Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

An Ultrastructural Study on the Apoptotic Features of Spermatogenic Cells following Busulfan Treatment in Adult Mice

Authors
Fahimeh Mohammadghasemi 1
Jafar Soleimanirad 2
Ahmad Ali Ghanbari 3
1 Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Gilan University of Medical Sciences, Rasht, Iran
2 Electron Microscopy Laboratory, Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran
3 Anatomy Department, Faculty of Medicine, Tabriz Medical Sciences University, Tabriz, Iran
Abstract
Introduction: Chemotherapy has adverse effects on spermatogenesis and results in reversible or irreversible oligozoospermia or azoospermia. Little is known about the ultrastructural alterations of male germ cells following busulfan administration, as an anti-cancer drug. The present study aimed to study the ultrastructural alterations or apoptotic features of male mouse germ cells, following administration of various doses of busulfan. Materials & Methods: This study was performed on thirty-two 8-week-old adult male mice. Animals were divided into four groups. The mice on the control group were treated with DMSO and in the second, third and forth groups were treated with 10mg/kg, 20mg/kg and 40mg/kg busulfan, respectively. Busulfan was injected as a single dose intraperitoneally. Thirty-five days after the treatment, the mice testes were dissected and prepared for apoptosis study by trans-mission electron microscopy (TEM) and TUNEL assays. The results were analyzed by ANOVA test using SPSS software and a p < 0.05 was regarded statistically significant. Results: A single dose of busulfan induced ultrastructural features of apoptosis in all the experi-mental groups such as: chromatin marginalization of germ cell nuclei, especially in spermatogo-nia, deformation of nuclei, separation of germ cells and presence of large spaces between adjacent cells, cell shrinkage, occasional presence of vacuoles in germ cells and apoptotic bodies in sertoli cells. Ultrastructural features of apoptosis were more frequent in spermatogonia and primary sper-matocytes. Apoptosis was observed less frequently in the control group (2.77±0.57%), particularly in primary spermatocytes. However, the number of apoptotic cells in 10mg/kg and 20mg/kg busulfan treated groups were (58.23±7.32% and 54.09±6.23%) significantly higher than the number of apoptotic cells in 40mg/kg treated group (28.16±5.67%), (p < 0.001). Conclusion: Administration of a single dose of busulfan in various doses of 10mg/kg, 20mg/kg and 40mg/kg, induces apoptosis in male germ cells, especially in spermatogonia and primary sper-matocytes. Degree of apoptosis in male germ cells in busulfan treated groups is not dose depen-dent. Fewer number of apoptotic cells in 40mg/kg busulfan treated group may be due to more declines in the number of germ cells in comparison to 10 and 20mg/kg busulfan treated groups.
Keywords
Apoptosis
Azoospermia
busulfan
Chemotherapy
Germ cells
Sertoli cell
spermatogenesis
Testis

زمینه و هدف

آپوپتوز عبارتست از مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده که به‌صورت طبیعی در مراحل مختلف مرفوژنز هم در بافت‌های جنینی و هم در دوره بزرگسالی رخ می‌دهد. مانند سایر بافت‌ها، آپوپتوز در سلول‌های زایای بیضه در طول مراحل زندگی و اسپرماتوژنز نیز رخ می‌دهد (1،2). در برخی شرایط پاتولوژیک مانند تغییرات ژنتیکی مثل خانوادهBCL2 و لیگاند Fasو p53 (3) گرما (3) قرار گرفتن در معرض تشعشعات یونیزان (4) مواد سمی و محرومیت‌های هورمونی و فاکتورهای رشد (6،5،1) نهان بیضگی (3) و موتاسیون ژن‌های

c-kit/sef (5) میزان بروز آپوپتوز در سلول‌های زایای بیضه افزایش می‌یابد.

