Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Polymorphism in Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase (PHGPX) gene in Iranian infertile men

Authors
Niknam Lakpour 1
Mohammad Hossein Modarresi 2
Hadi Kharazi 1
Mohammad Mehdi Akhondi 3
Asad Veisi Raygani 1
Jamileh Ghasemi 4
Mahshid Hodjat 4
Mohammad Reza Sadeghi 4
1 Clinical Biochemistry Department, Faculty of Medicine, Kermanshah Medical Sciences University, Kermanshah, Iran
2 Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
3 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
4 Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Leukocytes and defective or dead spermatozoa in human semen are a source for the production of reactive oxygen species (ROS) and subsequent injury to intact sperms. Enzymatic and non-enzymatic defensive mechanisms in semen detoxify these compounds. Glutathione peroxidase-4 (GPX-4 or PHGPX) is a major selenoprotein in sperm and it is one of the enzymatic mechanisms that play multiple roles during spermatogenesis. Some of these roles are formation of the mitochondrial capsule, hydro-peroxide detoxification and sperm chromatin condensation. Any decrease in the enzyme activity or content, may create disorders in spermatogenesis and sperm fertilizing ability. Considering defects in the expression of the enzyme gene or presence of mutations which may cause decreases in PHGPX activity or content, this study was carried out to identify a number of important mutations in GPX-4 gene by PCR-RFLP method in Iranian infertile men. Materials & Methods: This study was performed on 128 Iranian men who had been referred to Avesina Infertility Clinic, including 74 infertile men with defective sperm parameters, 18 normozoospermic and 36 fertile subjects as controls. Mean ± SD for sperm parameters were determined. Genomic DNA was extrac-ted using salting out procedure from peripheral blood leukocytes. PCR-RFLP was done by two sets of primers with 237 bp and 148 bp PCR products that were designed for 1A and 4 exons of GPX-4 gene covering nucleotides of +6 (CT), +17 (GA), +1725 (GA) by MwoI, PshAI and SatI enzymes.Results: Digestion of a 237 bp intact PCR product by MwoI generates two fragments (151 bp and 86 bp). When a mutation occurs in the restriction site +6 (CT), the enzyme would not recognize the sequence, therefore 237 bp segment remains undigested. Treatment of 237 bp segment with PshAI generates two fragments (161 bp and 76) in the intact gene but the same enzyme can not digest 237 bp segment when a mutation occurs in the restriction site +17 (GA). Ultimately, digestion of 148 bp intact segment with SatI generates two fragments (108 bp and 40 bp) but when a mutation occurs in the restriction site +1725 (GA), the enzyme will not recognize the sequence; therefore 148 bp segment remains undigested. Enzy-matic digestion evaluations of 237 bp and 148 bp segments in all participants revealed that neither of the examined mutations existed in GPX-4 gene.Conclusion: According to the results of this study, it is determined that the prevalence of these mutations in Iranian infertile men is probably low and it may have no association with the etiology of the disorder affecting sperm parameters. Hence, a study with a larger number of patients is suggested to determine the exact prevalence of these and other mutations of the gene in Iranian infertile men.
Keywords
Male infertility
PHGPX
Polymorphism
ROS
Selenoproteins
Sperm

زمینه و هدف

براساس نتایج موجود علت ناباروری حدود 25% زوجین مراجعه‌کننده برای درمان ناباروری را اختلال در عملکرد اسپرم تشکیل می‌دهد (1،2).

