زمینه و هدف

اندومتریوز ضایعه‌ای است که با وجود غدد و سلول‌های استرومای اندومتر در خارج از حفره رحمی مشخص می‌شود (1). این بیماری از شایع‌ترین اختلالات زنان و مامایی است که حداقل 10% زنان در سنین باروری و 50% زنان نابارور به آن مبتلا می‌شوند (2). تاکنون هیچ درمان دارویی یا جراحی جهت ریشه‌کنی این بیماری بدون داشتن عوارض جانبی شناخته نشده است (3). جراحی به عنوان خط اول درمان به منظور از بین بردن ضایعات اندومتریوزی می‌باشد. اما در 47% از بیماران عود مجدد بیماری پس از جراحی گزارش شده است (4).

از بین تئوری‌های مختلفی که در زمینه پاتوژنز این بیماری بیان شده‌ است، تئوری بازگشت خون قاعدگی از طریق لوله‌های رحمی به حفره صفاقی بیش از سایرین مورد تأیید قرار گرفته است (5). قطعات بافت اندومتر در حفره صفاقی دو رفتار اساسی را از خود نشان می‌د‌هند که عبارت از لانه‌گزینی و ایجاد عروق خونی جدید از طریق فرآیند رگ‌زایی می‌باشد (6).

اندومتریوز در انسان و پریمات‌‌های نزدیک به انسان که دارای قاعدگی هستند دیده می‌شود. بنابراین مطالعه و بررسی علمی در مورد این بیماری، خصوصاً شناسایی مراحل اولیه ایجاد و تثبیت آن با مشکلات متعددی همراه است. بدین منظورتحقیقات فراوانی جهت ابداع مدلی که قادر به تقلید مراحل ابتدایی بیماری اندومتریوز باشد صورت گرفته است.

Fascianiو همکاران مدل کشت سه بعدی قطعات بافت اندومتر تکثیری را در زمینه فیبرینی معرفی کردند و با توجه به تکثیر سلول‌های استروما، ایجاد غدد و عروق جدید، آنرا به عنوان مدل مناسبی برای مطالعه مراحل اولیه اندومتریوز معرفی کردند (7). سپس خزاعی و همکاران ثابت کردند که قطعات بافت اندومتر فاز ترشحی نیز توانایی تکثیر، رشد، تجدید ساختار و رگ‌زایی در زمینه سه بعدی فیبرینی را داشته و کشت اندومتر ترشحی، سازگاری بیشتری با پاتوژنز اندومتریوز دارد (8). همچنین آنها با کشت سلول‌های اندومتر انسانی در زمینه سه بعدی فیبرینی در همین رابطه، موفق به ایجاد شبکه ظریف مویرگی شدند (9). با توجه به این مسئله که اندومتریوز از دسته بیماری‌های مرتبط با آنژیوژنز می‌باشد، به نظر می‌رسد استفاده از ترکیباتی که قادر به مهار فرآیند آنژیوژنز می‌باشند دارای اثراتی بر این بیماری خواهد بود.

از جمله ترکیبات دارویی که تأثیرات آنها بر فرآیند رگ‌زایی مورد بررسی قرار گرفته است، استاتینها می‌باشند. دسته دارویی مهارکننده آنزیم 3ـ هیدروکسی 3- متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMG-Co A) که به استاتینها معروف هستند، به طور وسیعی جهت درمان افزایش کلسترول خون مورد استفاده قرار می‌گیرند (10). این داروها مسیر تبدیل موالونات به HMG-CoA را مهار می‌کنند و در نتیجه تولید کلسترول را کاهش می‌دهند (11).

تحقیقات نشان داده‌اند که استاتینها علاوه بر اثرات کاهش دهنده سطح چربی خون دارای تاثیرات وسیعی بر فرایند التهاب و رگ‌زایی می‌باشند (12). به نظر می‌رسد که استاتینها به طور بالقوه دارای اثرات دوگانه‌ای بر فرایند آنژیوژنز باشند.Laufs و همکاران گزارش کردند که دوزهای پایین استاتین از طریق افزایش تولید اکسیدنیتریک (NO) منجر به تحریک رگ‌زایی می‌شوند؛ در حالی که این ترکیبات در دوزهای بالا prenylation پروتئینها را کاهش داده و باعث مهار رشد سلولی می‌شوند (13). براساس مطالعه‌ اسفندیاری و همکاران داروی لوواستاتین در غلظت‌های M1، M5 و M10 قادر به مهار پدیده آنژیوژنز می‌باشد؛ اما مهار رشد و تکثیر سلولی فقط در دوزهای M5 و M10 رخ می‌دهد (14).

