سلولهای بنیادی جنینی از رشد و تکثیر و عدم تمایز توده سلولی داخلی جنین در مرحله بلاستوسیست بدست می‌آیند. این سلولها همه توان بوده و توانایی تولید هر سه رده اکتودرمی، مزودرمی و اندودرمی جنینی را دارند (1). این سلولها می‌توانند دو سرنوشت مجزا و متفاوت، همه توانی یا تمایز را انتخاب کنند که این انتخاب بستگی به تحریکات داخل سلولی و یا موجود در محیط کشت این سلولها دارد. به عبارتی سلولهای بنیادی جنینی در محیط کشت اختصاصی خود در شرایط in-vitro قدرت تقسیم مجدد خود را برای دوره‌های طولانی حفظ می‌کنند و به طور مکرر تکثیر می‌یابند. در عین حال این سلولها تحت شرایط فیزیولوژیکی خاص به انواع سلولهای با عملکردهای تخصصی نظیر سلولهای عضله قلبی، سلولهای مولد انسولین، سلولهای عصبی، فیبروبلاست، عضله اسکلتی، صاف و یا انواع سلولهای دیگر تمایز می‌یابند (4-2).
برای حفظ همه توانی و تکثیر مجدد، بدون انجام تمایز سلولهای بنیادی جنینی بر روی فیبروبلاست غیرفعال شده جنین موش یا با افزودن فاکتورهای مهارکننده تمایز از جمله فاکتور مهارکننده لوکوسیتها LIF به محیط آنها تکثیر می‌یابد (5-2). LIF موجود در محیط به عنوان یک سیتوکین از طریق رسپتور سطح سلولی خود موجب سنتز فاکتور رونویسی oct-4 و حفظ همه توانی و تکثیر مجدد سلولها می‌شود. با حذف این سیتوکین از محیط و یا حذف فیبروبلاست‌های جنینی، تشکیل اجسام جنینی از سلولهای بنیادی شروع می‌شود (6). به طور معمول بین 1 تا 4 روز بعد از کشت هر جسم جنینی، سلولهای بنیادی به انواع مشتقات سلولی مشابه با آنچه که در سه لایه جنینی اولیه یافت می‌شود، تمایز می‌یابند. نوع تمایز این سلولها بستگی به انواع فاکتورهای محیطی دارد که سلول با آنها مواجه می‌باشد. بسته به شرایط محیط برخی از این سلولها به کاردیومیوسیتها تمایز می‌یابند که در نهایت در جنین عضله قلبی را ایجاد می‌کنند (7).
از جمله مشکلاتی که امروزه جامعه انسانی با آن مواجه است بیماری‌های قلبی‌ـ عروقی است. در مشکلات ایسکمیک عضله قلب سلولها دچار آسیب شده و در عملکرد طبیعی کاردیومیوسیت‌های اختلال ایجاد شده و از آنجایی که کاردیومیوسیت‌های بالغ قادر به بازسازی و ترمیم خود نیستند، میزان مرگ و میر این بیماریها فوق‌العاده زیاد است؛ لذا یافتن مخزن سلولی در دسترس که بتواند در صورت نیاز به کاردیومیوسیت متمایز شود و به محل آسیب تزریق شود تحولی شگرف را در درمان این بیماران فراهم خواهد نمود. از اینرو تمایز سلولهای بنیادی جنینی به کاردیومیوسیتها یکی از تحقیقات مهم و به روز بوده و از اهمیت خاصی برخوردار است (7). در اکثر مطالعات انجام شده اجسام جنینی حاصل از سلولهای بنیادی در حضور سرم محیط و شرایط قطره‌گذاری تمایز می‌یابند که این به نوعی تمایز خود به خودی و غیرمستقیم محسوب می‌شود و انواعی از سلولهای تمایز یافته در آن ظاهر می‌شود که در میان آنها کاردیومیوسیت‌های ضربان‌دار هم دیده می‌شود (9-7). با توجه به عدم خلوص این سلولها و تمایز همزمان به سایر رده‌های سلولی این کاردیومیوسیتها به منظور پیوند و سلول تراپی مناسب نیستند، بدین منظور نیاز به سلولهای تمایز یافته خالص است که عاری از سایر رده‌های سلولی باشد (10-8). بنابراین انتخاب شرایط محیطی و فاکتورها و عواملی که بتوانند موجب تمایز جهت‌دار و مستقیم شود همواره مدنظر محققان در این حیطه بوده و تحقیقات گسترده‌ای در این زمینه در حال انجام است.
