Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Evaluating the presence of testis specific transcripts in mature human spermatozoa

Authors
Feryal Aslani 1
Mohammad Mehdi Akhondi 2
Mohammad Hossein Modarresi 3
Ashraf Shabani 1
Mahmood Aarabi 2
Mohammad Reza Sadeghi 3
1 Department of Biology, Faculty Basic Sciences, Alzahra University, Tehran, Iran
2 Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, ACECR, Tehran, Iran
3 Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Science, Tehran, Iran
Abstract
Introduction: Progress and completion of spermatogenesis is related to simultaneous expression of various genes. Recent studies show that many genes are expressed in the sperm and several RNA copies are present in the mature spermatozoa. Identification of these genes and evaluation of their functions would improve our understanding of the molecular basis of fertilization, early embryo cleavage and the causes of many types of unexplained male infertility. In this study, we investigated the expression of DAZ, PRM1, PRM2, TSGA10, SYCP3 and AKAP4 genes in ejaculated human spermatozoa. Materials & Methods: Semen samples were collected from men referring to Avicenna Infertility Clinic. Normal semen samples (According to WHO criteria) were subjected to density-gradient centrifugation to specifically recover the pure fraction of motile spermatozoa with normal morphology. Total RNA was extracted from sperm pellets and cDNA was synthesized using RT-PCR. The presence of DAZ, TSGA10, PRM1 and PRM2 cDNAs were evaluated using appropriate primers. Expression of SYCP3 (Testis specific gene) was evaluated by nested RT-PCR. The cDNA synthesized from normal testis tissues was used as positive control. Results: Study on cDNAs showed that DAZ, TSGA10, PRM1 and PRM2 transcripts were present in normal human testis and all of the evaluated mature spermatozoa samples but not AKAP4 or SYCP3 transcripts. Conclusion: According to our previous study, the expression of SYCP3 and AKAP4 genes is started from spermatocyte level in human testis during spermatogenesis process. However, we did not found any transcripts of these genes in mature spermatozoa. It is estimated that mRNAs of TSGA10, PRM1, PRM2 and DAZ and other testis specific genes in spermatozoa may participate in later sperm functions such as fertilization and early embryo cleavage. Therefore, further studies are needed to understand the role of these transcripts in the process of fertilization and early embryo development.
Keywords
Gene expression
spermatogenesis
Spermatozoa
Testis
specific genes
Transcript

زمینه و هدف

اسپرم بالغ سلولی کاملاً تخصصی و تمایز یافته است که تاکنون تصور بر این بود که تنها نقش انتقال ژنوم پدری به تخمک را بر عهده دارد. در واقع با جایگزینی هیستونها با پروتامین‌های کوچک غنی از اسیدهای آمینه آرژینین، لیزین و سیستئین بیان ژن در

هسته اسپرم به تدریج در طول اسپرمیوژنز خاموش می‌شود و در نتیجه متراکم شدن ژنوم هاپلوئید

تسهیل می‌گردد (1).

امروزه با پیشرفت‌های شگرفی که در حوزه پزشکی مولکولی صورت گرفته است بررسی محتوای RNA اسپرماتیدهای در حال رشد با استفاده از تکنیک‌هایی که بیان تعداد زیادی از ژنها را به‌طور همزمان بررسی می‌کنند مانند Northern Blot و Microarray امکان‌پذیر شده است. بسیاری از این ژنها، ژن‌های اختصاصی بیضه هستند (SYCP3، DAZ، AKAP4، PRM2، PRM1، TSGA10)؛ ولی برخی از این رونوشتها، اختصاصی بافت بیضه نمی‌باشند و در سایر بافتها و سلولها نیز بیان می‌شوند (مانند β-actin)، علاوه بر این تعدادی از رونوشت‌های غیر اختصاصی بیضه با اندازه‌های غیرمعمول از سایر بافتها و یا واریانت‌هایی با طول و عملکرد متفاوت از ژن‌های سوماتیکی در بافت بیضه یافت می‌شوند (2). مطالعه این رونوشتها در شناسایی مولکولی مراحل اسپرماتوژنز، لقاح تخمک و مراحل اولیه تکوین جنین و نیز ارتباط ژنها با فنوتیپ ناباروری مردان و نیز استفاده از آن در روش‌های تشخیصی، اهمیت دارد (3).

شواهد جدید وجود ترجمه برخی از این رونوشت‌های موجود در اسپرم را به تناسب نیاز اسپرم بالغ

تأیید می‌کنند (4). با این وجود اسپرم بالغ حاوی مقادیر کافی RNA ریبوزومی S18 و S28 (و بنابراین کمپلکس ریبوزومی S80) نمی‌باشد تا فرآیند ترجمه را مشابه سایر سلولها انجام دهد. به نظر می‌رسد محتوای RNA ریبوزومی در طول بالغ شدن اسپرم شکسته و

حذف می‌شود و مقادیری از mRNA به‌صورت انتخابی نگهداری می‌شود (5).