سلولی که فرایند آپوپتوز را طی می‌کند از نظر مورفولوژی گرد و چروکیده می‌شود و کروماتین متراکم می‌گردد و غشاء هسته به‌تدریج پیوستگی خود را از دست می‌دهد و به دلیل تجزیه شدن DNA، هسته به چندین قطعه یا کروماتین بادی شکسته می‌شود. سپس سلول به چندین وزیکول تحت عنوان اجسام آپوپتوتیک شکسته می‌شود که در نهایت بوسیله سلول‌های فاگوسیتوزکننده و یا سرتولی فاگوسیتوز می‌شوند (1،2،7). داروهای شیمی‌درمانی می‌تواند آپوپتوز را در سلول‌های زایای بیضه القاء نماید. بوسولفان یکی از عوامل شیمی‌درمانی از دسته ترکیبات الکیله‌کننده‌ DNA است و در بررسی درمان لوسمی میلوژنیک مزمن، سرطان تخمدان و همچنین در بیمارانی که تحت عمل پیوند مغز استخوان قرار می‌گیرند جهت تخلیه مغز استخوان استفاده می‌شود (8،9). بوسولفان به‌دلیل خاصیت الکیله‌کنندگی DNA دارای تأثیر سوء بر سلول‌هائی است که دارای قدرت تقسیم بیشتری هستند؛ به همین دلیل بیشترین اثر خود را روی اسپرماتوگونیها می‌گذارند (10،11). با وجود این، تمام اسپرماتوگونیها به‌دنبال بوسولفان از بین نمی‌روند (10). همچنین مصرف بوسولفان باعث آنومالی کروموزومی اسپرم و موتاسیون‌های کشنده غالب در اسپرم می‌شود (12) مصرف دارو در خانم‌های باردار منجر به ایجاد اختلال در عملکرد گنادها و کاهش سلول‌های سوماتیک و زایای بیضه در نوزادان می‌شود (13،14). در بررسی‌های انجام شده در انسان، درمان ترکیبی بوسولفان همراه با سیلکوفسفاماید باعث کاهش فعالیت گنادها و اختلالات آندوکرینی می‌شود (15،16).

استفاده از بوسولفان به‌ خصوص در سال‌های اخیر به‌طور عمده جهت القاء آزواسپرمی قبل از پیوند سلول‌های زایا به داخل بیضه در گونه‌های مختلف حیوانی صورت گرفته است (17،18). بر اساس مطالعات Boujrad در سال 1995 و Howel در 2001 درمان با بوسولفان و سیکلوفسفاماید مقادیر گنادوتروپین‌های FSH و LH را افزایش می‌دهد (19،20).

علیرغم اینکه مطالعات متعددی از نظر هیستوپاتو-لوژیکی در ارتباط با بوسولفان انجام شده است، ولی مطالعات کمی در ارتباط با مکانیسم اثر بوسولفان بر تخریب سلول‌های زایا وجود دارد. به نظر می‌رسد یکی از راه‌هایی که بوسولفان باعث تخریب سلول‌های زایا می‌شود، القاء آپوپتوز است و تنها مطالعة موجود در این زمینه مطالعه Choi و همکاران در سال 2004 است که نشان داد بوسولفان در دوز mg/kg40 می‌تواند اثرات آپوپتوز را در بیضه موش القاء نماید (9). Choi در مطالعه خود اثر تک دوز بالای بوسولفان یعنی mg/kg40 را در زمان‌های مختلف بر بیضه ارزیابی نمود. هرچند Choi در مطالعه خود ارزیابی فراساختاری سلول‌های زایا را انجام نداد.

میکروسکوپ الکترونی انتقالی یکی دیگر از ابزارهایی است که جهت تشخیص سلول‌های آپوپتوتیک می‌تواند به کار رود و به نظر می‌رسد که در بین روش‌های مورفولوژیک تشخیص آپوپتوز با میکروسکوپ الکترونی به‌عنوان استاندارد ومرجع باشد زیرا که می‌تواند اجسام آپوپتوتیک را در مراحل مختلف پیشرفت آپوپتوز در سلولها نشان دهد (7). هدف از این مطالعه بررسی تغییرات فراساختاری و همچنین آپوپتوتیک سلول‌های زایا به‌دنبال مصرف دوزهای مختلف بوسولفان (mg/kg40و 20 و 10) در بیضه موش‌های بالغ بود.

روش بررسی

در این مطالعه از 32 موش نر بالغ 8 هفته نژاد NMRI استفاده گردید. حیوانات از موسسه رازی (کرج- ایران) خریداری و جهت تطابق با محیط 2 هفته در قفس‌های خود با دسترسی آزاد به آب و غذا و شرایط محیطی استاندارد نگهداری شدند. پس از آن حیوانات به 4 گروه (هر گروه 8 سر موش) تقسیم شدند. به موش‌های گروه کنترل ml5/0 DMSO 2% (Sigma, USA) به صورت درون صفاقی ترزیق شد؛ در حالیکه به موش‌های گروه‌های دوم، سوم، چهارم به ترتیب دوز mg/kg40 و 20 و 10 بوسولفان (Sigma, USA) به‌صورت داخل صفاقی تزریق شد. به‌منظور حل شدن بوسولفان از DMSO و آب مقطر با حجم یکسان استفاده گردید (22،21).

با توجه به اینکه سیکل کامل اسپرماتوژنز در موش 35 روز طول می‌کشد؛ لذا پنج هفته پس از درمان، همه حیوانات کشته شدند و بیضه آنها جهت مطالعه میکروسکوپ الکترونی و ایمونوهیستوشیمی از بدن خارج گردید. بدین ترتیب که بیضه چپ جهت مطالعه میکروسکوپ الکترونی و بیضه راست جهت مطالعه با میکروسکوپ نوری مورد استفاده قرار گرفت. جهت ثبوت اولیه بافت برای میکروسکوپ الکترونی، از محلول ترکیبی گلوتارآلدئید 5/2% (ProSciTech, AuStralia) و پارافرمالدئید 4% (Merck, Germany) استفاده شد و جهت مطالعه ایمونوهیستوشیمی، نمونه‌ها در فرمالین بافر 10% ثابت شدند. طی روند درمان دو حیوان در گروه تحت درمان با mg/kg40 از بین رفتند و از مطالعات آماری حذف گردیدند.

