لقاح، فرایندی چند عاملی است که با ورود اسپرم به تخمک شروع می‌شود. ورود اسپرم به‌داخل تخمک سه نقش مهم به ترتیب شامل: انتقال ژنوم پدری، تعیین جنسیت جنین و فعال‌سازی تخمک را ایفا می‌کند. فعال‌سازی تخمک تحت تأثیر فاکتورهای اسپرمی فعال کننده تخمک (SAOAFs) صورت می‌گیرد. تحقیقات نشان داده است که این فاکتور در ارتباط با آکروزوم و غلاف خلف آکروزومی (تکای پری نوکلئار) اسپرم می‌باشد (1). با ورود اسپرم به‌داخل تخمک و آزادسازی این فاکتور، کلسیم از رتیکولوم اندوپلاسمی به‌صورت زنجیره‌ای از نوسانات مکرر آزاد می‌شود. این نوسانات 4-3 ساعت وگاهی تا 20 ساعت با فرکانس‌های خاصی ادامه یافته و هنگام تشکیل پیش هسته‌ها متوقف می‌شود (3،2). علی‌رغم تزریق اسپرم به‌داخل تخمک در روش تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم (ICSI) میانگین درصد لقاح در این بیماران بین 70-60% گزارش شده است (4). تصاویر میکروسکوپ الکترونی در اسپرم‌های دارای سرگرد نشان می‌دهد که احتمالاً کاهش لقاح در اینگونه نمونه‌ها به علت عدم وجود آکروزوم و مخصوصاً غلاف خلف آکروزومی در ارتباط می‌باشد که در نهایت منجر به فعال نشدن تخمک می‌گردد (6،5). به‌علاوه، عدم موفقیت در لقاح را می‌توان به نقایص آکروزومی و محتویات آکروزین نسبت داد (7). بنابراین اینگونه اسپرمها نه تنها قابلیت نفوذ به تخمک را ندارند، بلکه فاکتورهای فعال کننده تخمک در ارتباط با آکروزوم و غلاف خلف آکروزومی (تکای پری نوکلئار) در آنها ناقص است (9،8). با توجه به اهمیت این موضوع، به جز چند گزارش تزریق اسپرم به تخمک موش جهت بررسی قدرت فعال‌سازی تخمک، آزمونی برای اندازه‌گیری SAOAFs در این مطالعات یافت نشد و از آنجایی که SAOAFs در غلاف خلف آکروزومی قرار دارد و این غلاف در ارتباط مستقیم با آکروزوم است، لذا این مطالعه با بررسی سلامت آکروزوم به روش آزمون ژلاتینولیز به‌طور غیرمستقیم، تأثیر آن را بر لقاح بررسی نموده است (10).
در طی روند ICSI، انتخاب اسپرم براساس مورفولوژی و تحرک آنها صورت می‌گیرد. همچنین شایان ذکر است که در طی سال‌های گذشته، مطالعات متعددی در زمینه فعالیت آکروزین و مورفولوژی اسپرم گزارش شده و مشخص گردیده است که بین مورفولوژی آکروزوم طبیعی (درصد اشکال طبیعی) با فعالیت آکروزین رابطه وجود دارد (11). برخی معتقدند مرفولوژی آکروزوم حساسیت بیشتری نسبت به مرفولوژی سر اسپرم در پیشگویی لقاح آزمایشگاهی دارد (13،12)؛ در حالیکه عده‌ای معتقدند، ارزیابی شاخص‌های آکروزومی نمی‌تواند به‌طور صحیح میزان لقاح را مشخص نماید (14). بنابراین اندازه آکروزوم می‌تواند نقش مهمی در تعیین مورفولوژی طبیعی در لقاح آزمایشگاهی (IVF) داشته باشد (15). لذا هدف از این مطالعه بررسی تأثیر فعالیت آکروزین براساس آزمون ژلاتینولیز به‌عنوان شاخص سلامت آکروزوم و توانایی اسپرم در فعال ساختن تخمک و مورفولوژی اسپرم براساسStrict criteria بر روی میزان لقاح در بیماران کاندید ICSI می‌باشد.