Hecht و Williams برای اولین بار حضور قطعی سنتز RNA در هسته اسپرم را نشان دادند (6). حضور RNA در داخل هسته اسپرم بالغ با روش هیبریداسیون در محل توسط Pessot مجدداً گزارش شد (7). Kumar و همکاران حضور mRNA ژن C-MYC را در اسپرم انسان در ناحیه میانی و دم اسپرم نشان دادند (8). Miller و همکاران شواهدی مبنی بر حضور چندین mRNA شامل HSP90، B-actin، HSP70 در اسپرم خالص (عاری از هرگونه آلودگی با سایر سلولها از جمله لوکوسیتها و سلول‌های اپیتلیال) را گزارش کردند (9). Wykes و همکاران با استفاده از روش هیبریداسیون در محل حضور RNA در اطراف هسته سلول را مشخص کردند (10).

ارزیابی اطلاعات با استفاده از Microarray نشان داده است که اسپرم بالغ انسان حدود 5000 نوع mRNA دارد که این تعداد در بین نمونه‌های مختلف 10% تفاوت دارد (11). بسیاری از شواهد بر این نکته تاکید دارد که شاید انتقال این محتوای RNA به اووسیت به اندازه انتقال ژنوم هاپلوئید اهمیت داشته باشد و امروزه شواهدی مبنی بر انتقال برخی صفات پدری به فرزند از طریق همین رونوشت‌های موجود در اسپرم وجود دارد (12). چنانچه این رونوشتها که قبلاً تصور می‌شد تنها بقایای روند اسپرماتوژنز هستند، در تمایز اولیه جنین نقش داشته باشند، این یافته‌ها می‌تواند در پیشبرد تکنولوژی انتقال هسته سلول سوماتیکی در کلونینگ و همچنین شناسایی عوامل موثر در ایجاد ناباروری مفید باشند (13).

حضور RNA در اسپرم و در حقیقت وجود بیان ژن

در این سلولها از بیش از 30 سال قبل موضوع بحث

بوده است. علاقه به این موضوع در 5 سال اخیر به‌دلیل گسترش فن‌آوری‌های مولکولی مدرن و نیاز به ابداع روش‌های غیرتهاجمی برای مطالعه و بررسی عملکرد بیضه، مجدداً افزایش یافته است (14). چنانچه اسپرم بتواند اطلاعات ارزنده‌ای از رویدادهای مولکولی داخل بیضه در اختیار بگذارد، در آن صورت نمونه مایع منی حاصل از یک روش غیرتهاجمی برای ارزیابی روند اسپرماتوژنز در بیضه انتخابی بهتر و قابل قبول‌تر از بیوپسی خواهد بود. در واقع یکی از موارد اولیه استفاده RNA اسپرماتوزومی استفاده از آن به‌عنوان یک مارکر مولکولی حساس و کاربردی جهت تعیین موفقیت وازکتومی در انسان بوده است. برای تعیین عدم وجود اسپرم در مایع منی، حضور مارکر مولکولی اختصاصی اسپرم مانند PRM-2 توصیه شده است (15).

نظریه‌های متعددی درباره علت نگهداری برخی رونوشتها در گامت نر وجود دارد. در طی روند اسپرماتوژنز پلهای سیتوپلاسمی که اسپرماتیدهای در حال تمایز را به یکدیگر متصل می‌کند، امکان تبادل محصولات ژنی در این سلولها را فراهم می‌کند. برخی از اسپرماتوسیتها و اسپرماتیدها ممکن است فاقد رونوشت‌های ضروری مورد نیاز برای تکمیل فرآیندهای اسپرماتوژنز و اسپرمیوژنز باشند. این سلولها می‌‌توانند رونوشت‌‌‌های مورد نیاز را از طریق سلول‌‌های مجاور تأمین کنند و روند اسپرماتوژنز را تکمیل نمایند. می‌توان گفت که این تبادل ژنی تولید اسپرم طبیعی را افزایش می‌دهد (16). سایر نظریه‌ها بر خلاف این فرضیه هستند و نقش RNA برای خود اسپرم (احتمالاً نقش ساختاری) که متفاوت از نقش عملکردی RNA در سنتز پروتئین است و یا نقش ناشناخته RNA پس از انتقال به تخمک را عنوان می‌کنند. شواهد موجود تأییدکننده آن است که علاوه بر سانتروزوم تعدادی از رونوشت‌های اسپرم در زمان لقاح به تخمک منتقل می‌شوند. زیرا بعد از لقاح تعدادی از این رونوشتها را در تخمک‌های بارور شده شناسایی کرده‌اند (13،11). گزارش Rassoulzadegan و همکاران نشان داد که انتقال RNA اسپرم به تخمک، در نتیجه یک رویداد مستقل از منشاء سانتروزومی، صورت می‌گیرد (17).