در اکثر موارد شناسایی علل نقایص عملکرد اسپرم مشکل می‌باشد؛ زیرا برخی از موارد ناباروری در مردانی با پارامترهای طبیعی مایع منی نیز مشاهده می‌گردد. یکی از عوامل مؤثر در عملکرد طبیعی اسپرم رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) است. ROS برای عملکرد طبیعی و پاتوفیزیولوژی اسپرم (3،4) و انجام اعمالی نظیر واکنش‌ آکروزومی، بیش فعالی و ظرفیت‌پذیری و سایر واکنش‌های وابسته به اکسیداسیون‌ـ احیا ضروری می‌باشد (5،6). علاوه براین به دلیل غنی‌بودن غشای پلاسمایی اسپرم از اسیدهای چرب با چندین پیوند غیراشباع (PUFA) نسبت به تخریب پراکسیداتیو ROS حساس و آسیب‌پذیر می‌باشد. از طرف دیگر وجود PUFA برای حفظ سیالیت غشاء و عملکرد طبیعی اسپرم طی فرآیند لقاح ضروری است (8-5). سطوح بالای ROS سبب پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و در نتیجه افزایش نفوذپذیری غشای اسپرم و در نهایت سبب ایجاد ناهنجاری‌های مورفولوژیک و اثرات منفی روی حرکت اسپرم (9)، اتصال اسپرم‌ـ تخمک (8) و اختلال در روند لقاح می‌گردد (12-10،7). از طرف دیگر سطوح بالای ROS سبب تخریب سایر ماکرومولکولها نظیر پروتئینها، گلیکوپروتئینها و DNA می‌شود (8). براساس نتایج مطالعة Lewis و همکاران سطح ROS در 88-40% مردان نابارور بالاتر از مقادیر طبیعی بوده است (13). لذا برای مواجهه و محافظت ماکرومولکولها و ساختار اسپرم در برابر رادیکال‌های آزاد، دو سیستم آنتی‌اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی در پلاسمای منی و اسپرم وجود دارد. سیستم‌های غیرآنزیمی محافظ اسپرم در برابر ROS شامل - توکوفرول، - کاروتن، آسکوربات، اورات، ترانسفرین، لاکتوفرین و سرولوپلاسمین بوده (7،13،14) و سیستم‌های آنزیمی شامل آنزیم‌های گلوتاتیون پراکسیداز/ گلوتاتیون ردوکتاز (GPX/GR) ، سوپر اکسید دسموتاز (cu/zn SOD) (15) و (Mn SOD) (16) و آنزیم کاتالاز (17) می‌باشند (18). از این میان آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز دارای اهمیت خاصی است. این آنزیم 5 نوع ایزوآنزیم دارد که از بین آنها گلوتاتیون پراکسیدازهای نوع 1 تا 4 حاوی سلنیم (سلنوپروتئین) و نوع 5 فاقد سلنیم می‌باشد (19،20). محل بیان آنزیم GPX-5 در اپیدیدیم است و این آنزیم دارای مقادیر فعالیت کمی در غشای اسپرم می‌باشد (21).GPX-1 فرم سیتوپلاسمی آنزیم است و به طور وسیع در بافت‌های مختلف شامل کبد، کلیه و غده آدرنال و... بیان می‌شود (22). فرم‌های GPX-2 و GPX-3 به ترتیب در دستگاه گوارش و پلاسما (فرم خارج سلولی) وجود دارند. علاوه بر این گزارشاتی نیز مبنی بر دخالت آنها در روند تولیدمثل وجود دارد (23). در سال 1982 گلوتاتیون پراکسیداز نوع IV یا فسفولیپید هیدروپراکسید گلوتاتیون پراکسیداز (PHGPX; GPX-4, E.C 1.11.1.12) برای اولین بار توسط Ursini و همکاران از کبد خوک تخلیص گردید (24). PHGPX برخلاف سایر اعضای خانوادة گلوتاتیون پراکسیدازها مونومر است و در مقادیر بسیار زیاد در بافت بیضه بیان می‌شود (25). این فرم از آنزیم می‌تواند به طور مستقیم هیدروپراکسیدهای لیپیدی تولید شده در غشاها را (فسفولیپید هیدروپراکسید، استر کلستریل هیدروپروکسید) احیا نماید (26). علاوه بر هیدروپراکسیدهای حاصل از لییپدها، PHGPX می‌تواند هیدروپراکسید تیمین را نیز احیا کند و جالبتر اینکه در مقایسه با فرم‌های گلوتاتیون پراکسیداز سیتوپلاسمی (cGPX یا GPX-1) و گلوتاتیون پراکسیداز دستگاه گوارش ((GPX- GI، PHGPX می‌تواند علاوه بر گلوتاتیون انواع وسیعی از سوبستراهای دهندة اکی‌والان‌های احیاء نیز استفاده نماید (27). به همین دلیل تصور می‌شود که این آنزیم آنتی‌ اکسیدانی قوی برای حمایت از غشا در مقابل استرس اکسیداتیو (OS) باشد (28). در مقایسه بافت بیضه با سایر بافتها سطح آنزیم PHGPX بالاتر است و نیز بیان آن وابسته به حضور گنادوتروپینها می‌باشد (19،29). در بافت بیضه PHGPX به سه شکل سیتوپلاسمی، میتوکندریایی یا هسته‌ای بیان می‌شود (30،31). استفاده از تکنیک in situ hybridization نشان می‌دهد که GPX-4 در رده‌های سلولی اسپرماتوژنیک به مقدار زیادی بیان می‌شود و بیشترین فعالیت آن در بیضه به اسپرماتیدهای گرد نسبت داده می‌شود (32،33). در مراحل نهائی روند بلوغ اسپرم طی روند اسپرمیوژنز همراه با از دست دادن سیتوپلاسم و تغییر شکل اسپرم گلوتاتیون آن بوسیلة روندهای ناشناخته‌ای ناپدید می‌شود و گروه‌های تیول پروتئین‌های سلولی نیز به تدریج اکسید می‌شوند. بنابراین گلوتاتیون احیا به عنوان سوبسترای تأمین کننده اکی‌والان‌های احیاء در دسترس PHGPX قرار نمی‌گیرد و درنتیجه این آنزیم از گروه تیول‌ پروتئینها به عنوان سوبسترای جانشین استفاده می‌کند. بدین طریق بین آنزیم PHGPX و پروتئین‌های دیگر توسط پیوند یا باند پل‌های سلنودی سولفید اتصال برقرار می‌گردد (34،35). در نتیجه، آن دسته آنزیم‌های PHGPX که از طریق اتصال کووالانسی پل‌‌ سلنودی سولفید به سایر پروتئین‌های سلولی متصل می‌گردد، فعالیت آنزیمی خود را از دست داده و به عنوان ترکیبات شبه کراتینی، جزیی از ساختار سایتواسکلتون سلولی در مارپیچ میتوکندریایی ناحیه گردن اسپرم قرار می‌گیرد. بنابراین فعالیت PHGPX در اسپرم بالغ در مقایسه با سایر رده‌های بلوغی کاهش می‌یابد (26). علاوه بر این، آنزیم GPX-4 از طریق حذف ROS، بیوسنتز لکوترینها، انتقال سیگنال‌های القا شده توسط IL-1 و آپوپتوز را تعدیل می‌کند (39-36). مطالعات مختلف نشان داده است که فرم هسته‌ای PHGPX با استفاده از گروه‌های تیول پروتامین موجود در هسته به عنوان اکی والان احیا به متراکم شدن کروماتین و بلوغ نهائی اسپرم کمک می‌کند (31،36،37). با توجه به نقش‌های متعدد این آنزیم در روند اسپرماتوژنز و عملکردهای اسپرم، مطالعات متعددی ارتباط بین آنزیم PHGPX در اسپرم بالغ را با پارامترهای مایع منی بررسی نموده‌اند؛ به طوریکه در اسپرم افراد نابارور نسبت به افراد بارور مقدار آنزیم PHGPX کمتر بوده و همراه با کاهش فعالیت این آنزیم، حرکت و غلظت اسپرمی نیز کاهش یافته و تغییرات مورفولوژیک در آنها افزایش می‌یابد (27). علاوه براین نارسایی در بیان ژن آنزیم PHGPX میتوکندریایی اسپرم ممکن است یکی از علل اولیگوآستنواسپرمی مردان نابارور باشد (37). مطالعات کروموزومی نشان می‌دهد که ژن PHGPX در ناحیه 19P13.3 قرار داشته و با طول Kb8/2 از 7 اگزون تشکیل شده است (38). در شکل 1 ساختار ژن gpx-4 و جهش‌های جایگاه‌های 6+ و 17+ و 1725+ و نقاط شروع رونویسی از فرم‌های میتوکندریایی، سیتوپلاسمی و هسته‌ای آنزیم‌های حاصل از این ژن نشان داده شده‌است (39).