در این راستا نقش فاکتورهای رشد در محیط in vivo در طی مراحل تمایزی سلولهای مزودرمی به سلولهای کاردیومیوسیت در دوران جنینی کاملاً شناخته و ثابت شده است. از اینرو بکارگیری این فاکتورها می‌تواند در تهیه رده سلولی کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته با درجه خلوص بالا و نیز کاردیومیوسیت‌های اختصاصی‌تر مانند سلولهای دهلیزی، بطنی و نیز گره‌ای مورد استفاده قرار گیرد. از جمله این فاکتورهای اولیه می‌توان به TGF-β2 و BMP-2 دو فاکتور از خانواده بزرگ فاکتورهای رشد TGF-β اشاره کرد که در القای مزودرم کاردیاک و تمایز کاردیومیوسیتها از آنها و نیز تنظیم رشد، تمایز و مهاجرت در طی رشد و نمو جنین اهمیت دارند.
در شرایط in-vitro تخریب مسیرهای سیگنال TGF-β/BMP بوسیله آنتاگونیست‌هایی مانند noggin تمایز کاردیاک را از سلولهای بنیادی جنینی مهار می‌کند (11). موش‌های فاقد TGF-β2 عملکردی از ناهنجاری‌های قلبی‌ـ عروقی رنج می برند (12). بدین ترتیب نقش فاکتورهای رشد خانواده TGF- در رشد و تمایز سلولهای کاردیومیت کاملاً به اثبات رسیده است. لذا هدف این مطالعه بررسی اثر افزودن فاکتورهای رشد TGF-β2 وBMP-2 در القای تمایز سلولهای بنیادی جنینی به کاردیومیوسیتها در محیط in vitro می‌باشد.
الف) کشت فیبروبلاست‌های غیرفعال: فیبروبلاست جنینی از جنینی‌های 13-12 روزه موش‌های BALB/C تهیه شدند. بدین منظور جنین 12 الی13 روزه از رحم موش ماده خارج و پس از ضد عفونی با الکل سر، دم و بافت‌های کبد و قلب آن جدا گردید، سپس باقیمانده بدن جنین قطعه قطعه شده و همراه با آنزیم تریپسین در دمای C4 در یخچال به مدت 24 ساعت نگهداری شود. بعد از زمان ذکر شده مخلوط جنینها و آنزیم از سرنگ عبور داده شود و پس از طی 60-30 دقیقه و رسوب قطعات بافتی، مایع رویی آن جمع‌آوری گردید و در مقادیر کم به پلیت‌های کشت سلولی ژلاتینه شده حاوی محیط کشت فیبروبلاست، (MEF medium) شامل DMEM همراه با 10% سرم جنین گاوی (FCS)، ml1 –L گلوتامین mM200، ml1 اسید آمینه غیر ضروری (mM200)، μl200 بتا مرکاپتو اتانول (2ME) mM50 (تمامی مواد محصول شرکت Gibco آلمان بود) ml1 پنی‌سیلین/ استرپتومایسین (100x) اضافه گردید و در انکوباتور CO2 به میزان 5% و دمای C37 قرار گرفت. بعد از 24 ساعت فیبروبلاست‌های دوکی شکل به کف پلیت چسبیده‌اند. به منظور غیرفعال کردن فیبروبلاستها محیط کشت پلیت حاوی فیبروبلاست با تراکم بالای سلولی با محیط DMEM حاوی میتومایسین‌ـC به میزان μg/ml10 (Sigma,USA) تعویض شده و پلیت به مدت 3 ساعت در انکوباتور CO2 به میزان 5% و دمای C37 قرار گرفت. بعد از طی این مدت محیط حاوی میتومایسین را خارج و دور ریخته و پلیت 3 مرتبه با PBS شسته شد، سپس اتصال سلولها با کف پلیت کشت بوسیله واکنش آنزیمی تریپسین جدا گردید. بعد از سانتریفیوژ با دور g1300 به مدت 5دقیقه، رسوب سلولی به پلیت ژلاتینه شده، حاوی محیط MEF اضافه شده و در انکوباتور نگهداری گردید تا برای کشت سلولهای بنیادی جنینی بکار رود (شکل1-1).