از طرف دیگر با توجه به طیف گسترده علل ناباروری در مردان انجام تحقیقات سیستماتیک در مورد شناسایی علل آن بسیار دشوار است. با فرض اینکه RNA اسپرم تصویری کلی از پتانسیل اسپرماتوژنیک بیضه را مشخص می‌کند، می‌توان از این منبع برای تحقیقات ناباروری مردان استفاده کرد (18).

در مطالعه حاضر بیان ژن‌های PRM2، PRM1، TSGA10، DAZ (19) AKAP4، SYCP3 برای اولین بار در اسپرم بالغ انسان بررسی شد که هر یک از این ژنها دارای نقش‌های اختصاصی در روند اسپرماتوژنز و بیضه می‌باشند؛ زیرا روند طبیعی اسپرماتوژنز ناشی از بیان متناسب گروهی از ژن‌های اختصاصی در سلول‌های اسپرماتوژنیک می‌باشد که برخی از آنها در تمامی مراحل و برخی در مراحل خاصی از روند اسپرماتوژنز بیان می‌شوند. نتیجه فعالیت گروهی از این ژنها جفت شدن کروموزوم‌های هومولوگ، سیناپس و نوترکیبی و به‌دنبال آن جدا شدن کروماتیدهای خواهری ضروری می‌باشد که انجام صحیح این فرآیندها به کمک ساختارهای ویژه پروتئینی به نام پروتئین کمپلکس سیناپتونمال (SC) تنظیم می‌شود (20).

در پستانداران پروتئین‌های SC شامل سه گروه SCP1، SCP2 وSCP3 هستند که به نام SYCP3 خوانده می‌شوند. بیان SYCP3 منحصراً در رده بلوغی سلول‌های ژرمینال بیضه (در مرحله اسپرماتوسیت) انجام می‌گیرد. فقدان این ژن سبب اختلال در اسپرماتوژنز و باروری فرد می‌شود (21). ژن‌های DAZ گروهی از ژن‌های مستقر روی کروموزوم Y را تشکیل می‌دهند که در افراد مبتلا به آزواسپرمی حذف‌های متعددی در این نواحی دیده می‌شود. حداکثر تجمع رونوشت‌های ژن DAZ در اسپرماتوسیت‌های اولیه گزارش شده که بیانگر آغاز رونویسی در مرحله اسپرماتوگونی می‌باشد (22،23). A-Kinase Anchor Protein-4 (AKP4) فراوانترین پروتئین موجود در Fibrous sheat (ساختار اسکلت سلولی موجود در ناحیه ابتدایی تاژک اسپرم) می‌باشد و تنها در مراحل بعد از میوز بیان می‌شود. در غیاب AKAP4 انتقال پیام و فعالیت‌ آنزیم‌های گلیکولیتیک ارتباط خود را با Fibrous sheat از دست داده و در نتیجه حرکت اسپرم مختل می‌شود (24). Testis Specific Gene Antigen (TSGA10) در رویان، بیضه و بسیاری از انواع تومورهای سرطانی بیان می‌شود. شواهدی مبنی بر دخالت TSGA10 در تقسیم سلولی وجود دارد (25). پروتئین TSGA10 در ناحیه Fibrous sheat دم اسپرم شناسایی شده است. علاوه بر این بیان این ژن در مراحل تمایز در جنین موش گزارش شده است (26). با توجه به نقش گسترده این ژنها در روند اسپرماتوژنز، ارزیابی وجود یا عدم وجود آنها در اسپرم بالغ اطلاعات ارزشمندی از عملکرد اسپرم و نقش mRNA آن در انجام این عملکرد در اختیار قرار خواهد داد.

روش بررسی

افرادی که جهت انجام اسپرموگرام و درمان ناباروری به مرکز درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا مراجعه کرده بودند و علت ناباروری در آنها ناشی از عامل زنانه بود، پس از اعلام رضایت برای شرکت در مطالعه، انتخاب شدند. نمونه اضافی مایع منی 5 فرد دارای پارامترهای اسپرمی طبیعی (مطابق استانداردهای WHO)، پس از انجام اسپرموگرام تشخیصی آنها جمع‌آوری شد. اسپرم‌های متحرک دارای مورفولوژی طبیعی با استفاده ازPure Sperm® (Nidacon, Sweden) طی مراحل سانتریفوژ شیب غلظت به‌صورت خالص از نمونه‌های مایع منی جدا سازی گردید. برای این منظور با افزودن محیط کشت Ham’s F-10 (Sigma, USA) غلظت‌های 40% و 80% Pure Sperm تهیه گردید. سپس در یک لوله سانتریفوژ ابتدا ml2 از غلظت 80% و روی آن ml2 از غلظت 40% Pure Sperm اضافه شد. افزودن لایه‌ها به گونه‌ای انجام شد که دو لایه با هم مخلوط نشود. سپس روی آن ml2 مایع منی اضافه و به مدت min20 با دور g300 سانتریفوژ شد. پس از آن اسپرم‌های رسوب کرده از لایه 80% با دقت و بدون مخلوط شدن با سایر لایه‌ها جدا گردید. پس از شستشوی اسپرمها با محیط کشت به آن حدود ml7/0 از محلول RNA-Bee(Tel-Test Inc., USA) اضافه و برای استخراج RNA در ازت مایع (C196-) به آزمایشگاه مولکولی منتقل گردید. نمونه بیوپسی بیضه طبیعی حاوی تمام رده‌های اسپرماتوژنی به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