در برخی از مطالعات وجود جهش‌هایی در توالی ژن gpx-4 گزارش شده است (39). از طرف دیگر مطالعه‌ای نیز بروز اولیگوآستنواسپرمی را با کاهش سطح بیان PHGPX در اسپرم این افراد مرتبط دانسته است؛ ولی ارتباطی بین سطوح بیان ژن آنزیم PHGPX با نوع جهش‌‌های این افراد مشاهده نگردیده است؛ زیرا وجود این جهشها در مردان کنترل بارور نیز مشاهده گردیده است (40).

با توجه به طیف گسترده عملکردهای آنزیم PHGPX در اسپرم شامل نقش آنتی‌اکسیدانی آن در یک طرف طیف تا نقش ساختاری آن در سیتواسکلتون اسپرم و عملکرد آن در مورفولوژی اسپرم در طرف دیگر طیف و نیز با توجه به بررسی‌های محدودی که تاکنون در زمینه بررسی این آنزیم در سطح ژن انجام گرفته است هدف این مطالعه بررسی جهش‌‌های شناخته شدة این ژن در مردان نابارور با عامل فاکتور مردانه و بررسی ارتباط بین جهش‌‌های این ژن با پارامترهای اسپرمی این افراد بود.

روش بررسی

در این تحقیق از مردان مراجعه کننده به بخش آندرولوژی مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینای تهران بعد از اخذ رضایت‌نامه آگاهانه برای شرکت در مطالعه نمونة منی (به جز افراد کنترل بارور که حداقل صاحب یک فرزند بوده و به صورت تصادفی از یک مرکز تحقیقات دانشگاهی انتخاب شدند) و حدود ml5 خون تهیه شد و نمونه‌های خون به لوله‌‌های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA منتقل شد. نمونه‌ها تا زمان استخراج DNA در دمای C20- نگهداری شدند. افراد مورد مطالعه شامل مردانی بودند که به علت ناباروری جهت انجام اسپرموگرام به آزمایشگاه آندرولوژی مراجعه‌ نموده بودند و نیز به مدت 7-2 روز پرهیز جنسی داشتند. اسپرموگرام براساس شرایط استاندارد و معیارهای WHO (1999) انجام گرفت (41). میانگین ± انحراف معیار پارامترهای اسپرمی این افراد با برنامه SPSS ویرایش13 محاسبه شد. در این میان افراد مبتلا به لکوسیتواسپرمی که دارای /ml 1061WBC> بودند یا علت اختلال در اسپرموگرام آنها موارد شناخته شده‌ای نظیر واریکوسل ، کریپتوارکیدیسم و ... بود از مطالعه حذف شدند.

استخراج DNA ژنومی: DNA نمونه‌های خونی توسط روش Salting out از گلبول‌های سفید مطابق روش Miller و همکاران استخراج گردید (42) و لوله‌‌های حاوی DNA تا زمان انجام واکنش PCR در دمای C20- نگهداری شد. پس از بررسی کمی و کیفی DNA استخراج شده با روش اسپکتروفوتومتری و استفاده از ژل آگاروز 1%، تکثیر دو بخش از ژن GPX-4 به روش PCR انجام گردید.

انجام واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR) : جهت انجام PCR و تشخیص جهش در دو جایگاه 6+ (CT) و 17+ (A  G) از ژن GPX-4 (accession AC004151) یک جفت پرایمر با توالی زیر طراحی شد:

F: 5-AACAAGTCCGCACGTCCGGT -3

R: 5-AAAGGCGGCCGAGGCTCATC-3

این پرایمرها می‌توانند یک توالی نوکلئوتیدی به طول 237bp را در اگزون 1A از ژن GPX-4 تکثیر کنند. واکنش PCR بعد از انجام بهینه‌سازی در لوله‌‌های ml2/0 با حجم نهایی l25 حاوی مواد زیر با غلظت نهایی پرایمر به میزانpmol/l 4/0، dNTPs به میزان mM4/0، Taq DNA polymerase به میزانU/l 4/0، MgCl2 به میزان mM 5/1، DNA حدود ng 100 و نهایتاً بافر PCR x10 به میزان l 5/2 انجام شد.