ب) کشت سلولهای بنیادی جنینی: سلولهای بنیادی جنینی CCB (129/sv xy CCB ES cell line) حاصل از رشد توده سلولی داخلی بلاستوسیست جنین موش‌های نژاد 129، بر روی یک لایه فیبروبلاست جنینی موشی غیرفعال شده به عنوان سلولهای پشتیبان، کشت شدند. محیط کشت این سلولها شامل KnockOut DMEM حاوی FCS به میزان 15%،ml 1Lـ گلوتامین mM200، ml1 اسیدهای آمینه غیر ضروری Mm200، μl200 بتا مرکاپتو اتانول (2ME) (50mM) و μl10 فاکتور LIF, 1000U/ml) LIF Chemicon) بود (تمام مواد مورد استفاده از شرکت Gibco آلمان تهیه شد). ضمن تعویض روزانه محیط کشت سلولی و بررسی رشد کلونیها توسط میکروسکوپ معکوس، کلونیها هر 3-2 روز یکبار با تریپسین جدا شده و پاساژ داده شدند تا کلونیها همچنان کوچک و تمایز نیافته بمانند (شکل1-1).
ج) تشکیل اجسام جنینی وتمایز کاردیومیوسیتها: به منظور بررسی اثر فاکتورهای TGF-β2 و2 BMP- سه گروه تجربی و یک گروه کنترل درنظر گرفته شد.
در گروه تجربی کلونی‌های سلولهای بنیادی با محیط تمایزی حاوی FCS و فاکتورهای فوق به مدت 24 ساعت و در گروه کنترل نیز کلونی‌های سلولهای بنیادی در محیط مشابه فاقد فاکتور حاوی سرم کشت داده شدند. محیط تمایزی شامل GMEM(Gibco, Germany) حاوی FCS به میزان 5/7%، ml1 اسید آمینه‌های غیر ضروری mM200 (Gibco, Germany)، μl 200 بتاـ مرکاپتو اتانول (Gibco, Germany, 50mM, 2ME)، mg/ml110 سدیم‌ـ پیرووات و ng/ml8 TGF-β2 (Sigma,USA) در یک گروه تجربی و یا g/ml5 BMP-2 (Sigma,USA) در گروه دیگر تجربی و یا هر دو فاکتور در گروه آخر بود. پس از آن 800 سلول بنیادی جنینی از هر سه گروه به صورت مجزا در قطرات 20 میکرولیتری از همان محیط به صورت معلق در درب پلیت کشت باکتری به مدت 2 روز کشت شدند تا اجسام جنینی تشکیل شود (شکل2-1). سپس اجسام جنینی به صورت سوسپانسیون در پلیت دیگری به مدت 5 روز نگهداری شدند. در تمام این مدت سلولها با محیط حاوی فاکتورهای فوق تغذیه شدند. اجسام جنینی 7 روزه به صورت ده تایی در ظروف 12 حفره‌ای کشت شدند. به منظور بررسی و تأیید تمایز سلولهای بنیادی جنینی به سلولهای مزانشیمی کاردیومیوسیت از روش‌های مختلفی شامل بررسی مولکولی بیان ژن‌های تخصصی کاردیومیوسیتها به روش RT-PCR و نیز بررسی پروتئین‌های دسمین و آلفاـ آکتینین با ایمنوهیستوشیمی و Western-blot استفاده شد.