استخراج RNA: RNA نمونه‌های اسپرم و بیضه با استفاده از RNA-Bee (Tel-Test Inc., USA) و طبق روش فنول‌ـ کلروفرم استخراج گردید (27). نمونه‌های RNA تا زمان انجام آزمایش در C70- نگهداری شد. کیفیت RNA استخراج شده با تعیین نسبت A260/A280 ارزیابی گردید (2> >7/1).

انجام RT-PCR: ابتدا l1 از Total RNA حاوی

gμ150 RNA به مدت 7 دقیقه در دمای C65 قرار گرفت تا اتصالات دو رشته‌ای RNA شکسته شوند. سپس به همراه (Fermentase, EU) 5X Reaction Buffer، lμ2 (10mM) dNTP (Roche, Germany)، lμ2 Random hexamer (20mM) (Roche, Germany)

و lμ1 از آنزیم(200U/µl) M-MuLV RT

(Fermentase, EU) به مدت 60 دقیقه در دمای C42 جهت سنتز cDNA و 10 دقیقه در C95 جهت غیر فعال شدن آنزیم قرار داده شد.

برای کنترل کیفیت مراحل استخراج RNA و سنتز cDNA از ژن house keeping بتا اکتین استفاده شد. سپس نمونه‌های حاوی رونوشت بتا اکتین به عنوان نمونه‌های مثبت برای انجام مراحل بعدی انتخاب شدند.

برای انجام کنترل و صحت شناسایی رونوشتها از هر جفت پرایمر یک عدد به گونه‌ای طراحی شد که بر روی دو اگزون مجاور قرار گیرد، در این حالت باند مورد انتظار برای RNA کوچکتر از باند احتمالی DNA ژنومیک خواهد بود (28).

انجام PCR: نمونه cDNA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحی شد (جدول1)، با استفاده از بانک ژنی و BLAST (جدول 1)، مربوط به ژن SYCP3در واکنش PCR تکثیر شده و سپس متعاقب آن واکنش دوم PCR با استفاده از محصول PCR اول و پرایمرهای اختصاصی Nested انجام گرفت. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌های PRM1، PRM2، TSGA10، AKAP4 و DAZ و واکنش PCR یک مرحله‌ای انجام گرفت.

واکنش PCR با استفاده ازcDNA نمونه‌های اسپرم طبیعی به‌صورت جداگانه، µl5/210X PCR buffer (Roche Germany)، µl5/1 (mM/l25) MgCl2، lµ1 dNTP (mM10)، µl1 پرایمر (pM10)، 2/0 آنزیم Taq polymerase (Roche, Germany) (lµ/U5) و µl8/16 DDW ، انجام گرفت. نمونه‌های cDNA ابتدا در ˚C94 به مدت 5 دقیقه به‌صورت تک رشته در آمد و پرایمرها در مدت 30 ثانیه در دمای Taبه DNA متصل شدند و به مدت 30 ثانیه در هر سیکل و 7 دقیقه در سیکل نهایی طویل سازی انجام گرفت.

انجام PCR در روی ژل آگارز (Agarose LE, Roche, Germany) 2% به مدت 45 دقیقه با ولتاژ 95 تحت الکتروفورز قرار گرفت و با اتیدیوم برماید رنگ‌آمیزی و سپس تحت تابش اشعه UV محل باندهای جداسازی شده آشکار شد.

جهت کنترل کیفی باندهای به‌دست آمده، پس از استخراج از ژل و انتقال به پلاسمید PGM5ZF در باکتری JM109، کلون و پس از تخلیص پلاسمید تعیین توالی باند انجام و با توالی موجود در بانک ژنی تطبیق داده شد (29،30).

نتایج

نتایج واکنش PCR در نمونه بافت بیضه طبیعی به عنوان کنترل مثبت برای ژن‌های فوق‌الذکر یک باند در ناحیه 155 نوکلئوتیدی مربوط به ژن β-actin، یک باند در ناحیه 842 نوکلئوتیدی مربوط به ژن SYCP3، یک باند در ناحیه 106 نوکلئوتیدی مربوط به ژن DAZ و یک باند در ناحیه 500 نوکلئوتیدی مربوط به ژنAKAP4 را نشان داد. باند مربوط به ‍ژنPRM1 در ناحیه bp132 و باند PRM2 در ناحیه bp184 مشاهده شد. باند مربوط به ژن TSGA10 در ناحیه bp100 مشاهده گردید.