پاساژ بافتی میکروسکوپ الکترونی: نمونه‌ها در فیکساتیو اولیه در طول شب در دمای C4 انکوبه شدند. سپس با فسفات بافر M2/0 (4/7=pH) شستشو صورت گرفت. جهت ثبوت ثانویه بافت، از اسمیوم تتراکسید 2% (TAAB, UK) به مدت دو ساعت استفاده و پس از شستشو، مراحل دهیدراسیون بافتی با استفاده از الکل با درجات صعودی انجام و از اپوکسی رزین (Araldite, Australia) جهت قالبگیری استفاده شد. پس از قالبگیری، پلیمریزاسیون در 2 مرحله انجام گردید. ابتدا قالب‌های حاوی نمونه برای مدت 24 ساعت در آون با دمای C40 و سپس در آون C60 برای 48 ساعت دیگر انکوبه گردید. جهت برش بافتی از اولترامیکروتوم (Reichert-Jung Austria) استفاده شد. ابتدا برش‌های نیمه نازک nm500 و پس از آن با استفاده از تیغه الماس برش‌های نازک 100 نانومتری تهیه شد. جهت رنگ‌آمیزی از اورانیل استات و سیترات سرب استفاده گردید، سپس گریدها با TEM مدل 906 (Leo, Germany) با ولتاژ KV100، مورد ارزیابی قرار گرفتند و از قسمت‌های مورد نظر عکس‌برداری شد.

مطالعه ایمونوهیستوشیمی: پس از ثبوت بافتی در فرمالین 10% به مدت 48 ساعت، مراحل پاساژ بافتی ادامه یافت. سپس نمونه‌ها در پارافین قالبگیری شده و پس از آن با استفاده از میکروتوم دوار (Leitz, Germany) برش‌های m3 تهیه و به‌منظور برداشت پارافین اضافی بافت، دو بار از گزیلن به مدت 15 دقیقه استفاده شد. پس از آن مراحل هیدراسیون در الکل با درجات نزولی انجام گردید. پس از شستشو در PBS و خشک شدن لامها، ارزیابی TUNEL آغاز شد. جهت انجام آزمایش تانل از کیت تشخیصی (Roche, Germany) استفاده گردید. ابتدا به منظور جلوگیری از بروز واکنش محلول تانل با پروتئین‌های آندوژن، از پراکسید هیدروژن (Merck, Germany) 3/0% در متانول استفاده شد. در مرحله بعد بافت با پروتئیناز K (Roche, Germany) به مدت نیم ساعت در انکوباتور C37 قرار داده ‌شد. پس از شستشو با PBS، l 50 مخلوط تانل به مدت نیم ساعت به بافت اضافه گردید. در مراحل بعدی، نمونه با POD (Roche, Germany) و سپس با سوبسترای DAB (Roche, Germany) انکوبه شد. جهت رنگ‌آمیزی زمینه از تولوئیدین بلو استفاده شد. سپس اسلایدها با میکروسکوپ نوری (Ziess, Germany) مطالعه شدند که سلول‌های آپوپتوتیک به رنگ قهوه‌ای و سایر سلول‌های غیر آپوپتوتیک رنگ‌آمیزی زمینه (آبی) را نشان دادند. با استفاده از میکروسکوپ نوری، تعداد سلول‌های قهوه‌ای در 40 مقطع عرضی لوله منی‌ساز در هر حیوان شمارش و بر تعداد کل سلول‌های موجود در هر لوله (آپوپتوتیک و غیرآپوپتوتیک) تقسیم و در نهایت به‌صورت درصد بیان شد (23).

آنالیزهای آماری: به منظور مقایسه آماری، یافته‌ها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون واریانس یکطرفه تحلیل شدند. یافته‌ها به‌صورت میانگین و انحراف معیار بیان و مقادیر 05/0p معنی‌دار تلقی شد. جهت ارزیابی تفاوت معنی‌دار بین گروهها از تست توکی استفاده شد.