د) بیان ژن‌های تخصصی قلبی با RT-PCR: به منظور ارزیابی بیان ژن‌های اختصاصی سلولهای کاردیومیوسیت از روش RT-RCR استفاده شد. جهت استخـراج RNA از سلولهای تمایز یافته حاصل از کشت اجسام جنینی پس از 12 و 16 روز از شروع کشت و انجام عمل تمایز، عمـل استخراج RNA با روش Guanidium Thiocyanate- Phenol- Chlorophorm انجام گرفت. در این روش ابتدا به رسوب سلولی حاصله از سلولهای تمایز یافته حدود μl500 از RNA-Bee افزوده تا عمل لیز سلولها انجام شود، سپس یک سوم حجم آن کلروفرم اضافه کرده و بعد از چند دقیقه با دور rpm 1200 به مدت min10 سانتریفیوژ گردید، پس از این مرحله دو فاز شفاف و فنلی جدا گردید، سپس فاز رویی را جدا کرده و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد افزوده و 2 ساعت در C20- نگهداری گردید. سپس با دور rpm1500 به مدت min12 سانتریفیوژ گردید، رسوب RNA در این مرحله قابل رویت است (در تمامی مراحل نمونه بر روی یخ نگهداری شود) با استفاده از پرایمر الیگو dT و آنزیم RT (Fermentas) cDNAاز RNA استخراجی ساخته شد. سپس برای تکثیر cDNA مربوط به ژن‌های اختصاصی سلولهای کاردیومیوسیت با استفاده از زوج‌های پرایمرهای مربوط به هر ژن، عمل PCR انجام شد. پرایمرهای مورد استفاده شامل:
1ـ mGAPDH (bp309 و دمای C60و30 سیکل)
F-5′-CAGGGGCGAGACCCCACTA-3′
R-5′- GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′
2ـ Oct-4 (bp312و دمای C62 و 35 سیکل)
F-5′-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTG TTC-3′
R-5′-CTCGAACCACATCCTTCTCT-3′
3ـ Brachyury (bp111 و دمای C60 و 35 سیکل)
F-5′-GACTTCGTGACGGCTGACAA-3′
R-5′-CGAGTCTGGGTGGATGTAG-3′
4ـ NKX2.5 (bp150 و دمای C64 و 35 سیکل)
F-5′-CATTTTACCCGGGAGCCTACGGTG-3′
R-5′-GCTTCCGTCGCCGCCGTG-3′
5ـ MEF-2 (bp196 و دمای C64 و 35 سیکل)
F-5′-AGATACCCACAACACACCACGCGCC3′
R-5′-ATCCTTCAGAGAGTCGCATGCGCTT-3′
6ـ α-MHC (bp301 و دمای C64 و 35 سیکل)
F-5′-CTGCTGGAGAGGTTATTCCTCG-3′
R-5′-GGAAGAGTGAGCGGCGCATCA AGG-3′
7ـ β-MHC (bp 205 و دمای C64 و 35 سیکل)
F-5′-TGCAAAGGCTCCAGGTCTGAG GGC-3′
R-5′-GCCAACACCAACCTGTCC AAG TTC-3′
8ـ ANF (bp 203 و دمای C68 و 35 سیکل)
F- 5′-TGATAGATGAAGGCAGGAAGCCGC-3′
R-5′-GGATTGGAGCCCAGAGTGGACTAGG-3′
9ـ MLC-2v (bp 189 و دمای C68 و 35 سیکل)
F-5′-TGTGGGTCACCTGAGGCTGTGGTTCAG-3′
R-5′-GAAGGCTGACTATGTCCGGGAGATGC-3′
محصولات PCR فوق بر روی ژل آگاروز 2% به روش الکتروفورز جدا و با اتیدیوم بروماید رنگ شده و محل باندهای قابل مشاهده در مقایسه با کنترل‌های مثبت و منفی با دستگاه U.V Transluminator تمامی باندهای حاصله با مارکر bp 100 سنجیده شد.