ژن‌های TSGA10، PRM1، PRM2 و DAZ در نمونه‌های اسپرم بالغ و بافت بیضه بیان شدند. بیان ژن‌های AKAP4، SYCP3 در نمونه اسپرم بالغ دیده نشد؛ در حالیکه نمونه کنترل مثبت (بافت بیضه طبیعی) بیان ژن را نشان می‌دهد (شکل 1).

نتایج کلونینگ و تعیین توالی نیز صحت توالی باند مشاهده شده را تایید کرد.

بحث

در گذشته تصور بر این بود که اسپرم بالغ از نظر رونویسی خاموش است؛ شواهد اخیر نشان می‌دهد که هسته اسپرم از آنچه تصور می‌شد عضو فعال‌تری می‌باشد. تحقیقات، حضور رونویسی فعال mRNA در اسپرم را تأیید می‌کنند (19،31). مطالعات نشان داده که هسته اسپرم حاوی بخش‌های نوکلئوپروتامینی و نوکلئوهیستونی می‌باشد. قسمت‌های نوکلئوهیستونی فشردگی کمتری داشته و حساس به نوکلئاز می‌باشند و احتمالاً در بیان ژن‌های مورد نیاز برای عملکرد اسپرم نقش ایفا می‌کنند (32). امروزه می‌دانیم که بخشی از محتوای mRNA موجود در اسپرم بقایای ذخایر mRNA سنتز شده در مراحل انتهایی اسپرماتوژنز است که به اسپرم منتقل شده و بخش دیگر mRNA سنتز شده توسط سلول اسپرم می‌باشد (10،19،33). سنتز mRNA اختصاصی در اسپرم بالغ با کروماتین متراکم شده از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. بررسی مکانیسم رونویسی در اسپرم و نحوه عملکرد این رونوشتها در این سلول و در مراحل لقاح و تکوین اولیه جنین نیازمند تحقیقات مولکولی دقیق می‌باشد. سلول اسپرم با وجود پروتامینه شدن DNA و متراکم شدن هسته جهت آماده‌سازی برای انتقال به تخمک، سنتز mRNA را به‌صورت فعال انجام می‌دهد. همچنین با توجه به اینکه در برخی تحقیقات اسپرم انسان به مدت بیش از 17 روز در محیط مناسب خارج از بدن زنده نگهداری شده است (34) و با توجه به نیمه عمر کوتاه mRNA و پروتئین‌های مورد نیاز جهت فعالیت‌های سلول، اسپرم بالغ باید توانایی تولید mRNA جدید و ترجمه این رونوشتها به پروتئین را داشته باشد.

Gur در سال 2006 ترجمه mRNA اسپرم توسط ریبوزوم‌های میتوکندریایی را گزارش کرد (4). در سال 2008 توسط همین شخص نشان داده شد که اسپرم بالغ در مراحل پایانی بلوغ و قبل از انتقال به تخمک با استفاده از ذخایر mRNA خود پروتئین سنتز می‌کند. وی نشان داد که سنتز پروتئین با بکارگیری ریبوزوم‌های میتوکندریایی و بدون دخالت سیستم رونویسی سیتوپلاسمی، صورت می‌گیرد. این پروتئینها یا جایگزینی برای پروتئین‌های تجزیه شده هستند و یا پروتئینهایی هستند که در فرآیندهای لازم برای قدرت باروری اسپرم شامل ظرفیت پذیری، افزایش شدید حرکت و واکنش آکروزومی اسپرم مورد نیاز می‌باشند (35).

اخیراً نشان داده شده که مقادیری از mRNA اسپرم در زمان لقاح به تخمک منتقل شده تا در فاصله زمانی قبل از فعال شدن ژنوم جنینی با استفاده از سیستم تولید پروتئین سلول تخم بتواند به پروتئین تبدیل شود (36).

به نظر می‌رسد که رونوشت‌های موجود در اسپرم که زمانی تصور می‌شد بقایای حاصل از مراحل انتهایی اسپرماتوژنز هستند به طور فعال توسط اسپرم بالغ تولید شده و برای رشد جنین در مراحل اولیه نقش حیاتی داشته باشند. این یافته‌ها در زمینه انتقال هسته سوماتیکی در تکنولوژی کلونینگ اهمیت زیادی دارند (13).

برخی گزارشها RNA اسپرم را به‌عنوان منبع مولکولـی

تحقیقات ناباروری معرفی کرده‌اند. طی سالیان گذشته RNA اسپرم به عنوان روش تشخیصی مناسب جهت ارزیابی موفقیت وازکتومی معرفی شده است.

