Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Evaluating the effects of NGF, RA and Shh growth factors on murine embryonic stem cell differentiation into neurons and oligocytes

Authors
Hediyeh Jahanbakht 1
Kazem Parivar 1
Mohammad Mehdi Akhondi 2
Mahmood Jeddi-Tehrani 3
Mohammad Hossein Modarresi 4
Mohammad Reza Sadeghi 3
Mohammad Keramatipour 5
Amir Hassan Zarnani 6
Sheida Salehkhou 2
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Islamic Azad University, Science & Research Campus, Tehran, Iran
2 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
3 Monoclonal Antibody Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
4 Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran; Faculty of Medical Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
5 Faculty of Medical Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
6 Nanobiotechnology Research Center, Avicenna Research Institute (ACECR), Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells that can differentiate into all types of specific adult cells and are used for cell therapy in certain diseases. It seems that the inductive factors may be used to produce neurons and gliocytes out of ES cells for the treatment of some nervous system diseases in future. In this research, pluripotent and undifferentiated murine embryonic cells were cultured and effects of the growth factors NGF, RA and Shh were studied for the induction of neural and glial differentiations. Materials & Methods: CCB ES cell line derived from mouse strain 129 were cultured on inactivated embryonic fibroblasts from C57/BL6 mice and embryonic bodies (EBs) were pre-pared and transplanted onto culture plates covered by fibronectin and growth factors NGF, Shh and RA with respective concentrations of 50 and 100 ng/ml, 300 and 500 ng/ml and 1 μM and in some groups bFGF with a concentration of 20 ng/ml were added to the specific culture medium for neural cell precursors to induce cell differentiation into neural cells. For studying differentiation into many types of neurons and oligodendrocyte, gene expression of specific neu-ral genes such as nestin, Nkx2-2, Nurr1, S100 and Olig-2 were assessed by RT-PCR and immu-nocytochemistry assays were used to confirm the presence of MAP-2 protein. Results: In this study, genetic evaluations showed that each of the previously mentioned growth factors activate some molecular mechanisms that have essential effects on differentiation into different kinds of nervous system cells by affecting the expression of marker genes. Cytoche-mistry of these cells by monoclonal MAP-2 antibody showed the resultant cells have dendrites that are specific for neural cells or neurons. Conclusion: The findings indicated that pluripotent and undifferentiated CCB ES cells underwent differentiation into neural cells and oligodendrocytes under the effects of NGF, Shh and RA growth factors and this neural induction was confirmed by the presence of molecular and antigenic markers in these cells. Each of these factors was effective in the induction of different-tiation of specialized neural cells and even different concentrations of the factors induced parti-cular cell differentiations.
Keywords
differentiation
Embryonic stem cell
Murine
Neuron
NGF
RA
Shh

زمینه و هدف

سلول‌های بنیادی جنینی (ES) اولین بار در دهه 1980 بوسیله گروه‌های تحقیقاتی مختلف جداسازی شدند. این سلولها از لایه سلولی اپی‌بلاستی توده سلولی داخلی در جنین مرحله بلاستوسیست جدا می‌شوند (1). محققین مختلف ویژگی همه توانی سلول‌های ES و توانایی تمایز آنها به انواع مختلف سلول‌های سه لایه زایندة اولیه را گزارش کرده‌اند (2،3). سلول‌های ES، سلول‌های همه توانی هستند که به دلیل ویژگی خود نوسازی بدون هیچ محدودیتی تکثیر می‌یابند و توانایی تمایز به انواع سلولها را دارند. سلول‌های بنیادی همه توان در چند گروه مختلف تقسیم می‌شوند، آن دسته که در دوران اولیه جنینی تشکیل می‌شوند در گروه سلول‌های بنیادی جنینی قرار می‌گیرند (4).

استفاده از سلول‌های ES در تمایز مستقیم به سلول‌های تخصص یافته با فنوتیپ خاص به منظور استفاده در درمان برخی از بیماری‌هایی که سلول‌های خاصی عملکرد صحیح خود را از دست داده است، یکی از اهدف مهمی است که محققین سال‌های بعد از دستیابی به سلول‌های بنیادی جنینی، برای رسیدن به آن تلاش می‌نمایند (5).

سلول‌های ES در شرایط آزمایشگاهی نیز مراحل تکوین طبیعی جنینی را طی می‌کنند و اگر برای چند هفته در شرایط بدون حضور فاکتور سیتوکینی LIF کشت داده شوند توانایی تمایز خودبخود به سه لایه جنینی اکتودرم، مزودرم واندودرم را دارا می‌باشند (6).