آتورواستاتین (Lipitor, Pfizer) از دیگر ترکیبات خانواده استاتینها می‌باشد که نسبت به سایر اعضای این خانواده دارای عوارض جانبی کمتر و اثر بخشی بیشتری می‌باشد (15). این دارو علاوه بر کاهش سطح کلسترول سرم، طیفی از اثرات ضد التهابی، ضد انعقادی و تثبیت ضایعات آترواسکلروزی را نیز دارا می‌باشد (16).

با توجه به مشکلات موجود در مطالعات انسانی و مسائل مربوط به نگهداری و ایجاد اندومتریوز تجربی در مدل‌های حیوانی نزدیک به انسان (پریماتها)، استفاده از کشت سه بعدی بافت اندومتر در زمینه فیبرینی می‌تواند مدل مناسبی برای بررسی اثر داروها و عوامل مؤثر بر بیماری اندومتریوز باشد. علت انتخاب زمینه فیبرینی، وجود فیبرین در مایع صفاقی بیماران مبتلا به اندومتریوز به عنوان زمینه خارج سلولی مورد نیاز سلول‌های اندومتری می‌باشد. در مطالعه حاضر، تأثیر غلظت‌های مختلف داروی آتورواستاتین بر کشت بافت اندومتر انسانی در زمینه سه بعدی فیبرینی مورد بررسی قرار گرفته است.

روش بررسی

جمع‌آوری نمونه‌ها: نمونه‌های مورد استفاده برای کشت بافت اندومتر از 8 بیماری که در سن باروری بودند و به منظور درمان بیماری‌های خوش‌خیم رحمی مانند فیبروم یا میوم در مرکز آموزشی‌ـ درمانی معتضدی کرمانشاه تحت جراحی هیسترکتومی قرار گرفته بودند تهیه گردید. معیارهای خروج از مطالعه شامل بدخیمی‌های اندومتر (پولیپها، هایپر پلازی و سرطان)، مصرف هورمون، درمان با آگونیست‌های GnRH یا استفاده از دستگاه داخل رحمی (IUD) طی سه ماه قبل از جراحی بود. قبل از اقدام به هیسترکتومی فرم رضایت‌نامه توسط کلیه بیماران کامل گردید.

کشت بافت اندومتر: قطعات بافت اندومتراز رحم‌های هیسترکتومی شده برداشته شد و چندین مرتبه با محلولHank's (Sigma, Germany) استریل و دارای آنتی‌بیوتیک شستشو داده شد و از هر نمونه 20 قطعه mm11 مناسب تهیه گردید. قطعات بافتی در ظروف کشت 24 خانه (Nunclon, Denmark) و بین دو لایه ژل فیبرینی کاشته شدند. در ابتدا به هر خانه این ظرف، ml5/0 محلول فیبرینوژن (Sigma, Germany) mg/ml 3 حل شده در محیط کشت M199 (GIBCO, Germany) و l10 ترومبین (Sigma, Germany) اضافه گردید. ظروف کشت در انکوباتور (Memmert, Germany) با درجه حرارت ºC37، O2 95%، CO2 5% و رطوبت 95% قرار داده شدند. پس از تشکیل ژل فیبرین، قطعات بافت اندومتر در سطح هر خانه قرار داده شد و لایه دوم محلول فیبرینوژن و ترومبین به آن اضافه شد. در هر ظرف کشت، چاهک‌های ردیف اول به عنوان گروه کنترل، ردیف دوم گروه M 1/0، ردیف سوم گروه M1 و ردیف چهارم به عنوان گروه M10 در نظر گرفته شد. خانه‌های کنترل ml 1 از محیط کشت M199 حاویFBS به میزان 5% (GIBCO, Germany)، e-aminocaproic acid به میزان 1/0% (Sigma, Germany)،L-glutamin با غلظت mM2 (GIBCO, Germany)، بی‌کربنات سدیم با غلظت gr2/2 (Merck, Germany) و آنتی‌بیوتیک (آمفوتریسین g/ml5/2، پنی‌سیلین IU/ml G 50 و استرپتومایسین g/ml50) (GIBCO, Germany) و گروه‌های آزمایش به ترتیب دوزهای M1/0، M1 و M10 آتورواستاتین را دریافت نمودند. ظروف کشت طی دوره مطالعه در انکوباتور نگهداری شدند. هر 72 ساعت یکبار، تعویض محیط کشت مربوط به تمامی گروه‌های کنترل و دارو صورت گرفت و بافت‌های کشت داده شده توسط میکروسکوپ معکوس (Motic-AE31, Spain) و با بزرگنمایی‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت و تغییرات ایجاد شده در بافتها شامل ظاهر بافت اصلی، رسوب سلولی، ایجاد زوائد بافتی، رشد و تغییر شکل ایجاد شده در توده اصلی و ایجاد توده‌های غده‌ای شکل نیز ثبت شدند. در آخرین روز مطالعه (روز بیست و یکم)، طبق جدول معیارها (جدول 1) نمره‌دهی بافتها توسط دو نفر به صورت مجزا انجام و میانگین نمرات مورد استفاده قرار گرفت. نمره دهی بر اساس مشاهده تغییرات مربوط به توده اصلی بافت، رشد و ایجاد زوائد سلولی، جداشدن سلول ها از توده اصلی و ایجاد رسوب سلولی، رشد و توسعه غدد اندومتری، تغییر شکل سلول های استروما و اپی تلیال و هجوم سلول‌های اندومتر به ژل فیبرینی در هر چاهک کشت انجام شد.