حضور انواع رونوشتها در مراحل مشخصی از اسپرماتوژنز نمایانگر فعالیت خاص این رونوشتها و یا پروتئین حاصل از آنها در مقطع زمانی خاص می‌باشد. حضور رونوشت ژن‌های DAZ، PRM2، PRM1 و TSGA10 در اسپرم بالغ نمایانگر نقش فعال این رونوشتها یا پروتئین آنها در عملکرد طبیعی اسپرم و احتمالاً در فعالیت‌های بعدی اسپرم طی مراحل لقاح و تکوین جنین می‌باشد. در حالیکه برخی ژنها مانند AKAP4، SYCP3 که در مراحل ابتدایی اسپرماتوژنز، تقسیم میوز و شکل‌‌گیری فرم طبیعی اسپرم بالغ نقش دارند و بقایای رونوشت‌های آنها تجزیه شده و در اسپرم بالغ نیز بیان این ژنها وجود ندارد.

احتمال دیگری که حضور این گونه رونوشتها در اسپرم مطرح شده بیان فعال و انتخابی این ژنها در اسپرم بالغ می‌باشد؛ در حالیکه برخی محققین عقیده دارند که بیان ژن در اسپرم بالغ صورت نمی‌گیرد (2،5،9،37). از طرف دیگر تحقیقات اخیر با استفاده از نمونه‌های بیضه دارای توقف در رده‌های مشخصی از اسپرماتوژنز مرحله بیان ژن‌های اختصاصی بیضه را تعیین کرده‌اند که ژن اختصاصی بافت بیضه از چه مرحله‌ای شروع به بیان کرده و در چه مرحله‌ای از اسپرماتوژنز بیان آن متوقف شده و عملکرد پروتئین حاصل از آن در چه مرحله‌ای بروز می‌کند. به‌عنوان مثال در مطالعه Arabiنشان داده شد که بیان ژن SYCP3 از مرحله اسپرماتوسیت اولیه آغاز و در مرحله اسپرماتید متوقف می‌شود (21). بنابراین نتایج حاصل از این مطالعه مبنی بر عدم حضور رونوشت‌های SYCP3 در اسپرم نشان‌دهنده عدم انتقال تمامی بقایای mRNA از اسپرماتید به اسپرم بوده و رونوشت‌های موجود در اسپرم بالغ به‌صورت فعال پس از مرحله اسپرمیوژنز تولید شده‌اند. چنانچه رونوشت مواردی در مراحل اولیه اسپرماتوژنز شامل اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه و ثانویه حضور نداشته باشد، اما در اسپرم بالغ حضور آنها تأیید شود می‌توان نتیجه گرفت که این ژن به‌طور فعال در مراحل پایانی اسپرماتوژنز بیان

شده است.

از طرف دیگر حضور رونوشت پروتامینها (2و1) در اسپرم بالغ که کروماتین آن متراکم شده است این سئوال را مطرح می‌کند که علت حضور آن چیست؟ آیا در مراحل اولیه لقاح نقش دارد؟ از طرفی در جنین نیز باید این پروتامینها از اطراف کروماتین اسپرم جدا شوند تا پیش‌هسته پدری تشکیل شود. دلیلی که می‌توان برای این حضور تصور نمود، تداوم پروتامینه شدن کروماتین اسپرم پس از بلوغ و رها شدن آن در لوله‌های سمینیفروس و مایع منی است؛ زیرا همانطور که قبلاً اشاره شد در اسپرم بالغ علاوه بر نواحی پروتامینه در کروماتین، نواحی هیستون‌دار نیز وجود دارند. احتمالاً این نواحی همان نواحی فعال برای نسخه‌برداری از DNA باشند که در صورت نیاز مکانیسم کنترل داخل سلول در مراحل مختلف این نواحی هیستون‌دار را با پروتامین جایگزین نمایند. تأیید این مطالب نیازمند انجام مطالعات روی کروماتین اسپرم می‌باشد. به‌طوریکه در مطالعه Wykes

نشان داده شده که PRM1 و PRM2 در اسپرم به همان نسبتی است که در بیضه وجود دارد (PRM1<PRM2) (38).

بنابراین به نظر می‌رسد که ژن‌های مختلف بر حسب نیاز سلول و به‌صورت انتخابی در مراحل مختلف بیان می‌شود و اسپرم بالغ نیز با بیان ژن‌های دخیل در بسته‌بندی و فشرده‌سازی و در نهایت آماده‌سازی سلول جهت انتقال ژنوم پدری به تخمک، نیاز خود را مرتفع می‌سازد.