با توجه به نقش سیگنال‌های پاراکرینی در تکوین صحیح سیستم عصبی در طول مرحله گاسترولاسیون، هرگاه سلول‌های بنیادی جنینی موش را در شرایط کشت سلولی با استفاده از عوامل و مکمل‌های مختلف مؤثر کشت دهیم توانایی تمایز به سلول‌های عصبی را خواهند داشت. به طوریکه این سلول‌های تمایز یافته تمام خصوصیات یک نورون بالغ را از نظر مورفولوژی و فیزیولوژی دارا خواهند بود (7). RA ، Shh و NGF از عوامل القایی و مورفوژنیکی می‌باشند که حضور آنها در مراحل اولیه القا عصبی و مراحل بعدی نورون‌زایی در طول صفحه عصبی و لوله عصبی نخاعی‌ـ مغزی نقش اساسی دارند.

Shh عامل مورفوژن مهمی است که از نوتوکورد ترشح شده و روی بیان این دسته ژنها اثر می‌گذارد (8). این پروتئین مورفوژن در بخش شکمی نخاع باعث تمایز صفحه عصبی به نورون حرکتی و نورون‌های حد واسط شکمی می‌گردد و باعث تغییر در بیان 7 نوع فاکتور نسخه‌برداری از ژن‌های همودمین کلاس HD شده و به دو گروه I و II تقسیم می‌شود. ژن‌های کلاس HD به موقعیت enhancer در DNA متصل می‌شوند و در کنترل اختصاصی یا عمومی نسخه‌برداری ژن‌هایی شرکت می‌کنند که در مراحل مختلف تخصص‌یابی نورونها، چه در نخاع و چه در سایر مناطق CNS، نقش دارند. این 7 نوع ژنOlig-2, pax7, pax3, Dbx12 Nkx2.2, Nkx6.1 می‌باشند که توسط سلول‌های اولیه عصبی ناحیه شکمی بیان می‌شوند و بوسیله Shh کنترل می‌شوند (8،9،26).

رتینوئیک اسید (RA) در بخش‌های خلفی لوله عصبی باعث واکنش های بین سلولی لازم برای تمایز و تکوین می شود (10). مکانیسم اثر RA به این صورت است که این عامل بر روی رسپتورهای خود در سطح سلول های بنیادی متصل می شود. لازم به ذکر است mRNA کدکننده رسپتورهای RA (RAR) در سلول های بنیادی نیز وجود دارند و بیان آنها با حضور RA القاء می‌شود؛ بطوریکه RA در القای ژن NF-L مؤثر است تا سلول‌های اولیه عصبی تشکیل شود. در مراحل نوروژنز نیز مشخص شده برای بیان ژن‌های HD کلاس I ، حضور RA نیز لازم است. از این گروه ژنها می‌توان Pax6 و Dbx-1/2 را نام برد که در نواحی خلفی طناب عصبی در تمایز نورون های حرکتی مؤثرند (11).

NGF فاکتور رونویسی است که در تکوین و ایجاد نورون های سیناپسی و حسی مؤثر است (10). همچنین از خصوصیات شیمیایی آن افزایش رشد نوریتها است. این فاکتور با اتصال به گیرندة غشائی خود با ویژگی تیروزین کینازی (TRK-A) ، تأثیرات خود را در سلول القاء می کند و با فعال شدن گیرنده ژن Tck-1 بیان می‌شود. این ژن مسیر مولکولی کینازی را فعال می‌نماید که باعث حفظ بقای سلول‌های عصبی و رشد نوریتها می‌گردد و در دو مسیر مختلف با فعال شدن IP3 و پروتئین کیناز MAP ژن‌های مؤثر در تمایز سلول‌های عصبی را روشن می‌نماید (12).

bFGF فاکتور رشد فیبروبلاستی است که هم به عنوان عاملی در تحریک تکثیر سلول‌های اجدادی نورواپیتلیالی سیستم عصبی مرکزی عمل نموده و هم در بالغین موجب نوروژنز در سلول‌های بنیادی عصبی گانگلیون‌های سیستم عصبی مرکزی می‌شود. تأثیر این فاکتور در تکثیر سلولی با القا سنتز کمپلکس سیکلین کیناز انجام می‌گیرد. این پروتئین‌های سیکلینی در شروع تقسیم سلولی نقش دارند و براساس تأثیر میتوژنیک bFGF، آنرا عامل مهمی در القای تمایز عصبی و تکثیر سلول‌های اجدادی عصبی می‌دانند. در شرایط in vivo این فاکتور در برقراری صحیح مراحل بیان ژن‌های HD رده I نقش داشته و به صورت فاکتورهای رونویسی در بیان ژن‌های خاص نورون‌های حرکتی مؤثر می‌باشد (8).