ه) بررسی حضور پروتئین دسمین وآلفا اکتینین به روش Western blot: اجسام جنینی که درون حفرات پلیت کشت شده بودند در روز 16 تمایز بوسیله تریپسین جدا شده و پس از سانتریفوژ به آن l500 از محلول بافر نمونه شامل mg4/0 Bromophenol Blue و μl500 Tris-HCl M5/0 (8/6pH=)، ml8/0 SDS(10%) و نیز ml4/0 گلیسرول (50%) وml 3/0 آب مقطر افزوده تا عمل لیز سلولی تسهیل گردد. سپس میکروتیوب حاوی نمونه به مدت 5/1 دقیقه در آب در حال جوش قرار گرفت و پس از سانتریفیوژ به هر چاهک الکتروفورز به میزان lμ40 از سوسپانسیون سلولی اضافه گردید. از هر نمونه در دو چاهک به طور قرینه ریخته شده تا بتوان ژل حاصل را به دو قسمت مساوی تقسیم نمود. پس از انجام الکتروفورز نیمی از ژل رنگ‌آمیزی گردید و نیم دیگری از ژل در مجاورت کاغذ PVDF قرار گرفته تا باندهای جدا شده روی ژل به روش Electroelution به کاغذ منتقل گردد. جهت تأیید انتقال، کاغذ PVDF را با Ponso-S رنگ‌آمیزی شد. سپس با BSA یا Skim-milk (بلاکینگ) جایگاه‌های فعال سطح کاغذ غیرفعال گردید در این مرحله می‌توان کاغذ را برای بررسی بعدی در C20- نگهداری کرد، در ادامه کار کاغذ حاوی باندها با آنتی‌بادی اولیه ضد دسمین و آنتی‌بادی اولیه ضد آلفاـ اکتینین به طور جداگانه انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو نمونه‌ها با TPBS، نوارها با آنتی‌بادی ثانویه Rabbit Anti Mouse IgG کونژوگه با HRP انکوبه شده و مجدداً 3 بار دیگر با TPBS شسته و جهت مشخص شدن باند پروتئینی مورد نظر نوارهای کاغذی را به تانک حاوی سوبسترای نامحلول HRP انتقال داده شد. بعد از 10 دقیقه انکوباسیون نوارها در سوبسترا، باند مربوط با ایجاد رنگ قهوه‌ای تیره و رسوب آن در ناحیه باند پروتئینی شناسایی و با انتقال نوارها به درون بافر PBS واکنش رنگ‌زایی متوقف گردید. با توجه به ناپایداری رنگ ایجاد شده، سریعاً از نمونه‌ها عکس تهیه گردید.
و) بررسی حضور پروتئین دسمین با روش ایمنوهیستوشیمی: در مرحله تمایز، اجسام جنینی که به روی Coverslip ژلاتینه در حفرات پلیت 12 حفره‌ای منتقل شده بودند، چسبیده و ضمن تمایز به اطراف گسترده شده‌اند. 7 روز بعد از کشت اجسام جنینی، Coverslip توسط پنس از حفره خارج و با PBS 2 بار شسته شدند و سپس حدود 2 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند تا در مجاورت هوا خشک شوند. پس از آن توسط چسب بر روی لام شیشه‌ای چسبانده و به مدت 5 دقیقه در استن سرد C20- نگهداری شد تا تثبیت شوند. سپس سه مرتبه و هر بار به مدت 5 دقیقه با بافر شستشو و پس از آن با سرم خرگوش10% به مدت 10 دقیقه پوشانده شدند. لامها با آنتی‌بادی‌های اولیه ضد دسمین (Sigma,USA) با رقت 1:20 در دمای C37 به مدت 5/1 ساعت انکوبه شدند. پس از شستشوی مجدد مانند مرحله قبل، لامها با آنتی‌بادی ضدایمونوگلوبولین موشی کونژوگه با HRP (پژوهشکده ابن‌سینا) به نسبت 1:50 در دمای C37 به مدت 45 دقیقه انکوبه شدند. سپس مرحله شستشو مطابق قبل تکرار و محلولDAB (Sigma,USA) آماده بر روی اسلایدها اضافه گردید. پس از 15-5 دقیقه اسلایدها سه بار با آب شسته شده و 2-1 دقیقه با هموتوکسیلین رنگ‌آمیزی زمینه شدند در انتها به‌مدت 5 دقیقه در گزیلول قرار داده شد و پس از مانته کردن و با میکروسکوپ نوری مشاهده شدند.