تمامی مواد مورد استفاده (به جز پرایمرها که از شرکت تکاپوزیست‌ـ ایران تهیه گردید) از شرکت Roche آلمان تهیه شد. برای واکنش PCR از دستگاه ترموسایکر گرادیان (Eppendorf, Germany) استفاده گردید و شرایط دمای سیکلها پس از بهینه‌سازی به‌شرح‌ذیل بود:

1. مرحله واسرشت ابتدایی 5 دقیقه در دمای C94 (یک سیکل)

2. مرحله واسرشت،30 ثانیه در دمای C94

3. مرحله اتصال ،30 ثانیه در دمای C5/63

4. مرحله طویل‌سازی ،30 ثانیه در دمای C72 (مراحل 2 تا 4، 35 سیکل تکرار شد)

5. مرحله واسرشت نهایی، 7 دقیقه در دمای C72 (یک سیکل).

از طرف دیگر جهت تشخیص جهش در جایگاه 1725+ (GA) از ژن gpx-4 نیز یک جفت پرایمر با توالی زیر طراحی شد:

F: 5-ACAGGAGCCAGGGAGTAACG -3

R: 5- TGCCCTTGCCCTTGGGTTGG -3

این پرایمرها می‌توانند یک توالی نوکلئوتیدی به طول bp148 را در اگزون شمارة 4 از این ژن تکثیر کنند.

در مورد این پرایمر نیز حجم نهایی واکنش PCR l25 ‌بود و غلظت نهایی مواد بعد از انجام بهینه‌سازی شامل پرایمر به میزان pmol/l 1/0، dNTPs به میزان mM 4/0، Taq DNA polymerase به میزان U/l4/0، MgCl2 به میزانmM 5/1، DNA حدود ng 100، بافر PCR x10 به میزان l5/2 بود. شرایط دمای سیکلها نیز مانند موارد قبلی بود به استثناء دمای مرحلة اتصال که در مورد این جفت پرایمر 30 ثانیه در دمای C 8/54 انتخاب شد. کنترل صحت تکثیر PCR با استفاده از کنترل منفی بررسی گردید.

انجام RFLP : برای اطمینان از انجام عمل تکثیر، محصولات تکثیر شده با دو جفت پرایمر روی ژل آگاروز 5/1% الکتروفورز گردید (ولتاژ V98) و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید. پس از اطمینان از صحت انجام PCR در مرحله بعد l5 از این محصولات با l10 محلول حاوی آنزیم های restriction endonuclease MWOI (به غلظت نهایی U/ml150)، PShAI (به غلظت نهایی U/ml300) و SatI(به غلظت نهاییU/ml300) انکوبه شد. آنزیم‌های استفاده شده توسط برنامه Webcutter (Carolina Biological: Biotechnology and Genetic, Webcutter) انتخاب شدند که در مورد بررسی دو جایگاه 6+ و 17+ از آنزیم‌های MWOI و PShAI (Biolabs, New England) و در مورد بررسی جایگاه 1725+ از آنزیم SatI (FSP4HI) (Fermentas, Italy) استفاده شد (در مورد MWOI و SatI از دمای انکوبه نمودن C37 و در مورد PShAI از دمای C25 به صورت انکوبه نمودن در طول شب استفاده شد).

انجام الکتروفورز: محصولات حاصل از هضم آنزیمی به همراه محصولات PCR و مارکرهای وزن مولکولی روی ژل پلی‌اکریل آمید 10% با بافر TAE و ولتاژ V200 الکتروفورز گردید. پس از انجام الکتروفورز و رنگ‌آمیزی ژل به روش نیترات نقره، تصویرهای حاصل از الگوی باندها توسط دستگاه scanner و transluminator تهیه و ذخیره گردید. براساس این نتایج در مورد جایگاه‌های 6+ و 17+ نتیجه PCR یک قطعه bp237 بود که در صورت وجود جهش در جایگاه‌های 6+ و 17+، آنزیم‌های MWOI و PShAI نمی‌توانند این قطعه را ببرند و در صورت عدم وجود جهش در ناحیه 6+ آنزیم MWOI قطعه bp237 را به قطعات bp151 و bp86 تبدیل می‌کند. در صورت عدم وجود جهش در جایگاه 17+ آنزیم PShAI قطعه bp237را به قطعات bp161 و bp76 تبدیل می‌کند. درمورد بررسی جایگاه 1725+ (GA) نتیجه PCR یک قطعه bp148 است که در صورت وجود جهش در جایگاه 1725 آنزیم SatI نمی‌تواند این قطعه را ببرد و در صورت عدم وجود جهش در این جایگاه قطعه bp148 به قطعات bp108 و bp40 تبدیل می‌شود.

نتایج

در این مطالعه تعداد 128 مرد مورد بررسی قرار گرفتند. از این تعداد 74 نفر با ناباروری به علت فاکتور مردانه و پارامترهای اسپرمی معیوب شامل 33 نفر اولیگوآستنوتراتواسپرمی (OAT) ،22 نفر اولیگوتراتواسپرمی (OT) ،10 نفر آستنوتراتواسپرمی (AT) و 9 نفر تراتواسپرمی (T) ، 18نفر نورمواسپرمی (N) و 36 نفر افراد کنترل بارور بودند. مردان کنترل بارور حداقل صاحب یک فرزند بودند و به صورت تصادفی از یک مرکز تحقیقات دانشگاهی انتخاب شدند. لازم به ذکر است که مردان کنترل به دلیل اینکه مشکلات باروری نداشتند حاضر به دادن نمونة منی نشده و فقط نمونه خون از آنها گرفته شد. جدول 1 نتایج پارامترهای اسپرمی افراد را در گروه‌های مختلف نشان می‌دهد.