با توجه به اینکه در حدود نیمی از حجم سیستم عصبی مرکزی را سلول های اولیگودندروسیت و آستروسیتها تشکیل می‌دهند و نقش حمایتی، تغذیه کنندگی و حفاظتی برای نورونها دارند (16). این بررسی با هدف کشت و تکثیر سلول‌های بنیادی جنینی موش با حفظ خاصیت همه توانی و تمایز نیافتگی آنها و سپس بررسی تأثیر فاکتورهای رشد Shh، RA، NGF به منظور القای تمایز به سلول‌های عصبی انجام شد و همچنین القای تمایز به سلول‌های اولیگودندروسیتی و آستروسیتها نیز مورد نظر قرار گرفت.

روش بررسی

کشت سلول‌های بنیادی: سلول‌های ES از ردة سلولی (CCB) (اهدایی از دانشگاه کمبریج) از موش نژاد 129 بعد از مراحل ذوب سلولی بر روی پلیت های پوشیده با فیبروبلاست غیرفعال شده با میتومایسین در محیط کشت ES شامل مواد زیر کشت داده شدند: محیط 15% Knockout Serum؛ 85% Knockout Medium، سدیم پیروات mM1، گلوتامین mM 200، N.E.A.A (100x) به میزان 1% (تمامی مواد از شرکت Gibco آلمان)، بتامرکاپتو اتانل (1000x) 1/0% (Sigma, USA)، LIF به مقدار U1000 (ESGRO,USA، پنی سیلین و استرپتومایسین 1%.

سلول‌های ES بعد از چند ساعت روی فیبروبلاست‌های غیرفعال متصل و به رشد و تزاید خود ادامه دادند.

طی این مدت روزانه محیط کشت سلولها تعویض و سلولها مورد ارزیابی قرار می‌گرفتند تا در صورتیکه به حد کافی رشد نموده بودند مجدداً آنها را جدا نماییم. کلونی های تمایز نیافتة سلول های بنیادی، حاشیه ای صاف داشته و به شدت به هم چسبیده اند. پس از تشکیل کلونی سلولها برای القای تمایز سلولی آماده می‌باشند.

القای تمایز عصبی در سلولهای بنیادی: در این شرایط بخشی از سلول های تمایز نیافته را برای انجام مراحل القای تمایز عصبی به وسیله Trypsin/ EDTA (Invitrogen, Germany)؛ 25/0% از سطح سلول‌های فیبروبلاست غیرفعال (Feeder cells) جدا نموده و پس از شمارش سلولی آنها را برحسب قطرات 25 میکرولیتری که دارای 400 تا 500 سلول باشند به مدت دو روز به روش کشت قطرات معلق نگه‌داشته تا اجسام جنینی (EBs) تشکیل شوند. سپس کلونیها را به پلیت‌های مخصوص کشت باکتری منتقل کرده به مدت 2 الی 4 روز در شرایط سوسپانسیون قرار داده تا تجمع سلولی تشکیل شده و افزایش یابد.

محیط کشت شامل DMEM/F12، B272%، BSA mg/ml1، پنی‌سیلین/ استرپتومایسین 1%، (سرم 10% FBS)ـ N.E.A.A (100x) 1% (تمامی موارد محصول شرکت Gibco آلمان بود) می‌باشد.

کلنی های سلولی در سوسپانسیون را جمع آوری و سلول های EB را به پلیت 12 حفره ای پوشانده شده با فیبرونکتین منتقل نموده تا در هر حفره 12-10 کلنی قرار داده شود. در این مرحله از محیط کشت فوق، bFGF را حذف کرده و فاکتورهای رشد Shh و NGF و RA را در هشت گروه که بر حسب غلظت های مورد نظر در حفره‌های مجزا تعیین شده‌اند به محیط کشت سلول‌های نورواپیتیلیالی (شرح محیط کشت در بالا آمده است) اضافه می کنیم. این گروه‌ها شامل Shh غلظت‌های ng/ml 300 و 500، NGF غلظت‌های ng/ml50 و 100، RA M1 و در گروه دیگر که دو فاکتور همزمان استفاده شد ng/ml300 Shh+ng/ml 20 bFGF و گروه دیگر ng/ml50 NGF+ ng/ml 20 bFGF بود.