الف) تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای بنیادی جنینی: در مراحل این روش ابتدا سلولهای بنیادی جنینی رده CCB انتخاب و به صورت کلونی بر روی فیبروبلاست کشت داده شدند (شکل1ـ ب)، برای تأیید همه توان بودن عدم تمایز این سلولها بیان ژن oct-4 بررسی شد (شکل 1ـ الف). بعد از اینکه کلونیها در معرض محیط کشت تمایزی حاوی فاکتورها و سرم 5/7 % قرار گرفتند بیان ژن Brachyury توسط RT-PCR نیمه کمی در روز پنجم بررسی شد. افزایش بیان این ژن در سلولهای تمایز یافته تحت تأثیر فاکتورها در مقایسه با گروه کنترل نشان داد که افزودن فاکتورهای فوق موجب افزایش القا ژن‌های مزودرمی در سلولهای بنیادی می‌گردد. سپس در ادامه کلونی‌های سلولهای بنیادی به صورت تک سلولی درآمده و در قطرات معلق با تعداد 800 سلول قرار گرفتند. تعداد اولیه سلولهای بنیادی در تمایز نهایی بسیار مهم است (شکل 2ـ الف). پس از تشکیل اجسام جنینی در قطرات معلق (2 روز) و سوسپانسیون (5 روز) به تدریج اجسام جنینی بدون چسبندگی به ظرف با اطراف نامنظم بزرگتر شده (شکل2ـ ب) و در ادامه در روز هفتم به پلیت‌های کشت سلولی ژلاتینه شده، انتقال داده شدند. اجسام جنینی به کف پلیت چسبیده و به تدریج سلولهای اطراف آنها ضمن تغییر شکل، مهاجرت کرده و از آن دور می‌شوند (شکل 2ـ ج). در روزهای متفاوتی این سلولها بررسی شدند، کاردیومیوسیت‌های ضربان دار 1 تا 2 روز پس از کشت به صورت پراکنده در اطراف هر جسم جنینی در هر سه گروه تیمار شده باng/ml 8 TGF-β2و ng/ml5 BMP-2 و هر دو فاکتور همزمان و نیز در گروه کنترل با نسبت‌های متفاوت ظاهر شدند. به منظور مقایسه بین این فاکتورها بیان ژن‌های تخصصی قلبی بررسی شد. همچنین اطلاعات ما نشان داد که فاکتورهای رشد ذکر شده موجب افزایش معنی‌داری در اندازه جسم جنینی یا افزایش قطر آنها در مقایسه با گروه کنترل نمی‌شود (05/0p<).
ب) بیان ژن‌های تخصصی قلبی در کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته از سلولهای بنیادی جنینی: افزایش بیان ژن‌های تخصصی قلبی ANF, α-MHC, β-MHC, NKx2.5, MEF-2 وmMLC-2v در کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته با روش RT-PCR نشان داد که ضمن افزایش بیان ژن مزودرمی Brachyury در اجسام جنینی تیمار شده با TGF-β2 و BMP-2، در گروه تیمار شده با هر دو فاکتور بیشترین بیان ژن‌های تخصصی قلبی وجود دارد. در مقایسه بین فاکتورها اثر تمایزی فاکتور TGF-β2 بر تمایز سلولهای بنیادی به کاردیومیوسیتها بیشتر از اثر تمایزی فاکتور BMP-2 و اثر هر دو فاکتور به صورت همزمان بیشتر از دو گروه قبلی موجب افزایش تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای بنیادی جنینی شده است (شکل3).
این افزایش توسط اندازه‌گیری مقایسه‌ای باندهای حاصله از بیان ژن‌های مشابه در کاردیومیوسیت تمایز یافته در محیط کشت‌های متفاوت به تأیید رسید.
ج) بررسی پروتئین‌های تخصصی قلبی در کاردیومیو-سیت‌های تمایز یافته از سلولهای بنیادی جنینی: بررسی حضور این پروتئینها در گروه تیمار شده با فاکتور و مقایسه آن با کاردیومیوسیت‌های قلب موش نوزاد (شکل 4) تائیدی بر حضور کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته از سلولهای بنیادی جنینی است.