در اشکال 2 و 3 به ترتیب محصولات PCR حاصل از جایگاه‌های مورد نظر از ژن gpx-4 بر روی ژل آگاروز 5/1% و نیز نتایج RFLP این محصولات PCR روی ژل پلی آکریل آمید (رنگ‌آمیزی نیترات نقره) نشان داده شده ‌است.

همانطور که در باندهای شمارة 4 ، 5 و6 از شکل 3 مشاهده می‌شود قطعه bp237 حاوی جایگاه‌های 17+ و 6+ در صورت وجود جهش در جایگاه‌های ذکر شده توسط آنزیم‌های MWOI و PShAI بریده نمی‌شود. در صورت عدم وجود جهش در جایگاه 6+ (CT) آنزیم MWOI این قطعه را به قطعات bp151 و bp86 و در صورت عدم وجود جهش در جایگاه 17+ (GA) آنزیم PShAI این قطعه را به قطعات bp161 و bp76 تبدیل می‌کند. در بررسی هضم آنزیمی قطعه bp237 افراد مورد مطالعه، این قطعه توسط دو آنزیم MWOI و PShAI بریده شد که این نشان دهنده عدم وجود جهش در جایگاه‌های 6+ و 17+ در تمام افراد مورد مطالعه است. در بررسی هضم آنزیمی قطعه bp148 حاوی جایگاه 1725+ (GA) (باند شمارة 3 و 2) در صورت وجود جهش در جایگاه 1725 این قطعه توسط آنزیم SatI بریده نمی‌شود ودر صورت عدم وجود جهش در این جایگاه این قطعه به قطعات bp108 و bp40 تبدیل می‌شود.

در بررسی هضم آنزیمی قطعه bp148 در تمام افراد مورد مطالعه، این قطعه توسط آنزیم SatI بریده شد که این نشان دهندة عدم وجود جهش در جایگاه 1725+ است.