دو روز بعد از کشت سلولها (روز 2+4) در پلیت پوشیده با فیبرونکتین سلول‌های یک تا دو حفره، جهت بررسی بیان ژن نستین به روش RT-PCR جمع‌آوری شدند. در این مرحله باید در انتظار القای EB به سلول‌های عصبی بود. سلول‌های القا شده را بر روی پلیت 12 حفره‌ای پوشیده با پلی لیزین منتقل نموده و در محیط کشت به منظور تکمیل تمایز سلول های نورواپی تلیوم که در زیر شرح داده شده است تا زمان کشت 14+4 کشت داده می‌شوند: Neurobasal-A-medium حاوی BSA mg/ml1، B27 2%، 100xN.E.A.A 1%، گلوتامین (L-glu.200mm) mM2 (تمامی موارد محصول شرکت Gibco آلمان بود). فاکتورهای رشد Shh، R.A، NGF، bFGF برحسب گروه سلولی انتخابی و آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین/ استرپتومایسین به میزان 1% به محیط فوق اضافه گردید.

بررسی تمایز سلولی به روش RT-PCR: سلول‌های کشت شده، در روزهای2+4، 9+4، 12+4، 14+4، 16+4 برای بررسی بیان ژن های اختصاصی سلول‌های عصبی به ترتیب زمان‌های ذکر شده: Nestin، Nkx2.2، Nurr-1، S100 و Olig-2 انتخاب شدند. سپس سلولها را از سطح پلیت جدا کرده سریعاً RNA سلولی استخراج گردید و با روش RT-PCR، cDNA مربوطه تهیه و در دمای C20- ذخیره گردید. انتخاب زمان‌های فوق براساس زمان بیان این ژنها در مسیر تکوین سیستم عصبی بود. همچنین ژن GAPDH به عنوان یک ژن House keeping و ژن oct-4 به عنوان مارکر سلول‌های بنیادی تمایز نیافته بررسی شد.

تمام گروه‌های سلولی تحت تیمار با فاکتورهای رشد در زمان‌های تعیین شده جدا شده و گروه‌های کنترلی نیز در نظر گرفته شدند. یک گروه کنترل منفی از سلول‌های تیمار نشده با فاکتورها برای تأیید عدم تمایز خودبخودی، گروه کنترل مثبت سلول‌های بالغ مغز موش، گروه gDNA برای تأیید عدم وجود سودوژن ، گروه W که بجای cDNA آب استفاده شد و گروه ESC از cDNA حاصل از سلول‌های بنیادی برای بررسی تمایز خودبخودی قبل از القا با فاکتورها استفاده شد. سپس پرایمر مناسب برای هر یک از این ژنها با توالی زیر طراحی گردید و به روش PCR بیان هر یک از ژنها در محتوی CD حاصل از سلولها بررسی گردید و پس از انجام واکنش PCR محصول به دست آمده را با روش الکتروفورز بررسی نموده و تصاویر تهیه شدة آن در قسمت نتایج ارائه می‌شود.

mGAPDH : C60، 30 سیکل

F-5´-CAGGAGACGAGACCCCACTA-3

R-3´-GGCATGGACTGTGGTCATGA-5´

Nestin (NM 016701): C60، 35سیکل (نشانگر اختصاصی سلول‌های اولیه نورواپی تلیالی)

F-5´- CTCGAGCAGGAAGTGGTAGG-3

R-5´-TTGGGAACCAGGGACTGTTAG-3

Nkx2.2 (NM 010919): C52، 40 سیکل (نشانگر اختصاصی سلول‌های اولیه سطح شکمی طناب عصبی)

F-5´-CTCTTCTCCAAAGCGCAGA-3´

R-5´-AACAACCGTGGTAAGGATCG-3´

Nurr-1 (NM 021279): C58، 35 سیکل (نشانگر سلول‌هایی که توانایی تبدیل به نورون‌های دوپامینرژیک را دارند)

F-5´-TGAAGAGAGCGGACAAGGTC-3´

R-5´-TCTGGAGTTAAGAAATCGGAGCTG-3´

S100 (GB AY 465109): C47/39، 35 سیکل (نشانگر اختصاصی آستروسیتها)

F-5´-TGAAGGGTCCATCAGTCA-3´

R-5´-CTAGTAGAGGCTGTG-3´

Nested RCR Olig2 (NM 016967): C58، 35 سیکل

F-5'-TCAGAGCACAGGAGCAAGC-3'

R-5'-AGAATACCCCCTCCCAAAAA-3'

oct-4: C65، 35 سیکل

F-5'-GGCGTTCTCTTTGGAAAG GTGTTC-3'

R-5'-CTC GAA CCA CAT CCT TCT CT-3'

به این ترتیب میزان بیان هر ژن در سلولها با حضور هر فاکتور رشد با غلظت‌های متفاوت بررسی و مقایسه‌ای نیز بین فاکتورهای مختلف در بیان هر ژن با روش دنسیتومتری انجام گرفت.