1. آماده سازی اسپرم: نمونه‌های مایع منی از 68 زوج نابارور مراجعه‌کننده به مرکز باروری و ناباروری اصفهان از مهرماه سال 1384 تا اردیبهشت ماه 1385 جهت انجام ICSI جمع‌آوری شد. مایع منی در روز تخمک‌گذاری، پس از 4-3 روز پرهیز از مقاربت آماده گردید. بخشی از نمونه‌های منی جهت آنالیز پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری و براساس معیار WHO بررسی شد (15) و بخش اعظم آن با استفاده از دوگرادیان غلظتی Pure Sperm (80:40) (Nidacone,Gothenburg Sweden) جهت انجام ICSI آماده گردید (16). لازم به‌ذکر است تمامی مواد مصرفی در این مطالعه بجز موارد اشاره شده در متن از شرکت سیگما (USA) تهیه گردید.
2. تزریق اسپرم به درون سیتوپلاسم تخمک: بعد از تخمک‌گیری، تخمکها در محیط G-MOPS که حاوی هیالورونیداز است، قرار داده شد. سپس تخمکها در G-MOPS تازه شسته شده و به زیر روغن در داخل یک پتری‌دیش (Falcon, BD) برای میکرواینجکشن منتقل گردیدند. به‌علاوه اسپرم شسته شده به محیط ICSI 100 (محیطی غلیظ جهت تسهیل کار برای اسپرم) منتقل گردید.
از میکرومانیپلاتور اپندروف نصب شده روی میکروسکوپ اینورت (Nikon) برای تزریق اسپرم استفاده شد. بدین ترتیب اسپرم با بهترین مورفولوژی و تحرک از جمعیت اسپرمی انتخاب شده و پس از بی‌حرکت شدن، اسپرم به‌داخل یک پیپت تزریق، کشیده شد و سپس به‌داخل تخمک تزریق گردید. تزریق معمولاً 3-2 ساعت پس از جمع‌آوری تخمکها صورت می‌گرفت. تخمکهای تزریق شده در محیط G1 انکوبه شدند. پس از 18-16 ساعت، میزان لقاح براساس وجود یا عدم وجود تشکیل پرونوکلئوسها در هر گروه تعیین گردید. در ضمن زیگوت‌هایی که دارای PN 1 و PN3 یا بیشتر بودند، از این مطالعه حذف شدند. به‌علاوه در این مطالعه بیمارانی که دارای تخمکهای وزیکول ژرمینال، دژنره، گرانولار، بدون جسم قطبی و واکوئله یا دفرمه بودند، حذف شدند تا تأثیر فاکتورهای تخمکی در مطالعه به حداقل ممکن برسد. درصد لقاح براساس تعداد تخمکهای لقاح یافته نسبت به کل تخمکهای تزریق شده محاسبه شد. تمامی بیماران انتخابی برای این مطالعه حداقل دارای چهار تخمک بالغ بودند که فرآیند ICSI را به سلامت گذراندند. شایان ذکر است تمامی محیط‌های مورد استفاده در میکرواینجکشن محصول شرکت Vitrolife سوئد بود.
3. تست ژلاتینولیز: فعالیت آکروزین به‌عنوان شاخص سلامت آکروزوم توسط تست ژلاتینولیز ارزیابی شد (17). براساس این تست l20 از ژلاتین 5% بر روی اسلایدها کشیده شده، سپس در هوای خشک و در دمای C4 به مدت یک شب نگهداری گردید. بعد از آن اسلایدها با گلوتارآلدیید 05/0% (Merck, Germany) فیکس و دو بار با PBS شستشو داده شدند. l20 مایع منی شستشو شده با نسبت 1:10 در PBS حاوی mM7/15 گلوکز، رقیق گردید و اسمیری از این اسپرم بر روی اسلایدهای پوشید شده توسط ژلاتین، تهیه و در محیط مرطوب در دمای C37 به مدت 2 ساعت انکوبه شد. برای هر نمونه 200 اسپرم شمارش و درصد اسپرم‌های دارای هاله و قطر آنها (بر حسب میکرومتر) با استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست و توسط نرم‌افزار Olysia (Olympus, Japan) محاسبه گردید. بدین ترتیب که پس از تصویر برداری، قطر هاله‌ها براساس میکرومتر مشخص و در جدول Olysia ثبت شد. سپس میانگین آنها توسط این نرم‌افزار محاسبه گردید (شکل 1).