آنالیز تصاویر: تصاویر حاصل از قطعات بافت اندومتر با استفاده از نرم افزار تحلیل گر Motic مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. با استفاده از این نرم افزار، ابتدا مساحت بافت کشت داده شده اصلی اندازه‌گیری شد و در ادامه مساحت کل زوائد بافتی که در اطراف بافت اصلی رشد نمودند محاسبه گردید. به منظور به دست آوردن شاخص رشد زوائد از فرمول زیر استفاده شد:

شاخص رشد زوائد= (مساحت کل زوائد بافتی‌ـ مساحت بافت کشت داده شده اصلی) (7).

رنگ آمیزی ایمونو هیستوشیمی: پس از پایان دوره مطالعه، قطعات بافت اندومتر که در بین دو لایه ژل فیبرین قرار گرفته بودند از خانه‌های کشت خارج شده و در محلول پارافرمالدئید 4% قرار داده شدند. در ادامه به منظور بررسی ساختار بافتی، فرآیند آماده‌سازی و قالب‌گیری انجام گردید و سپس مقاطع پارافینی 7-5 میکرونی از آنها تهیه و لامها با روش هماتوکسیلین‌ـ ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. همچنین تعدادی از برش‌های پارافینی به منظور تائید ساختار های سلولی رشد یافته درون ژل فیبرین، با روش ایمونوهیستوشیمی و با آنتی‌ویمنتین (شاخص سلول‌های ا سترومای اندومتر)، آنتی سیتوکراتین (شاخص سلول‌های اپی‌تلیال) و آنتی CD31 (شاخص سلول‌های آندوتلیال) رنگ‌آمیزی شدند .

آنالیز آماری: داده‌ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS (نسخة 5/11) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. داده‌های حاصل از آنالیز عکسها توسط آزمون آماری ANOVA یکطرفه و آزمون Tukeys Post Hoc و داده‌های مربوط به نمره‌دهی بافتها توسط آزمون فریدمن مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در تمامی گروه‌ها، 05/0p< به عنوان اختلاف معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

مهمترین تغییرات بافتی که طی هفته اول در بافتها مشاهده شد، شامل رشد زوائد بافتی و هجوم سلولها به داخل ژل فیبرین و تشکیل انشعابات سلولی طویل بود (شکل 1- الف و ب). نکته قابل توجه در انتهای هفته اول وجود بیرون زدگی‌های شعاعی در اطراف بافت اصلی (شکل 2) در 5/92% از خانه‌های گروه کنترل بود. ساختارهای مشابه در 5/82% در گروه M 1/0، 50% در گروه M1 و 5% در گروه M10 مشاهده شد (شکل 2).