نتیجه گیری

در مطالعه حاضر برای اولین بار نشان داده شد که ژن‌های DAZ و TSGA10 نه تنها در بیضه طبیعی بلکه در اسپرم بالغ انسان نیز بیان می‌شوند؛ که این امر آنها را به مارکرهای مولکولی مناسب جهت تعیین حضور اسپرم و بررسی وضعیت اسپرماتوژنز در مردان نابارور، بدون نیاز به انجام عمل تهاجمی بیوپسی بیضه، تبدیل می‌کند. همچنین بیان ژن‌های PRM2 و PRM1 در اسپرم بالغ تأیید شد (16).

بیان ژن‌های AKAP4، SYCP3 نیز برای اولین بار در اسپرم بالغ بررسی شد. نتایج نشان‌دهنده بیان این سه ژن در نمونه بیوپسی بیضه طبیعی و عدم بیان آنها در اسپرم بالغ انسان می‌باشد. مطالعات قبل نشان داده بود که رونوشت ژن SYCP3 در مرحله اسپرماتوسیت اولیه حضور دارد (21)؛ اما RNA این ژن در اسپرم بالغ وجود نداشت. حذف این رونوشتها در مراحل پایانی احتمالاً به‌دلیل اتمام عملکرد این رونوشتها و عدم نیاز اسپرم بالغ به این رونوشتها برای عملکردهای بعدی خود می‌باشد.

تحقیقات بیشتر روی RNA اسپرم بالغ روند رو به رشد استفاده از ابزارهای دقیق مولکولی جهت روش‌های تشخیصی را تسریع می‌کند. این امر منجر به آگاهی از فرایند مولکولی لقاح در انسان و سایر پستانداران و نیز شناسایی علل مولکولی بسیاری از موارد ناباروی خواهد گردید که امروزه برای ما ناشناخته می‌باشد و در رده ناباروریها با علت نامشخص تقسیم‌بندی می‌شود.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از همکاری صمیمانه مدیر محترم مرکز فوق تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا، جناب آقای دکتر مدبری و کارشناسان حوزه پژوهش سرکار خانم سوادی شیرازی و سرکار خانم اصغری تشکر و قدردانی می‌نمایند.