4. بررسی مورفولوژی اسپرم: مورفولوژی اسپرم براساس Strict criteria مورد ارزیابی قرار گرفت (18). بر این اساس، نمونه‌های سیمن شستشو داده شده، با استفاده از تکنیک پاپانیکولا رنگ‌آمیزی گردید.
آنالیز مورفولوژی اسپرم شامل ارزیابی اندازه سر اسپرم، شکل و محیط در برگیرنده آکروزومی می‌باشد. در این مطالعه اسپرم‌هایی طبیعی در نظر گرفته شد که دارای سربیضی با محیطی صاف، طولی معادل mµ5-4، قطری برابر با mµ5/3-5/2، آکروزوم 70-40% اندازه سر اسپرم و فاقد آنومالی در ناحیه گردن و دم بود. اگر قطرات سیتوپلاسمی بیشتر از 30% اندازه سر اسپرم باشد، اسپرم غیرطبیعی محسوب می‌شود.
مورفولوژی آکروزوم اسپرم براساس ویژگی‌های اندازه و شکل بوسیله میکروسکوپ نوری ارزیابی گردید. آکروزومی نرمال محسوب می‌گردد که شکلی بیضی با محیطی صاف داشته باشد و اندازه آکروزوم آن بین70-40% سر اسپرم باشد. اگر آکروزوم کمتر از 30% و یا بیشتر از 70% باشد، به ترتیب به‌عنوان موارد غیرطبیعی شامل: آکروزوم کوچک و آکروزوم بزرگ در نظر گرفته می‌شود (11). برای هر نمونه حداقل 200 اسپرم شمارش شد.
آنالیز آماری: آنالیز داده‌ها با استفاده از آزمون آماری ضریب همبستگی و محاسبه شاخص‌های توصیفی توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 5/11 انجام گرفت و در صورتی که 05/0p-value< بود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.
نمونه‌های مایع منی از 68 زوج نابارور مراجعه کننده به مرکز باروری و ناباروری اصفهان کاندیدای انجام ICSI دریافت شد. میانگین سن مردان مورد مطالعه 5/4±34 سال و همسران آنها 7/4±30 سال بود. نتایج حاصل از ارزیابی پارامترهای اسپرم، تست ژلاتینولیز و میزان لقاح در جدول 1 نشان داده شده است. میزان لقاح در این مطالعه بین 100-0 و میانگین آن 05/26±58/69 است. در این مطالعه حداقل غلظت اسپرم 5 میلیون در هر میلی‌لیتر بود.
مورفولوژی اسپرم بر طبق Strict criteria و معیارهای WHO سنجیده شد. درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم بین 66-2% بود. وضعیت آکروزوم برای هر اسپرم به‌صورت طبیعی، کوچک و بزرگ گروه‌بندی گردید. در این مطالعه متوسط درصد آکروزوم طبیعی 99/88/76، آکروزوم کوچک 11/995/19 و آکروزوم بزرگ 40/325/3 بود.
فعالیت آکروزین براساس تست ژلاتینولیز ارزیابی شد و براساس آن میانگین قطر هاله و درصد تشکیل هاله مورد بررسی قرار گرفت. از لحاظ آماری بین میانگین قطر هاله با غلظت اسپرم، مورفولوژی غیرطبیعی (WHO)، تحرک، میزان لقاح و درصد تشکیل هاله رابطة معنی‌داری بدست آمد (02/0p<). همچنین از لحاظ آماری رابطة معنی‌داری بین درصد تشکیل هاله با مورفولوژی طبیعی (WHO) وجود داشت (032/0p<)، اما با سایر پارامترها رابطه معنی‌داری یافت نشد. به‌علاوه در این مطالعه رابطه معنی‌داری بین مورفولوژی غیر طبیعی (WHO) با میزان لقاح پس از ICSI مشاهده شد (024/0p<). در صورتی که بین مورفولوژی اسپرم براساس Strict criteria با درصد تشکیل هاله، میانگین قطر هاله و میزان لقاح رابطه‌ای وجود نداشت (جدول2).