بررسی تمایز سلولی به روش ایمونوسیتوشیمی: در روز 9+4 سلول هایی با مشخصات فوق را که بر روی لامل پوشیده با poly L-Lysin قرار داشتند برای رنگ‌آمیزی MAP-2 انتخاب گردید تا زوائد دندریتی نازک و جسم سلولی عصبی در آنها تأیید شود. مراحل انجام کار بدین ترتیب بود که: قبل از تثبیت سلول‌هایی که بر روی لامل کشت داده شده‌اند آنها را با PBS گرم شستشو داده وبا محلول پارافرم آلدئید 4% به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق تثبیت نمودیم. سپس سه بار با BSA 1/0% + PBS شستشو داده و آنتی‌بادی اولیه MAP-2 با رقت 2% به مدت یک ساعت بر روی سلولها در دمای اتاق قرار گرفت. پس از شستشو، آنتی بادی ثانویه کونژوگه با HRP با رقت 1% به مدت یک ساعت انکوبه و مجددا شستشو و رنگ تکمیلی سوبسترای DAB و هماتوکسیلین (15 دقیقه) اضافه شد، پس از شستشو و مونته کردن لام و با میکروسکوپ نوری دوربین‌دار لامها مشاهده و از نمونه‌های مورد نظر عکس تهیه گردید.

نتایج

کشت و تمایزسلول‌های ES: سلول‌های ردة CCB که بر روی آن فیبروبلاست غیرفعال کشت داده شدند، تشکیل کلنی‌های شفاف و بهم چسبیده ای را دادند که قدرت تکثیر بالایی داشتند (شکل1- الف). برای اطمینان از عدم تمایز آنها بیان ژن oct-4؛ با روش RT-PCR انجام شد. تشکیل باند تأیید می‌کند که این سلولها تمایز خود بخودی نیافته‌اند و به صورت همه توان می‌باشند.

در کشت 4 مرحله‌ای برای تمایز سلول‌های ES در شرایط قطره، توده سلولی کروی شکل به هم فشرده‌ای تشکیل شد که سپس در محیط سوسپانسیون رشد نموده و بعد از انتقال بر روی پلیت پوشیده با فیبرونکتین، به طور کامل چسبیده و سلول‌های حاشیه کلنیها به اطراف پراکنده شده و تغییر شکل دادند که نشان دهنده شروع تمایز سلولی است (شکل 1- الف).

نتایج RT-PCR از زمان 2+4 کشت EBs نشان داد که سلول‌های تحت تیمار با هر سه فاکتور رشد، القای عصبـی را نشان مـی‌دهند و میزان بیان مارکرهای ژنـی دیگر بسته به نوع و غلظت عامل القا کننده متفاوت است. نتایجPCR و باندهای تشکیل شده بعد از الکتروفورز آنها در (شکل2) آمده است. عدم بیان این ژنها در گروه کنترل که بدون تیمار با فاکتور بوده است نشان دهنده اثر القایی دقیق این فاکتورها در تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های عصبی می‌باشد. همچنین عدم بیان ژنها در گروه سلول‌های ES نیز تأییدکننده عدم تمایز خودبه‌خودی سلولی است. به منظور نتیجه‌گیری دقیقتر از میزان بیان ژنها تصاویر حاصل از الکتروفورز هر ژن به وسیله دنسیتومتری محاسبه شد.

انجام دنسیتومتری از الگوی باندها نشان داد که ژن نستین در تمام گروهها بیان شده و در گروهی که با Shh و bFGF تیمار شدند بیشترین میزان بیان را داشت اما در تیمار با NGF (ng/ml50) ضعیف‌ترین باند را تشکیل داد. اما RA نسبت به Shh (ng/ml 500) تأثیر کمتری در بیان ژن نستین داشت. البته اکثر سلول‌های تیمار شده با RA به علت تراتوژن بودن این فاکتور 3-2 روز بعد از تیمار از بین می‌رفتند. در عین حال بیان ژن Nkx2.2 در تمام گروه‌ها مشاهده شد که با تأثیر فاکتور Shh (ng/ml300) بیشترین میزان بیان ژن را داشت؛ اما حضور bFGF بیان این ژن را کاهش داد.