بحث

بررسی مطالعات مختلف بر روی ژن gpx-4 نشان می‌دهد که در مردان سالم و بارور و نیز در مردان نابارور این ژن به مقدار زیادی متغیر است و SNPs ، حذف قطعات ژن و اضافه شدن طول ژن در موارد متعددی در آن مشاهده شده است. از 23 جهش شناسایی شده در ژن gpx-4 تعداد 11 جهش فقط در مردان نابارور گزارش شده است (39). تعداد 4 جهش از 11 جهش با پارامترهای باروری دخیل با فعالیت ژن gpx-4 ارتباطی نداشتند؛ زیرا این 4 جهش به طور هموزیگوت در مردان بارور سالم نیز مشاهده می‌شود. سایر جهشها نیز (6 جهش) در اینترون وجود داشته و یا تغییر در سومین باز کدون می‌باشند و در نتیجه کدون تغییریافته نیز همان اسید آمینه اولیه را در ساختار آنزیم کد می‌کند؛ لذا بر روی توالی آنزیم PHGPX بی‌تأثیر هستند به همین دلیل نقش این جهشها نیز در ناباروری بحث انگیز است؛ زیرا علیرغم عدم تغییر در توالی آنزیم، هیچیک از این 6 جهش در مردان بارور مشاهده نگردیده است و این خود یک نکته قابل توجه و تحقیق بیشتر می‌باشد. جهش‌‌های 6+ و 17+ انتخابی در این مطالعه جزء این دسته می‌باشند. جهش در جایگاه (GA) 1725+ دارای اهمیت خاصی است؛ زیرا منجر به تغییر اسید آمینه آلانین (Ala) شمارة 93 به اسید آمینه ترئونین (Thr) در ساختار آنزیم PHGPX می‌شود. بررسیها نشان داده است که تغییر اسید آمینه Ala شماره 93 به Thr در هومولوگ gpx-4 انسانی در خوک منجر به کاهش فعالیت این آنزیم شده است (39،43). بنابراین در مطالعه حاضر از 11 جهش مشخص شده، 3 جهش (CT) 6+، (GA) 17+ و (CA) 1725+ به دلیل اینکه نقش آنها در ناباروری مردان نامعلوم، ولی همانطور که ذکر شد دارای اهمیت خاصی می‌باشد، مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که در هیچ یک از افراد مورد مطالعه این سه جهش وجود ندارد؛ لذا می‌توان اینگونه نتیجه‌گیری کرد که وجود این سه جهش در ژن gpx-4 با توجه به تعداد افراد بررسی شده با اتیولوژی اختلال در پارامترهای اسپرمی (اولیگوآستنوتراتواسپرمی، اولیگوتراتو-اسپرمی، آستنوتراتواسپرمی و تراتواسپرمی) در ارتباط نیست. البته این بدان معنا نیست که وجود جهش در ژن gpx-4 نمی‌تواند منجر به ایجاد اختلال در پارامترهای اسپرم گردد؛ زیرا در صورت وجود جهش بسته به نوع و جایگاه آن (نزدیک بودن به جایگاه فعال آنزیم و نیز تغییر اسید آمینه در ساختار آنزیم PHGPX) ممکن است بیان ژن gpx-4 و یا فعالیت آنزیم کاهش یابد و در نتیجه منجر به اختلال در روند اسپرماتوژنز و در نتیجه ناباروری مردان شود. Diaconu و همکاران نشان دادند که وجود جهش در ژن gpx-4 با کاهش بیان این ژن در بیماران اولیگوآستنواسپرمی ارتباط ندارد (40). زیرا جهش‌‌های مشخص شده در مردان اولیگوآستنو-اسپرمی با کاهش بیان ژن gpx-4 در افراد کنترل بارور نیز مشاهده گردید. فرضیه‌ای که مطرح بوده و بررسی آن ضرورت دارد این است که در صورت وجود جهش در ژن gpx-4 ممکن است روی بیان این ژن اثر گذاشته و یا بدون اثر روی بیان این ژن روی فعالیت آنزیم PHGPX اثر بگذارد. لذا بهتر این است که ابتدا فعالیت PHGPX در مردان نابارور با پارامترهای اسپرمی معیوب اندازه‌گیری شده و سپس در بیماران با کاهش فعالیت PHGPX ژن gpx-4 آنها تعیین توالی گردد. البته روش اندازه‌گیری PHGPX بر خلاف سایر فرم‌های آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز مشکل‌تر است؛ زیرا نیاز به فسفولیپیدهای پرواکسید به عنوان سوبسترا (فسفاتیدیل کولین هیدروپراکسید) می‌باشد و نیز قبل از اندازه‌گیری فعالیت آنزیم باید فرم غیرفعال آنزیم (دارای اتصال سلنودی سولفید) ابتدا فعال گردد (27). دو مطالعه‌ای که تاکنون در زمینه تعیین توالی ژن gpx-4 انجام شده است و نیز این مطالعه نشان داد که جهشها در ژن gpx-4 از جامعه‌ای به جامعه دیگر متفاوت‌ است؛ لذا برای شناسائی نقش جهش نواحی مختلف ژن gpx-4 در عملکرد آنزیم، نیاز به تعیین توالی این ژن در مردان نابارور ایرانی می‌باشد. از طرف دیگر علاوه بر وجود جهش‌های متعدد در ژن gpx-4بیوسنتز آنزیم PHGPX در بیضه ممکن است توسط فاکتورهای متعددی شامل کمبود شدید سلنیم، مسمومیت بوسیله فلزات سنیگن (44) و تحریکات هورمونی (29) تحت تأثیر قرار ‌گیرد. علاوه براین برای بیان عدم ارتباط بین جهش‌‌های یک ژن و اتیولوژی یک بیماری و نیز تعیین شیوع جهش‌‌های یک ژن نیاز به بررسی تعداد زیادتری از بیماران و افراد سالم کنترل می‌باشد و با بررسی تعداد محدودی از مردان نمی‌توان نتایج قطعی و دقیقی را بدست آورد و آن را به جامعه تعمیم داد و لذا ممکن است با بررسی تعداد بیشتری از مردان با پارامترهای اسپرمی معیوب و تعیین توالی ژن gpx-4 در این افراد نتایج متفاوتی حاصل شود. همچنین در اینگونه مطالعات برای بیان قطعی وجود یا عدم وجود ارتباط فعالیت ژن با بیماری نیاز به تعیین توالی ژن و شناسائی تمامی نقایص یا جهشها می‌باشد؛ زیرا همانطوری که در مورد بسیاری از بیماریها مشاهده می‌شود جهشها با توجه ساختارهای جمعیتی متفاوت می‌باشد. از طرف دیگر با توجه به اینکه مطالعاتی در زمینه ارتباط بین پلی‌‌مورفسیم ژن Polg (ژن کد کنندة آنزیمDNA polymerase gamma) و اولیگوآستنواسپرمی گزارش شده (45) و نیز مجاورت ژن POLR2E (DNA- directed RNA Polymerase II) با ژن gpx-4 بر روی کروموزوم 19و ارتباط عملکردی دو آنزیم DNA polymerase gamma و DNA- directed RNA Polymerase II (به ترتیب دخیل در همانند سازی DNA و رونویسی از ژن) ممکن است بین ژن POLR2E وآنزیم حاصل از آن با ژن gpx-4 و نهایتاً ناباروری ارتباط وجود داشته باشد. لذا بررسی ارتباط بین ژن POLR2E (جهشها، بیان ژنی و فعالیت آنزیم) و ژن gpx-4 و ناباروری ممکن است به مشخص شدن علت موارد ایدیوپاتیک ناباروری کمک نماید. علت تأکید بر روی جهش‌‌های ژنتیکی به عنوان عامل اختلال در پارامترهای اسپرمی افراد، مشخص شدن علت موارد آیدیوپاتیک ناباروری می‌باشد. لذا هدف تحقیقات آینده بررسی جهشها در ژن gpx-4 (تعیین توالی) و ارتباط آنها با بیان این ژن و فعالیت آنزیم PHGPX و نیز طراحی روشی ساده برای اندازه‌گیری فعالیت این آنزیم خواهد بود.