تحقیقات نشان داده است که تزریق اسپرم به‌داخل تخمکی که در متافاز II است به تنهایی جهت لقاح و تـکامـل جنیـن کافی نیست و فاکتورهای دیگری از جمله سلامت غشاء اسپرم، کیفیت کروماتین، مورفولوژی اسپرم تزریق شده و قدرت فعال‌سازی تخمک در این امر تأثیر دارند (19). اگرچه بیشتر از 80% تخمکهای لقاح نیافته بعد از ICSI حاوی اسپرماتوزوا می‌باشند، ولی عدم لقاح در این تخمکها را می‌توان به عدم توانایی تخمک در انجام یکسری وقایع بیوشیمیائی متوالی که جهت فعال شدن تخمک لازم است، نسبت داد (20). عدم توانایی فعال شدن تخمک در ارتباط با فاکتورهای اسپرمی، تخمکی و یا هر دو می‌تواند باشد. در مطالعة حاضر فاکتورهای تخمکی که ممکن است بر فعال شدن تخمک تأثیر داشته باشند، با استفاده از به کارگیری پروتکلی یکسان جهت تحریک تخمک‌گذاری به حداقل رسانیده شد. همچنین در مواردی که کیفیت تخمک نامناسب و یا درصد تخمکهای نارس بالا بود، آنها از مطالعه حذف گردیدند.
عدم موفقیت در لقاح را می‌توان به فاکتورهای اسپرمی که شامل مورفولوژی اسپرم و نقایص آکروزومی اسپرم است، نسبت داد (24-21). آکروزوم و غلاف خلف آکروزومی یا تکای پری نوکلئار، به‌طور همزمان در اواخر اسپرمیوژنز تشکیل می‌شود (25). به‌علاوه فقدان Oscilin، Ca2+ و یا عدم حضور آکروزین در اسپرم‌هایی با سر گرد گزارش شده است (26). فعالیت آکروزین به‌عنوان شاخص سلامت آکروزوم مطرح می‌باشد. این تست بر پایه توانایی آنزیم‌های آکروزومی برای هیدرولیز کردن پروتئین‌های با وزن مولکولی بالا شبیه ژلاتین است (27).
Henkelو همکارانش در سال1995 نشان دادند که میزان فعالیت آکروزین با استفاده از آزمون ژلاتینولیز (میانگین قطر هاله) با میزان لقاح در روش IVF ارتباط دارد (17). همچنین در این مطالعه رابطة معنی‌داری بین میانگین قطر هاله و میزان لقاح (02/0=p، 27/0=r) به دست آمد. اما رابطه‌ای بین درصد تشکیل هاله و میزان لقاح نشان داده نشد. این نتایج بیانگر این موضوع است که نمونه‌های اسپرمی با فعالیت آکروزین بالا، شانس بیشتری را در القای فعال شدن تخمک و در نهایت افزایش میزا ن لقاح دارند. از طرف دیگر، اسپرم با فعالیت آکروزین بالا می‌تواند با مقدار مناسبی از فعالیت SAOAFs باعث القای طبیعی فعال شدن تخمک و در نهایت لقاح گردد (8،24،27، 7). در واقع عدم مشاهده رابطه معنی‌دار بین درصد تشکیل هاله و میزان لقاح در این مطالعه می‌تواند ناشی از این مطلب باشد که در طی انجام ICSI، معمولاً اسپرم با آکروزوم طبیعی انتخاب می‌شود و اسپرم‌هایی که دارای آکروزوم کوچک هستند، شانس لقاح کمتری دارند. در این بررسی از بین پارامترهای مورد مطالعه، رابطه‌ای بین درصد آکروزوم طبیعی، آکروزوم کوچک و آکروزوم بزرگ با میزان لقاح بعد از ICSI مشاهده نشد. این موضوع احتمالاً به‌دلیل انتخاب معیار مورفولوژی در ICSI است. Kruger و همکاران گزارش نمودند که مورفولوژی اسپرم خصوصاً مورفولوژی آکروزوم و توانایی آن در اتصال به زونا معیار خوبی جهت پیشگویی میزان موفقیت در لقاح می‌باشد (18). همچنین در این مطالعه رابطه‌ای بین