در نمونه‌های تهیه شده از اجسام جنینی تمایزیافته که با روش ایمنوهیستوشیمی رنگ‌آمیزی شدند، کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته به صورت دوکی، چند وجهی و حتی کروی دیده شدند. در نمونه‌های تمایزیافته روز دوازدهم پروتئین دسمین با آرایش ابتدایی دیده شدند (شکل 5).
امروزه انتخاب شرایط بهینه برای تمایز هدایت شدة سلولهای بنیادی جنینی یکی از مباحث اصلی تحقیقات در حیطة سلولهای بنیادی است و در این میان تولید کاردیومیوسیت‌های قلب از سلولهای بنیادی جنینی کاربردهای بسیار گسترده مانند بررسی جزییات روند تمایزی و استفاده در جهت بازسازی میوکارد آسیب دیده دارد. پیوند سلولهای بنیادی به قلب آسیب دیده نشان داده که سلولهای بنیادی توانایی محدودی در بازسازی بافت دارند. بررسی تمایز کاردیومیوسیتها اولین بار توسط Doetschman در سال 1985 (2) و سپس توسط Wobus در سال 1991 (8) و Maltsev در سال 1993 (13) انجام شده است (21).
در اکثر تحقیقات، روند تمایز سلولهای بنیادی به صورت خودبخود بررسی شده است. بدین منظور که دور کردن فاکتورهای مهارکننده تمایز و تشکیل جسم جنینی در محیط‌های سوسپانسیونی و افزایش سرم کشت سلول که حاوی پروتئینها و فاکتورهای رشد بسیاری می‌باشد موجب تمایز خودبخودی سلولهای بنیادی به انواع سلولها مانند کاردیومیوسیتها شده است. پس از تمایز کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته جدا و از لحاظ روند ژنتیکی و مرفولوژیک از جمله حضور پروتئینها و فاکتورهای تأیید کننده مورد بررسی قرار گرفته‌اند. اما این سلولها برای پیوند کافی و مناسب نیستند (14).
از اینرو شناسایی فاکتورهای رشد مناسب به منظور افزایش تمایز کاردیومیوسیتها از سلولهای بنیادی جنینی و تهیه کاردیومیوسیت‌های خالص به منظور انجام سلول تراپی لازم می‌باشد. بررسی روند تکوین و تحقیقات مختلف نشان داده که فاکتورهای رشد و تمایز یک نقش مهم در تعیین سرنوشت رده سلولی مشتق شده از سلولهای بنیادی جنینی دارد. به طور مثال IL-3 در تمایز سلولهای بنیادی جنینی به ماکروفاژ، ماستوسیت و نوتروفیل نقش دارد (12).
نتایج ما نشان داد که تیمار سلولهای بنیادی در مرحله کشت و اجسام جنینی، همزمان با دو فاکتورTGF-β2 و BMP-2حتی در صورت کاهش سرم که خود یک عامل تمایز دهنده می‌باشد موجب ایجاد کاردیومیوسیتها و بیان بالایی از ژن‌های خاص قلبی می‌شود. همچنین کاردیومیوسیتها با مارکر پروتئینی تخصصی قلبی دسمین رنگ‌آمیزی شدند و نتایج Western blot هم تعیین کرد که فاکتورهای فوق موجب بیان پروتئین‌های تخصصی قلبی دسمین و آلفل‌ـ آکتینین شده است. در این مطالعه بر خلاف مطالعات قبلی (13،12، 3) اولاً غلظت سرم محیط کشت کاهش یافت تا اثر تمایزی پروتئینها و فاکتورهای رشد آن حذف شود، از اینرو تمایز کاردیومیوسیت‌های حاصله به حضور فاکتورهای رشد اختصاصی بکار رفته مربوط می‌شود. در ثانی فاکتورهای TGF-β2 و BMP-2 در مرحله کشت سلولهای بنیادی افزوده شده بود، تا ضمن بیان ژن مزودرمی Brachyury موجب افزایش سلولهای مزودرمی و سپس قلبی شود. این مطالعه با مطالعات قبلی در تأثیر تمایزی این فاکتورهای رشد در تمایز کاردیومیوسیتها همخوانی دارد.