Nurr-1 در گروه تیمار شده با RA بیان نشد اما بیشترین بیان را با فاکتورهای NGF+ bFGFو کمترین بیان را با تأثیرShh (ng/ml300) نشان داد و گروه‌هایی که با NGF تیمار شده بودند نسبت به گروه‌های Shh به میزان بیشتری بیان شدند. ژن S100 در گروه‌های تیمار شده با NGF و RA بیان شد. ژن Olig2 فقط با حضور فاکتورهای Shh و Shh+ bFGF بیان شد.

ایمونوسیتو شیمی: با رنگ‌آمیزی سلول‌های تحت تأثیر فاکتورهای رشد در تمامی گروه‌ها، بعد از روز 9+4 در تعدادی از سلولها حضور پروتئین MAP-2 در نواحی دندریتی و جسم سلولی مشاهده شد. سلول‌های نوراپی‌تلیالی در حال تقسیم با دو هسته نیز مشاهده شدند و نوریتها حضور پروتئین را نشان دادند که آنها را به عنوان سلول تحت میتوزی نورواپیتلیالی می‌توان در نظر گرفت (شکل 1- الف).

بحث

به دلیل توانایی تبدیل سلول‌های بنیادی به انواع سلول‌های تمایز یافته در شرایط آزمایشگاهی، در این تحقیق نیز با استفاده از سلول‌های بنیادی جنینی موشی رده CCB، آنها را در حضور فاکتورهای رشد القا کننده تمایز عصبی کشت داده و تعدادی از سلول‌های اولیه سیستم عصبی بدست آمد. اعتقاد براین است که با دستیابی به دانش فنی تولید سلول‌های بنیادی جنینی می‌توان از آنها به عنوان ذخیره‌ای سلولی که توانایی تمایز به انواعی از سلولها را دارند استفاده کرده و با فراهم آوردن امکان تمایزشان به سلول‌های مورد نظر از آنها در جهت بررسی روش‌های سلول درمانی و پیوند سلولی استفاده نمود.

نتایج این تحقیق نشان داد که سلول‌های ES، برای تمایز مستقیم و غیرخودبخودی به نورون و سلول‌های گلیالی در شرایط in vitro نیاز به افزودن عوامل سیتوکینی و هورمونی یا فاکتورهای رشد به محیط کشت دارند (17). کشت و تمایز سلول‌های بنیادی در شرایط سوسپانسیون به نورون‌های اولیه نستین مثبت و گلیالها توسطBain, Frichard در سال 1995 به صورت یک پروتکل ابتدایی ارائه شد (18،19).

Okabe و همکاران FGF را به عنوان عاملی میتوژن در تکثیر سلول‌های بنیادی تمایز یافته معرفی کردند (20) و محققین دیگری نیز چون Li (21)، Rao و Mojtaba با تغییراتی که در روش ساده Bain دادند، توانستند در شرایط in vitro تعداد بیشتری از سلول‌های تمایز یافته عصبی را بدست آورند. Rolletschek و همکاران با روش قطرات معلق، کلنی‌های سه بعدی EBs 200 سلولی بدست آوردند و آنها را به شکل سوسپانسیون در محیط بدون سرم کشت داده و بعد از انتقال بر پلیت پوشیده با پلی‌لیزین ولامینین در حضور bFGF و EGF، سلول‌های اجدادی عصبی را تکثیر و نورون‌های دوپامینرژیک را تشکیل دادند (23). در حالیکه در این تحقیق به منظور القای تمایز عصبی از ردة سلولی بنیادی جنینی EBs 500 سلولی تهیه شد و سپس در محیط سوسپانسیون سرم‌دار که در آن bFGF به عنوان عامل میتوژن حضور داشت، کشت داده شدند. بعد از انتقال، کلنیها بر پلیت پوشیده با فیبرونکتین منتقل شدند و به محیط کشت، فاکتورهای رشد RA, NGF, Shh افزوده شد. البته به علت خاصیت تراتوژنیک RA که در این تحقیق مشاهده شده سلول‌های ES مطابق روش Bain کشت داده شدند. در این مرحله حضور سلول‌های نستین مثبت که بیانگر القای عصبی توسط هر سه عامل القایی می‌باشد (18) مشاهده شد. سپس برای تشکیل نورون‌های تخصص یافته سلول‌های نستین مثبت روی پلی لیزین در حضور محیط کشت اختصاصی نوروبازال با مکمل B27 و BSA و همان فاکتورهای القایی انتقال داده و رشد داده شدند. برای این منظور مکمل‌های B27 و BSA و کشت بر حفظ و رشد سلول‌های فوق تأثیر داشتند و با توجه به اینکه سلول‌های پیش‌ساز عصبی شکمی نخاع، ژن Nkx2.2 را بیان می‌نماید (8)، در این مرحله نورون‌های اولیه حد واسط با بیان Nkx2.2 تأیید نمود که سلول‌های اجدادی عصبی سطح شکمی طناب نخاعی بدست آمده است. همچنین در این تحقیق برای اولین بار گزارش می‌شود که میزان بیان ژن Nurr1 تحت تأثیر NGF در سلول‌های بنیادی جنینی افزایش یافته و القای تمایز به سلول‌های اولیه دوپامینرژیک انجام گرفته و با حضور bFGF این اثر تقویت شده است. همچنین این فاکتور به تنهایی توانایی تمایز دادن سلول‌های بنیادی به سلول‌های آستروسیتی را داشته در حالیکه فاکتور Shh مسیر تشکیل آستروسیستها را مهار کرده و در مقابل با حضـور این فاکتـور اولیگوسیت‌های Olig-2 مثبت از

