسیت T به آلوآنتی‌ژن‌های جنین را در بارداری نشان داده‌اند (16). آنزیم IDO در سطح تماس مادرـ جنین به‌وسیله سلو‌ل‌‌های سنسیشیوتروفوبلاست تولید می‌شود ولی به‌طور کلی سلو‌ل‌‌های عرضه کننده آنتی‌ژن و مخصوصاً سلو‌ل‌‌های دندریتیک از مهمترین سلو‌ل‌‌های تولید کننده IDO هستند. هر دو زیر رده لنفوئیدی و میلوئیدی سلو‌ل‌‌های دندریتیک آنزیم IDO را بیان می‌کنند ولی فعالیت عملی کاتابولیسم تریپتوفان تنها به‌وسیله سلو‌ل‌‌های دندریتیک لنفوئیدی صورت می‌گیرد (17). سلو‌ل‌‌های تولید کننده IDO در جفت انسان در سطح تماس مادرـ جنین و چند روز بعد از لانه‌گزینی در دسی‌‌دوای موش باردار تجمع می‌یابند.

به علاوه میزان تریپتوفان سرم فرد باردار به‌طور پیشرونده‌ای از سه ماهه اول تا سه ماهه سوم بارداری، همزمان با تکامل جفت کاهش می‌یابد (18).

مهار تکثیر لنفوسیت‌های T در اثر آنزیم IDO را به دو علت نسبت می‌دهند یکی کاهش تریپتوفان محیط که یک اسیدآمینه ضروری برای حیات و تکامل سلو‌ل‌‌هاست و مهمتر از آن تولید متابولیت‌های سمی کینورنین مانند 3ـ هیدروکسی کینورنین و 3ـ هیدروکسی آنترانیلیک است. این متابولیت‌های سمی باعث مرگ سلو‌ل‌‌هایB، T و NK می‌شوند. ولی روی سلو‌ل‌‌های دندریتیک تولیدکننده آنزیم IDO تأثیری ندارد (9). با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه اینگونه استنباط می‌شود که کاهش پاسخ تکثیری لنفوسیت‌های T به واسطه سرم موش باردار به‌دلیل القاء آنزیم IDO در سلو‌ل‌‌های دندریتیک نباشد، زیرا مهارکننده اختصاصی آن یعنی 1ـ متیل تریپتوفان قادر به از بین بردن سرکوب ایجاد شده نبود ونتایج HPLC نیز آن را تأیید می‌کرد.

نتیجه‌گیری

به نظر می‌رسد سرم موش باردار باعث القاء آنزیم IDO در سلول‌های دندریتیک نمی‌شود و این آنزیم بیشتر به عنوان یک عامل مهاری در موضع بارداری عمل می‌کند و تأثیرات سیستمیک آن کمتر است. بنابراین برای درک بهتر مکانیزم سرکوب باید تأثیر عوامل موجود در سرم باردار را روی سایر خصوصیات سلول‌های دندریتیک از جمله شاخص‌های سطحی و بلوغ این سلولها و توانائی تولید سایتوکین‌هایی از قبیل ,IFN-g ,IL-12 IL-10 و IL-18 توسط سلول‌های دندریتیک را مورد مطالعه قرار داد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از سرکار خانم مهین نیکو گفتار و دیگر پرسنل بخش فلوسایتومتری سازمان انتقال خون ایران که ما را در اجراء این پروژه یاری نمودند صمیمانه تشکر می‌شود.