نتیجه‌گیری

در مجموع با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه و دو مطالعه دیگر در زمینه جهشها و بیان ژنgpx-4 اینگونه می‌توان نتیجه‌گیری نمود که شیوع این جهشها در ژنgpx-4 پایین بوده و نمی‌تواند به عنوان یکی از عوامل شایع در اختلالات پارامترهای اسپرمی مردان نابارور محسوب شود و با توجه به نتایج بدست آمده لزوماً شیوع این جهشها باید بیشتر از 1 در 128 بیمار باشد؛ لذا برای تعیین شیوع جهش‌‌های این ژن نیاز به بررسی تعداد زیادتری از بیماران می‌باشد. از طرف دیگر اندازه‌گیری فعالیت آنزیم PHGPX در مردان نابارور ایرانی با پارامترهای اسپرمی معیوب و ارتباط آن با بیان ژن gpx-4 و بررسی جهش‌های ژن gpx-4 (تعیین توالی) می‌تواند این مساله را بیشتر روشن نماید.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از همکاران محترم گروه بیوشیمی بالینی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، گروه آندرولوژی و گروه ژنتیک پژوهشکدة فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌‌ـ ابن‌سینا و پرسنل محترم مرکز درمان ناباروری ابن‌سینا برای همکاری صمیمانه در اجرای این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.