سلول‌های ES تمایز می‌یابند.

حضور MAP-2 که پروتئین اختصاصی متصل به میکروتوبول‌های اسکلت سلولی در دندریتها است (24،25) با رنگ آمیزی سلولی در سلول‌های تیمار شده با فاکتورهای القایی مورد نظر حضور این پروتئین تایید شد که نشان دهنده تمایز به نورون از سلول‌های ES می‌باشد. به این ترتیب در شرایط کشت پیشنهادی این تحقیق می‌توان با اطمینان بیشتری به سلول‌های عصبی حاصل از تمایز مستقیم سلول‌های بنیادی دست یافت. در نهایت از این تحقیق می‌توان نتیجه‌گیری نمود که بیشترین میزان تأثیر در القای تشکیل سلول‌های عصبی اولیه را فاکتور Shh با غلظت nM500 در حضور bFGF داشته و سلول‌های دیگری مانند نورون‌های حد واسط V3 و نورون‌های حرکتی اولیه نیز به وسیله این فاکتور القا می‌شوند و تنها عاملی که توانایی القای تشکیل اولیگوسیتها را داشته فاکتور Shh است. در مقابل با تیمار NGF آستروسیستها تمایز یافته و این فاکتور رشد بیشترین اثر را در تشکیل نورون‌های اولیه دوپامینرژیک نشان می‌دهد که حضور فاکتور bFGF اثر سینرژیک بر آن داشته است. از مهمترین اهداف این تحقیق دست‌یابی به عوامل مؤثر در شرایط کشت سلولی بود تا اطمینان بیشتری به تشکیل سلول‌های سیستم عصبی مرکزی از سلول‌های بنیادی ایجاد گردد. با نتایج حاصل در آینده می‌توان از این روش در تولید سلول‌های تخصصی عصبی استفاده نمود و آن را در روش‌های سلول درمانی بیماری‌های نقص عملکردی نورن‌های سیستم عصبی مانند پارکینسون و یا جراحات نخاعی بکار بست.

نتیجه‌گیری

یافته‌های حاضر در این تحقیق نشان می‌دهد که حضور فاکتورهای RA، NGF و Shh با تأثیر در مسیرهای ژنتیکی در تمایز و تکوین سلول‌های بنیادی به برخی سلول‌های سیستم عصبی مؤثر بوده‌اند و حضور همزمان bFGF نیز به عنوان یک عامل تقویت کننده مشاهده شد. به نظر می‌رسد نتایج فوق را می‌توان در جهت تولید سلول‌های عصبی تمایز یافته و برای اهداف درمانی استفاده نمود. همچنین به علت محدودیت‌های وسایل و ابزار مناسب نتایج کمی حاصل نشده است؛ لذا پیشنهاد می‌شود در مطالعات آتی با استفاده از روش فلوسایتومتری این نیاز را مرتفع نمود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله نویسندگان این مقاله از زحمات کلیه همکاران پژوهشکده فناوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا بویژه سرکار خانم عینی مسئول بخش حیوانات آزمایشگاهی و سرکار خانم قاسمی کارشناس بخش ژنتیک و جناب آقای بیات کمال تشکر و قدردانی می‌نمایند.