درصد اندازه آکروزوم کوچک با میانگین قطر هاله و درصد تشکیل هاله مشاهده شد؛ اما از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (09/0=p، 073/0=p). در این مطالعه، بین مورفولوژی طبیعی اسپرم که مطابق معیار WHO سنجیده شد، با درصد تشکیل هاله و میانگین قطر هاله از لحاظ آماری ارتباط معنی‌داری مشاهده شد، ولی بر طبق ارزیابی با Strict criteria و بین مورفولوژی اسپرم و درصد تشکیل هاله و میانگین قطر هاله رابطه‌ای بدست نیامد. که می‌تواند ناشی از این مطلب باشد که در طی ارزیابی مورفولوژی براساس Strict criteria، اسپرم با ناهنجاری‌‌های جزئی مانند عدم قرارگیری دم در امتداد محور سر به‌عنوان غیرطبیعی در نظر گرفته شده است و در طی مراحل ICSI ، به‌علت عدم توانایی تشخیص نقایص جزیی مورفولوژی اسپرم، یک تخمک می‌تواند با اسپرمی که از لحاظ آکروزوم، طبیعی ولی دارای سر آمورف جزیی است، لقاح یابد.El- Ghobashy و همکاران در سال 2003 نشان دادند که ارزیابی همزمان مرفولوژی سر اسپرم، اندازه آکروزوم، وجود واکوئل‌های آکروزومی و توانایی انجام واکنش آکروزومی در پیشگویی میزان موفقیت در نتایج لقاح به‌طریق IVF اهمیت دارد (12).
اگرچه در فرآیند لقاح طی انجام ICSI، از دست دادن محتویات آکروزوم به‌عنوان یک امتیاز محسوب می‌شود؛ ولیکن وجود غلاف خلف آکروزومی که در مجاورت آکروزوم سالم و حاوی SAOAFs است، لازمه لقاح می‌باشد (10). بر این اساس در مطالعات اخیر Bartoov و همکاران مشاهده شد که با استفاده از سیستم تصویربرداری مخصوص، در طی ICSI بین مورفولوژی اسپرم‌های تزریق شده با میزان موفقیت در لقاح رابطه معنی‌داری وجود دارد. همچنین مشخص شد که طبیعی بودن مورفولوژی هسته اسپرم (سر) نه تنها با افزایش میزان موفقیت در لقاح بلکه در افزایش میزان حاملگی هم موثر است (29).
از آنجایی که ساختار غلاف آکروزومی در ارتباط با ساختار آکروزومی است، نتایج حاصل از این مطالعه حاکی از آن است که کاهش فعالیت آکروزین و اندازه آکروزوم با عدم موفقیت در لقاح ارتباط دارد. اگرچه انتخاب اسپرم جهت تزریق براساس تحرک و مورفولوژی است ولی در مجموع چنین می‌توان استنباط نمود که نمونه‌هایی که دارای درصد بالایی از آکروزوم کوچک و یا فعالیت آکروزین (میانگین قطر هاله و درصد تشکیل هاله) آنها پایین است، میزانSAOAFs یا قدرت فعال‌سازی تخمک در آنها پایین می‌باشد که این امر منجر به کاهش میزان لقاح می‌گردد. حتی در اینگونه نمونه‌ها اگر اسپرم دارای آکروزوم با اندازه طبیعی جهت تزریق استفاده شود به علت پایین بودن سطح SAOAFs در آن، همچنان شانس موفقیت در لقاح پایین خواهد بود.
بدینوسیله از همکاری متخصصین زنان و زایمان و پرسنل آزمایشگاه نازایی مرکز باروری و ناباروری اصفهان و نیز از همکاری مسئولین پژوهشکده رویان اصفهان و دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان که زمینه اجرای این تحقیق را فراهم آوردند تقدیر و تشکر می‌گردد. کلیه هزینه‌های مصرفی و غیرمصرفی این تحقیق از بودجه تحقیقاتی پژوهشکده رویان جهاد دانشگاهی تأمین گردیده است.