  1. Sharma RK, Agarwal A. Role of reactive oxygen species in male infertility. Urology. 1996;48(6):835-50
  2. Hull MG, Glazener CM, Kelly NJ, Conway DI, Foster PA, Hinton RA Coulson C, Lambert PA, Watt EM, Desai KM. Population study of causes, treatment, and outcome of infertility. Br Med J. 1985;291:1693-7
  3. Jones Mann T, Sherins R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal effect of acid peroxides and protective action of semi-nal plasma. Fertil Steril. 1979;31:531-7
  4. Aitken RJ. The Amoroso Lecture. The human sperma-tozoon-a cell in crisis?J Reprod Fertil.1999;115(1):1-7
  5. Sharma RK, Garwal AA. Reactive oxygen species and male infertility. Urology. 1996;48:835-50
  6. Aitken RJ. Molecular mechanisms regulating human sperm function. Mol Hum Reprod. 1997;3(3):169-73
  7. Alvarez JG, Touchstone JC, Blasco L, Storey BT. Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human sperma-tozoa. Superoxide dismutase as major enzyme protect-tant against oxygen toxicity. J Androl. 1987;8(5):338-48
  8. Aitken RJ, Clarkson JS, Fishel S. Generation of reac-tive oxygen species, lipid peroxidation, and human sperm function. Biol Reprod. 1989;41(1):183-97
  9. Alvarez JG, Storey BT. Spontaneous lipid peroxidation in rabbit epididymal spermatozoa: its effect on sperm motility. Biol Reprod. 1982;27(5):1102-8
  10. Aitken RJ, Buckingham D, West K, Wu FC, Zikopou-los K, Richardson DW. Differential contribution of leucocytes and spermatozoa to the generation of reac-tive oxygen species in the ejaculates of oligo-zoospermic patients and fertile donors. J Reprod Fertil. 1992;94(2):451-62
  11. de Lamirande E, Gagnon C. Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between bene-ficial and detrimental effects. Hum Reprod. 1995;10 Suppl 1:15-21
  12. Alkan I, Simsek F, Haklar G, Kervancioglu E, Ozveri H, Yalcin S, et al. Reactive oxygen species production by the spermatozoa of patients with idiopathic inferti-lity: relationship to seminal plasma antioxidants. J Urol. 1997;157(1):140-3
  13. Lewis SE, Boyle PM, McKinney KA, Young IS, Thompson W. Total antioxidant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men. Fertil Steril. 1995;64(4):868-70
  14. Fraga CG, Motchnik PA, Shigenaga MK, Helbock HJ, Jacob RA, Ames BN. Ascorbic acid protects against endogenous oxidative DNA damage in human sperm. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(24):11003-6
  15. Zini A, de Lamirande E, Gagnon C. Reactive oxygen species in semen of infertile patients: levels of super-oxide dismutase- and catalase-like activities in seminal plasma and spermatozoa. Int J Androl. 1993;16(3):183-8
  16. Peeker R, Abramsson L, Marklund SL. Superoxide dismutase isoenzymes in human seminal plasma and spermatozoa. Mol Hum Reprod. 1997;3(12):1061-6
  17. Tramer F, Rocco F, Micali F, Sandri G, Panfili E. Antioxidant systems in rat epididymal spermatozoa. Biol Reprod. 1998;59(4):753-8
  18. Alvarez JG, Storey BT. Role of glutathione peroxidase in protecting mammalian spermatozoa from loss of motility caused by spontaneous lipid peroxidation. Gamete res. 1989;23(1):77-90
  19. Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of indivi-dual glutathione peroxidases. Free Rad Biol Med. 1999;27(9-10):951-65
  20. Kuhn H, Borchert A. Regulation of enzymatic lipid pe-roxidation: the interplay of peroxidizing and peroxide reducing enzymes. Free Rad Biol Med. 2002;33(2): 154-72
  21. Hall L, Williams K, Perry AC, Frayne J, Jury JA. The majority of human glutathione peroxidase type 5 (GPX5) transcripts are incorrectly spliced: implications for the role of GPX5 in the male reproductive tract. Biochem J. 1998;333 ( Pt 1):5-9
  22. Fujii T, Endo T, Fujii J, Taniguchi N. Differential expression of glutathione reductase and cytosolic gluta-thione peroxidase, GPX1, in developing rat lungs and kidneys. Free Rad Res. 2002;36(10):1041-9
  23. Fujii J, Iuchi Y, Matsuki S, Ishii T. Cooperative func-tion of antioxidant and redox systems against oxidative stress in male reproductive tissues. Asian J Androl. 2003;5(3):231-42
  24. Ursini F, Maiorino M, Valente M, Ferri L, Gregolin C. Purification from pig liver of a protein which pro-tects liposomes and biomembranes from peroxidative degradation and exhibits glutathione peroxidase active-ty on phosphatidylcholine hydroperoxides Biochimica et Biophysica Acta. 1982;710:197-211
  25. Ho YS, Magnenat JL, Bronson RT, Cao J, Gargano M, Sugawara M, et al. Mice deficient in cellular gluta-thione peroxidase develop normally and show no increased sensitivity to hyperoxia. J Biol Chem. 1997; 272(26):16644-51
  26. Ursini F, Heim S, Kiess M, Maiorino M, Roveri A, Wissing J, et al. Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation. Science. 1999;285 (5432):1393-6
  27. Foresta C, Flohe L, Garolla A, Roveri A, Ursini F, Maiorino M. Male fertility is linked to the selenopro-tein phospholipid hydroperoxide glutathione peroxi-dase. Biol Reprod. 2002;67(3):967-71
  28. Maiorino M, Coassin M, Roveri A, Ursini F. Micro-somal lipid peroxidation: effect of vitamin E and its functional interactions with phospholipid hydro-peroxide glutathione peroxidase. Lipids. 1989;24:721-6
  29. Roveri A, Casasco A, Maiorino M, Dalan P, Calligaro A, Ursini F. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase of rat testis. Gonadotropin dependence and immunocytochemical identification. J Biol Chem.1992; 267(9):6142-6
  30. Pushpa-Rekha TR, Burdsall AL, Oleksa LM, Chisolm GM, Driscoll DM. Rat phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase. cDNA cloning and identify-cation of multiple transcription and translation start sites. J Biol Chem. 1995;270(45):26993-9
  31. Pfeifer H, Conrad M, Roethlein D, Kyriakopoulos A, Brielmeier M, Bornkamm GW, et al. Identification of a specific sperm nuclei selenoenzyme necessary for protamine thiol cross-linking during sperm maturation. Faseb J. 2001;15(7):1236-8
  32. Maiorino MWJ, Brigelius-Flohe´ R, Calabrese F, Roveri A,, Steinert P UF, Flohe´ L. Testosterone mediates expression of the selenoprotein PHGPx by induction of spermatogenesis and not by direct trans-criptional gene activation Faseb J. 1998;12:1359-70
  33. Nam SY, Fujisawa M, Kim JS, Kurohmaru M, Haya-shi Y. Expression pattern of phospholipid hydro-peroxide glutathione peroxidase messenger ribonucleic acid in mouse testis. Biol Reprod. 1998;58(5):1272-6
  34. Bauche F, Fouchard MH, Jegou B. Antioxidant system in rat testicular cells. FEBS Lett. 1994;349(3):392-6
  35. Shalgi R, Seligman J, Kosower NS. Dynamics of the thiol status of rat spermatozoa during maturation: ana-lysis with the fluorescent labeling agent monobro-mobimane. Biol Reprod. 1989;40(5):1037-45
  36. Godeas C, Tramer F, Micali F, Roveri A, Maiorino M, Nisii C, et al. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) in rat testis nuclei is bound to chromatin. Biochem Mol Med. 1996;59(2):118-24
  37. Imai H, Suzuki K, Ishizaka K, Ichinose S, Oshima H, Okayasu I, et al. Failure of the expression of phos-pholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in the spermatozoa of human infertile males. Biol Reprod. 2001;64(2):674-83
  38. Kelner MJ, Montoya MA. Structural organization of the human selenium-dependent phospholipid hydro-peroxide glutathione peroxidase gene (GPX4): chro-mosomal localization to 19p13.3. Biochem Biophysic Res Communicat. 1998;249(1):53-5
  39. Maiorino M, Bosello V, Ursini F, Foresta C, Garolla A, Scapin M, et al. Genetic variations of gpx-4 and male infertility in humans. Biol Reprod. 2003;68(4): 1134-41
  40. Diaconu M, Tangat Y, Bohm D, Kuhn H, Michelmann HW, Schreiber G, et al. Failure of phospholipid hydro-peroxide glutathione peroxidase expression in oligo-asthenozoospermia and mutations in the PHGPx gene. Andrologia. 2006;38(4):152-7
  41. Organisation WH. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th Edition. Cambridge, United Kingdom: University Press. 1999
  42. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucle-ated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):1215
  43. Maiorino M, Aumann KD, Brigelius-Flohe R, Doria D, van den Heuvel J, McCarthy J, et al. Probing the presumed catalytic triad of selenium-containing peroxi-dases by mutational analysis of phospholipid hydro-peroxide glutathione peroxidase (PHGPx). Biol Chem Hoppe Seyler. 1995;376(11):651-60
  44. Gailer J, George GN, Pickering IJ, Madden S, Prince RC, Yu EY, et al. Structural basis of the antagonism between inorganic mercury and selenium in mammals. Chem Res Toxicol. 2000;13(11):1135-42
  45. Rovio AT, Marchington DR, Donat S, Schuppe HC, Abel J, Fritsche E, et al. Mutations at the mitochondrial DNA polymerase (POLG) locus associated with male infertility. Nat Genet. 2001;29(3):261-2
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 7, Issue 3
Autumn 2006
Pages 198-208