  1. Gardner RL, Cockroft DL. Complete dissipation of coherent clonal growth occurs before gastrulation in mouse epiblast. Development. 1998;125(13):2397-402.
  2. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1981;78(12):7634-8.
  3. Brook FA, Gardner RL. The origin and efficient deriva-tion of embryonic stem cells in the mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94(11):5709-12.
  4. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 1981; 9;292(5819):154-6.
  5. Wichterle H, Lieberam I, Porter JA, Jessell TM. Direct-ed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 2002;110(3):385-97.
  6. Weissman IL, Anderson DJ, Gage F. Stem and proge-nitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annu Rev Cell Dev Biol. 2001;17:387-403.
  7. Bain G, Kitchens D, Yao M, Huettner JE, Gottlieb DI Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 1995;168(2):342-57.
  8. Briscoe J, Pierani A, Jessell TM, Ericson J. A homeo-domain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube. Cell. 2000; 101(4):435-45.
  9. Yung SY, Gokhan S, Jurcsak J, Molero AE, Abrajano JJ, Mehler MF. Differential modulation of BMP signal-ing promotes the elaboration of cerebral cortical GABAergic neurons or oligodendrocytes from a com-mon sonic hedgehog-responsive ventral forebrain progenitor species. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 10;99(25):16273-8.
  10. Gilbert Scott F. Developmental biology, sinuar U 6th Edition. 2000;pp:272-409.
  11. Novitch BG, Chen AL, Jessell TM. Coordinate regu-lation of motor neuron subtype identity and pan-neuro-nal properties by the bHLH repressor Olig2. Neuron. 2001;31(5):773-89.
  12. Burbach JP, Smits S, Smidt MP. Transcription factors in the development of midbrain dopamine neurons. Ann N Y Acad Sci. 2003;991:61-8. Review.
  13. Marshak DR, Gardner RL, Gottlieb D. Stem Cell Biology. CSHL press. 2000;pp:250-1.
  14. Martinat C, Bacci JJ, Leete T, Kim J, Vanti WB, Newman AH, Cha JH, Gether U, Wang H, Abeliovich A. Cooperative transcription activation by Nurr1 and Pitx3 induces embryonic stem cell maturation to the midbrain dopamine neuron phenotype. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(8):2874-9.
  15. Chang L, Jones Y, Ellisman MH, Goldstein LS, Karin M. JNK1 is required for maintenance of neuronal mic-rotubules and controls phosphorylation of microtubule-associated proteins. Dev Cell. 2003;4(4):521-33.
  16. بربرستانی محمد، نوروآناتومی پایه وپزشکی، نشر نور دانش (1379)، صفحات: 29-20.
  17. Almazan G, Honegger P, Du Pasquier P, Matthieu JM Dexamethasone stimulates the biochemical differentia-tion of fetal forebrain cells in reaggregating cultures. Dev Neuro Sci. 1986;8(1):14-23.
  18. Fraichard A, Chassande O, Bilbaut G, Dehay C, Sava-tier P, Samarut J. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J Cell Sci. 1995;108(Pt 10):3181-8.
  19. Okabe S, Forsberg-Nilsson K, Spiro AC, Segal M, McKay RD. Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. Mech Dev. 1996;59(1):89-102.
  20. Mujtaba T, Piper DR, Kalyani A, Groves AK, Lucero MT, Rao MS. Lineage-restricted neural precursors can be isolated from both the mouse neural tube and cultured ES cells. Dev Biol. 1999;214(1):113-27.
  21. Li M, Pevny L, Lovell-Badge R, Smith A. Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr Biol. 1998;(8):971-974.
  22. Rolletschek A, Chang H, Guan K, Czyz J, Meyer M, Wobus AM. Differentiation of embryonic stem cell-derived dopaminergic neurons is enhanced by survival-promoting factors. Mech Dev. 2001;105(1-2):93-104.
  23. Garner CC, Tucker RP, Matus A. Selective localiza-tion of messenger RNA for cytoskeletal protein MAP2 in dendrites. Nature. 1988;336(6200):674-7.
  24. Binder LI, Frankfurter A, Rebhun LI. Differential localization of MAP-2 and tau in mammalian neurons in situ. Ann N Y Acad Sci. 1986;466:145-66.
  25. Yung SY, Gokhan S, Jurcsak J, Molero AE, Abrajano JJ, Mehler MF. Differential modulation of BMP signa-ling promotes the elaboration of cerebral cortical GABAergic neurons or oligodendrocytes from a common sonic hedgehog-responsive ventral forebrain progenitor species. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;99 (25):16273-8.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 7, Issue 4
Winter 2007
Pages 349-357