طی هفته دوم، سلول‌های رسوب یافته کم کم حالت کلونی‌های سلولی منظم را به خود گرفتند که دارای ساختار غده‌ای شکل بودند و زوائد بافتی هم بیش از پیش رشد نموده و طویل شده بودند (شکل 1، ج). در طی هفته سوم رشد، تغییر قابل توجهی شامل رشد سلول‌های استرومای دوکی و ستاره‌ای شکل در اطراف بافت اصلی مشاهده شد (شکل 1، د). در گروه M1و M10 رشد بافتها تنها محدود به شکل‌گیری رسوبات سلولی در اطراف بافت اصلی بود که بر خلاف گروه کنترل و M1/0 این رسوبات در ادامه رشد حالت غده‌ای شکل به خود نگرفته و رشد آنها متوقف گردید.

آنالیز آماری داده‌های حاصل از نمره‌دهی بافتها (جدول 2) نشان داد میانگین نمرات گروه کنترل برابر با 84/0 1/3، گروه Mµ1/0 برابر با 85/0 43/3 در گروه Mµ1 برابر با 16/14/2 و گروه M10 برابر با 49/0 73/0 بود. همانطور که در این جدول مشاهده می‌شود، میانگین نمرات مربوط به گروه Mµ1/0 از سایر گروه‌ها و حتی از گروه کنترل بالاتر می‌باشد.

در بخش مربوط به آنالیز تصاویر، متوسط شاخص رشد زوائد بافتی در گروه کنترل با m95/128019، در گروه Mµ1/0 برابر باm 89/131891، در گروه M 1 برابر با m 60/86481 و در گروه Mµ10 برابر باm21/31552 بود (نمودار 1).

این نتایج نشان می‌دهد که غلظت M 1/0 داروی آتورواستاتین، رشد زوائد بافتی را در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی‌داری (05/0p<) افزایش می‌دهد؛

در حالی که غلظت Mµ1آتورواستاتین باعث کاهش معنی‌دار میزان رشد زوائد (05/0p<) و غلظت Mµ10 آتورواستاتین نیز به طور معنی داری باعث کاهش میزان رشد زوائد سلولی (001/0 p<) در مقایسه با گروه کنترل می گردد.

همچنین رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برش‌های پارافینی نشان می‌دهد که کشت قطعات بافت اندومتر با آنتی‌بادی‌های آنتی‌ویمنتین، آنتی‌سیتوکراتین و آنتی CD31 واکنش مثبت دارد ( شکل 3، الف و ب).

بحث

در مطالعه حاضر تأثیر غلظت‌های مختلف داروی آتورواستاتین (Mµ1/0، Mµ1 و Mµ 10) بر بافت اندومتر انسانی کشت داده شده در زمینه سه بعدی فیبرینی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که آتورواستاتین دارای اثرات دوگانه‌ای بر رشد بافت اندومتر می‌باشد، به طوری که این دارو در دوز پایین (Mµ1/0) منجر به افزایش رشد بافت در مقایسه با گروه کنترل می‌شود. اما دوزهای بالاتر آتورواستاتین (Mµ 1 و Mµ 10) رشد را نسبت به گروه کنترل کاهش می‌دهند که این کاهش رشد شامل کاهش تکثیر سلولی و کاهش میزان رگ‌زایی می‌باشد.

فرآیند رگ‌زایی در بافت اندومتر نابجا به عنوان یکی از مکانیزم‌های مهم در پاتوژنز بیماری اندومتریوز شناخته شده است (9). درمان‌های دارویی جدید بیماری اندومتریوز براساس استفاده از ترکیباتی بنیان شده‌اند که قادر به مهار پدیده رگ‌زایی باشند. مطالعات موجود در زمینه تأثیر استاتینها بر پدیده رگ‌زایی تا حدودی متضاد می‌باشد.

Vincent و همکاران بیان کردند استاتینها قادر به کاهش تکثیر سلول‌های آندوتلیال و مهاجرت آنها می‌باشند (16)؛ در حالی که Kureishi و همکاران گزارش کردند داروی سیمواستاتین محرک پدیده رگ زایی می‌باشد که احتمالاً از طریق فعال‌سازی فاکتور پروتئین کینازAkt/Pk B سلول‌های آندوتلیال این اثر را اعمال می‌کنند (17).