  1. Miller D, Ostermeier GC. Towards a better under-standing of RNA carriage by ejaculate spermatozoa. Hum Reprod Update. 2006;12(6):757-67.
  2. Zhang H, Denhard LA, Zhou H, Liu LH, Lan ZJ. 0610009K11Rik, a testis-specific and germ cell nuclear receptor-interacting protein. Biochem Biophys Res Commun. 2008;366(4):898-904.
  3. Galeraud-Denis I, Lambard S, Carreau S. Relationship between chromatin organization, mRNAs profile and human male gamete quality. Asian J Androl. 2007;9 (5):587-92.
  4. Wang H, Zhou Z, Xu M, Li J, Xiao J, Xu ZY, et al. A spermatogenesis-related gene expression profile in human spermatozoa and its potential clinical applica-tions. J Mol Med. 2004;82(5):317-24.
  5. Akhondi MA, Chapple C, Moore HD. Prolonged survival of human spermatozoa when co-incubated with epididymal cell cultures. Hum Reprod. 1997;12 (3):514-22.
  6. Gur Y, Breitbart H. Protein synthesis in sperm: Dialog between mitochondria and cytoplasm. Mol Cell Endo-crinol. 2008;282(1-2):45-55.
  7. Boerke A, Dieleman SJ, Gadella BM. A possible role for sperm RNA in early embryo development. Therio-genology. 2007;68 Suppl 1:S147-55.
  8. Miller D, Ostermeier GC, Krawetz SA. The contro-versy, potential and roles of spermatozoal RNA. Trends Mol Med. 2005;11(4):156-63.
  9. Wykes SM, Visscher DW, Krawetz SA. Haploid transcripts persist in mature human spermatozoa. Mol Hum Reprod. 1997;3(1):15-9.
  10. Miller D. RNA in the ejaculate spermatozoon: a window into molecular events in spermatogenesis and a record of the unusual requirements of haploid gene expression and post-meiotic equilibration. Mol Hum Reprod. 1997;3(8):669-76.
  11. Badawy SZ, Shue F, Chohan K, Hearn B. Varicoceles and sperm nuclear fragmentation? Fertil Steril. 2006;86 (4):1031.
  12. Gur Y, Breitbart H. Mammalian sperm translate nuclear encoded proteins by mitochondrial-type ribosomes. Genes Dev. 2006;20(4):411-6.
  13. Miller D, Briggs D, Snowden H, Hamlington J, Rollinson S, Lilford R, et al. A complex population of RNAs exists in human ejaculate spermatozoa: impli-cations for understanding molecular aspects of sper-miogenesis. Gene. 1999;237(2):385-92.
  14. Hecht NB, Williams JL. Synthesis of RNA by separat-ed heads and tails from bovine spermatozoa. Biol Reprod. 1978;19(3):573-9.
  15. Pessot CA, Brito M, Figueroa J, Concha, II, Yanez A, Burzio LO. Presence of RNA in the sperm nucleus. Biochem Biophys Res Commun. 1989;158(1):272-8.
  16. Kumar G, Patel D, Naz RK. c-MYC mRNA is present in human sperm cells. Cell Mol Biol Res. 1993;39(2): 111-7.
  17. Miller D, Tang PZ, Skinner C, Lilford R. Differential RNA fingerprinting as a tool in the analysis of sperma-tozoal gene expression. Hum Reprod. 1994;9(5):864-9.
  18. Wykes SM, Miller D, Krawetz SA. Mammalian sper-matozoal mRNAs: tools for the functional analysis of male gametes. J Submicrosc Cytol Pathol. 2000;32(1): 77-81.
  19. Ostermeier GC, Dix DJ, Miller D, Khatri P, Krawetz SA. Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men. Lancet. 2002;360(9335):772-7.
  20. Miller D. Ensuring continuity of the paternal genome: potential roles for spermatozoal RNA in mammalian embryogenesis. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;65:373-89.
  21. Ostermeier GC, Miller D, Huntriss JD, Diamond MP, Krawetz SA. Reproductive biology: delivering sperma-tozoan RNA to the oocyte. Nature. 2004;429(6988): 154.
  22. Miller D. Spermatozoal RNA as reservoir, marker and carrier of epigenetic information: implications for clon-ing. Reprod Domest Anim. 2007;42 Suppl 2:2-9.
  23. Miller D, Ostermeier GC. Spermatozoal RNA: Why is it there and what does it do? Gynecol Obstet Fertil. 2006;34(9):840-6.
  24. Caldwell KA, Handel MA. Protamine transcript shar-ing among postmeiotic spermatids. Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88(6):2407-11.
  25. Rassoulzadegan M, Grandjean V, Gounon P, Vincent S, Gillot I, Cuzin F. RNA-mediated non-mendelian inheritance of an epigenetic change in the mouse. Nature. 2006;441(7092):469-74.
  26. SA OGaK. Spermatozoal RNA as a surrogate marker of paternal exposure. Boca Raton: CRC press 2006.
  27. Lambard S, Galeraud-Denis I, Martin G, Levy R, Chocat A, Carreau S. Analysis and significance of mRNA in human ejaculated sperm from normo-zoospermic donors: relationship to sperm motility and capacitation. Mol Hum Reprod. 2004;10(7):535-41.
  28. Parra MT, Viera A, Gomez R, Page J, Benavente R, Santos JL, et al. Involvement of the cohesin Rad21 and SCP3 in monopolar attachment of sister kinetochores during mouse meiosis I. J Cell Sci. 2004;117(Pt7): 1221-34.
  29. Menke DB, Mutter GL, Page DC. Expression of DAZ, an azoospermia factor candidate, in human spermato-gonia. Am J Hum Genet. 1997;60(1):237-41.
  30. Ostermeier GC, Goodrich RJ, Moldenhauer JS, Diamond MP, Krawetz SA. A suite of novel human spermatozoal RNAs. Journal of andrology. 2005;26(1): 70-4.
  31. Joseph Sambrook DWR. Molecular Cloning: A Laboratory Manual CSHL Press 2001.
  32. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Cons-truction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991;19(5):1154.
  33. Aarabi M, Modarressi MH, Soltanghoraee H, Behjati R, Amirjannati N, Akhondi MM. Testicular expression of synaptonemal complex protein 3 (SYCP3) messen-ger ribonucleic acid in 110 patients with nonobstruc-tive azoospermia. Fertil Steril. 2006;86(2):325-31.
  34. Warchol JB, Augustyniak S, Stecewicz D, Jankowska A. Detection of DAZ mRNA distribution in human testis using reverse transcription in situ PCR technique (RT-ISPCR). Folia Histochem Cytobiol. 2001;39(2): 117-8.
  35. Huang Z, Somanath PR, Chakrabarti R, Eddy EM, Vijayaraghavan S. Changes in intracellular distribution and activity of protein phosphatase PP1gamma2 and its regulating proteins in spermatozoa lacking AKAP4. Biol Reprod. 2005;72(2):384-92.
  36. Mobasheri MB, Modarressi MH, Shabani M, Asga-rian H, Sharifian RA, Vossough P, et al. Expression of the testis-specific gene, TSGA10, in Iranian patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). Leuk Res. 2006;30(7):883-9.
  37. Behnam B, Modarressi MH, Conti V, Taylor KE, Puliti A, Wolfe J. Expression of Tsga10 sperm tail protein in embryogenesis and neural development: from cilium to cell division. Biochem Biophys Res Commun. 2006;344(4):1102-10.
  38. Jane Christopher-Henningsa, , Matthew Dammena, Eric Nelsona, Raymond Rowlandb and Richard Oberstb Comparison of RNA extraction methods for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from boar semen journal of virological methods. 2006;136(1-2):248-53.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 8, Issue 3
Autumn 2007
Pages 195-204