افزایش بیان ژن Brachyury در سلولهای تیمار شده با فاکتورهای فوق با گزارشSchuldiner و همکارانش که اثر هشت فاکتور رشد را بر تمایز سلولهای بنیادی بررسی کردند، مطابقت دارد. طبق نتایج ایشان اجسام جنینی در روز پنجم تمایز خود، رسپتورهای TGF-β، BMP، Activin-A (متعلق به گروه خانواده TGF-β) و فاکتورهای رشد دیگری را بیان می‌کنند (15).
Kumar و همکارانش نشان دادند که TGF-β2با دوز ng/ml8 در مقایسه با TGF-β1 و TGF-β3 موجب افزایش تمایز کاردیومیوسیت‌های ضربان‌دار از سلولهای بنیادی جنینی می‌شود و با روشWestern blot افزایش بیان پروتئین αـ اکتین را در اجسام جنینی تیمار شده با TGF-β2 نشان دادند (12). در مطالعه حاضر نیز تأثیر TGF-β2 بر تمایز و بیان ژن‌های تخصصی قلبی و پروتئین αـ اکتینین و دسمین به تأیید رسید.
Behfar و همکارانش در مطالعه خود نشان دادند که مسیر پاراکرینی TGF-β/BMP-2برای تمایز مستقیم کاردیومیوسیت‌های ضربان‌دار از سلولهای بنیادی جنینی به منظور سلول تراپی در قلب آسیب دیده مناسب است و بیان ژن‌های MEF-2 و NKx2.5 را با روش RT-PCR در سلولهای تیمار شده نشان داد (16). در مطالعه حاضر نیز بعد از تأثیر دو فاکتور بیان ژن‌های NKx2.5 و MEF-2 خصوصاً MEF-2 که از پیش‌سازهای بیان ژن‌های تخصصی قلبی می‌باشد، افزایش یافت.
محققین دیگر مانندOrkin (17) و Simon(18) وZhu (19) و همکارانشان در پی تحقیقات خود گزارش کردند که حضور BMP-2 در شرایط in-vitro موجب بیان نابجای فاکتور رونویسی قلبی NKx2.5و خانواده GATA و نیز ژن خاص قلبی MHC می‌شود (11).
طبق تحقیقاتBoheler و همکارانش فاکتور BMPs برای کاردیوژنزیز ضروری است (3).
نتایج ما نشان داد که سلولهای بنیادی جنینی تحت تأثیر فاکتورهای رشد خانواده TGF- به کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته تبدیل می‌شوند، به طوریکه این سلولها ابتدا انقباض را شروع کرده و ضمن بیان پروتئین‌های انقباضی و تخصصی دسمین و آلفاـ اکتینین به تدریج کشیده‌تر شده و شکل خاص سلولهای عضله قبلی را به خود می‌گیرند. این نتایج با سلولهای قلبی استخراج شده از قلب موش نوزاد و سلولهای بنیادی تیمار نشده نیز مقایسه شد. طبق گزارش ما افزودن این فاکتورها قبل از تشکیل اجسام جنینی و در مراحل اولیه موجب هدایت روند تمایزی به سلولهای کاردیومیوسیت می‌گردد (15).
تأثیر همزمان دو فاکتور TGF-β2 و BMP-2 ضمن فعال‌سازی مسیرهای مولکولی موازی هم موجب افزایش بیان ژن‌های تخصصی قلبی شده است. داده‌های حاصل نشان داد که می‌توان با استفاده از فاکتورهای تخصصی با دوز مناسب در محیط آزمایشگاه تکوین مزودرم به سلولهای قلبی را تسریع نمود و ضمن تجزیه و تحلیل مراحل تکوینی آنها، کاردیومیوسیت‌های تمایز یافته را شناسایی، جدا و تخلیص کرد. از این سلولها می‌توانند به عنوان منبع مناسبی برای پیوند و کاربردهای درمانی دیگر بهره برد.
بدین وسیله نویسندگان این مقاله از زحمات کلیه همکاران پژوهشکده فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا بویژه سرکار خانم قاسمی کارشناس بخش ژنتیک و جناب آقای بیات کمال تشکر و قدردانی می‌نمایند.