Weis و همکاران گزارش کردند که استاتینها دارای اثرات وابسته به دوز دوگانه‌ای در رگ‌زایی هستند که به صورت مستقل از تأثیر این ترکیبات بر میزان چربی خون می‌باشد. آنها بیان کردند تکثیر، مهاجرت و تمایز سلول‌های آندوتلیال در غلظت‌های پایین (Mµ 01/0-005/0) استاتینها افزایش یافته اما به طور مشخصی در غلظت‌های بالا (Mµ 1- 005/0) کاهش می‌یابد. همچنین این محققین بیان کردند که اثرات ضد رگ‌زایی استاتینها در غلظت‌های بالا در ارتباط با کاهش ترشح VEGF از سلول‌های آندوتلیال و همچنین افزایش آپوپتوز در این سلولها می‌باشد (18). نتیجه به دست آمده از مطالعه Weis و همکاران با نتیجه مطالعه ما مشابه است،لازم به ذکر است که در مطالعهWeis اثرات استاتین ها بر سلول های اندوتلیال بررسی شده است که احتمالا همین امر علت اختلاف دوز دارویی به کار گرفته شده می باشد. Rorowski و همکاران بیان کردند که استاتینها دارای اثرات پیش‌رگزایی بوده که منجر به تحریک رشد عروق جدید می‌شوند و همچنین تولید اکسیدنیتریک (NO) توسط سلول‌های آندوتلیال را افزایش می‌دهند (19).

Walterو همکاران بیان کردند که استاتینها باعث حرکت و تمایز سلول‌های اجدادی آندوتلیال مشتق شده از مغز استخوان می‌شوند که رگزایی و ایجاد پوشش آندوتلیالی مجدد را سبب می‌شود (20). اسفندیاری و همکاران در طی مطالعه مشابهی غلظت‌های M1، M5 و M10 داروی لوواستاتین را بر کشت بافت اندومتر انسانی نشان دادند. آنها بیان کردند که داروی لوواستاتین در غلظت‌های ذکر شده دارای اثرات مهارکننده رشد بافت اندومتر می‌باشد و هیچگونه اثر دوگانه‌ای را گزارش نکردند (14). درحالی که در مطالعه حاضر نشان داده شد که داروی آتورواستاتین دارای تأثیرات وابسته به دوز دوگانه‌ای بر رشد بافت اندومتر انسانی در محیط کشت سه بعدی فیبرین می‌باشد. با توجه به این نتایج به نظر می‌رسد که استفاده از استاتینها به عنوان داروی جدید جهت درمان بیماری اندومتریوز قادر به مهار رشد بافت اندومتر نابجا باشد.

از طرف دیگر اندومتریوز بیماری وابسته به استروژن می‌باشد (22) و همانطور که قبلاً اشاره شد استاتینها منجر به مهار سنتز کلسترول می‌شوند. کلسترول یکی از پیش سازهای لازم جهت ساخت هورمون‌های استروئیدی از جمله استروژن است. با توجه به این مساله می‌توان احتمال داد که استاتینها قادر به کاهش سنتز هورمون استروژن هستند که این می‌تواند یکی از مکانیزم‌های احتمالی دیگر استاتینها در مهار رشد قطعات بافت اندومتر کشت داده شده در زمینه سه بعدی فیبرینی باشد.

نتیجه گیری

استاتینها داروهای رایج در درمان افزایش چربی خون می‌باشند که دارای عوارض جانبی محدودی هستند. احتمال می‌رود که تجویز استاتینها در طی دوره قاعدگی و چند روز پس از این دوره منجر به کاهش فعالیت سلول‌های اندومتر شود که از طریق خون قاعدگی وارد حفره شکمی شده‌اند. این کاهش فعالیت از طریق کاهش تکثیر سلولی و رگ‌زایی می‌باشد. مشاهدات کنونی مبنی بر تعدیل پدیده رگ زایی توسط مهار آنزیم reductase HMG-CoA می‌تواند به عنوان پایه و اساسی برای درمان اندومتریوز و سایر بیماری‌های وابسته به آنژیوژنز توسط این دسته دارویی باشد. مطالعات In vitro و In vivo بیشتری جهت شناسایی تأثیرات بالقوه استاتینها در پیشگیری و مهار پیشرفت بیماری اندومتریوز پیشنهاد می‌شود.

تشکر و قدر دانی

نویسندگان این مقاله تشکر صمیمانه خود را از جناب آقایان دکتر پرویز صیادی و دکتر سید حمید مدنی بابت کمک در انجام پروژه اعلام می‌دارند. همچنین از معاونت محترم آموزشی و پژوهشی دانشگاه به دلیل تصویب این طرح تحقیقاتی و تأمین هزینه آن سپاسگزاری می‌شود.