نتایج

در گروه کنترل اسپرماتوگونیها روی غشای پایه تکیه داشتند و دارای هسته گرد تا بیضوی شکل و یوکروماتین بودند و همچنین دارای هستک مرکزی و اندکی هترو کروماتین کناری بودند و در مقایسه با سیتوپلاسم سایز هسته بزرگتر بود. ریبوزمها و دستجات شبکه آندوپلاسمی و دستگاه گلژی در سیتوپلاسم قابل رویت بود. از مشخصات دیگر آنها میتوکندری‌های تیره به تعداد کم بود (شکل1- الف). اسپرماتوسیت‌های اولیه با اندازه بزرگتر و محل قرارگیری آنها قابل تشخیص بود که هسته گرد آنها در مراحل مختلف میوز قابل مشاهده بود. اغلب اسپرماتوسیت‌های اولیه بالاتر از اسپرماتوگونیها و نزدیک‌تر به لومن قرار داشتند، مگر اسپرماتوسیت‌های اولیه مرحله لپتوتن یا پره لپتوتن که آنها نیز در کنار اسپرماتوگونیها و بر روی غشاء پایه تکیه داشتند و به‌طور کلی آنها دارای شبکه آندوپلاسمی نسبتاً توسعه یافته و همچنین دستگاه گلژی در سیتوپلاسم خودبودند و در مقایسه با اسپرماتوگونیها، دارای تعداد بیشتری میتوکندری روشن بودند (شکل1-ب). غشاء پایه به‌صورت کاملاً منظم در دو لایه تیره و روشن مشهود بود و در خارج از غشاء پایه سلول‌های کشیده میوئید با هسته بزرگ یوکروماتین و هتروکروماتین کناری پراکنده دیده می‌شدند. در هر طرف سلول‌های میوئید، رشته‌های کلاژن قابل رویت بودند (شکل 1- الف و ب).

اسپرماتیدهای جوان گرد کوچکتر از اسپرماتوسیت‌های اولیه بودند و در مقایسه با آنها به لومن نزدیکتر و اغلب آنها گرد بودند ولی در اغلب موارد بدلیل نزدیکی به یکدیگر حالت چندوجهی به خود می‌گرفتند. این سولها دارای هسته گرد بزرگ و نوکلئوپلاسم یکنواخت و یوکرماتین بودند. همچنین سیتوپلاسم وسیع آنها حاوی میتوکندری‌های کوتاه با فضای داخلی نسبتاً گشاد و تعداد زیادی ریبوزوم و پروفایل‌های لوله‌ای شکل شبکه آندوپلاسمی و یا دستگاه گلژی کاملاً تکامل یافته در مجاورت هسته بودند (شکل 1- الف). اسپرماتیدها در مراحل مختلف اسپرمیوژنز قابل رویت بودند بهمین دلیل شکل هسته و اکرزوم در مراحل مختلف تکامل بود و در نهایت اسپرماتیدهای دراز شده با هسته کاملاً کشیده و متراکم خود که بر روی آن اکرزوم کشیده شده بود و با فلاژل مخصوص خود که ناحیه لومن لوله را پر می‌کرد دیده می‌شدند.

در گروه تحت درمان با بوسولفان به ویژه در گروه تحت درمان با دوز mg/kg40 سلول‌های اپی‌تلیوم ژرمینال از بین رفته بودند.

در گروه دوم که با mg/kg 10 درمان شده بودند سلول‌های اسپرماتوگونی برروی غشاء پایه قرار داشتند و دارای هسته هیپرکروم در مقایسه با کنترل بودند ضمن اینکه فضاهائی بین آنها و سلول‌های مجاورشان وجود داشت. در داخل اپی‌تلیوم ژرمینال واکوئل‌هائی دیده می‌شد که اغلب حاصل از بین رفتن سلول‌های ژرمینال است. سایر سلول‌های زایای دیگر نیز دارای هسته تغییر شکل یافته و کم رنگ در مقایسه با کنترل بودند که می‌تواند از علائم اولیه آپوپتوز باشد.

در داخل سیتوپلاسم سلول سرتولی فاگوسیت‌های حاوی ارگانل مشاهده می‌شد. چندین واکوئل و تعداد زیادی میتوکندری تیره و کوتاه نیز در سیتوپلاسم سلول‌های سرتولی مشاهده می‌شود (شکل 2- الف و ب). هرچند که اسپرماتوگونی‌های مجاور نسبتاً از هم جدا شده است ولی سلول‌های سرتولی در تماس نزدیک با یکدیگر قرار دادند. از دیگر علائم آپوپتوز، هسته هیپرکروم کناری سلول‌های زایا به ویژه سلول‌های اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت اولیه است (شکل 3-الف).

در گروه تحت درمان با mg/kg20 بوسولفان علاوه بر اینکه ضخامت اپی تلیوم کمتر به نظر می‌رسد تعداد بیشتری سلول‌های دژنره شده نیز در ضخامت اپی‌تلیوم به‌صورت هسته کاملاً متراکم، سیتوپلاسم دژنره شده و متراکم وجود داشت و در برخی موارد هسته به چند قطعه تقسیم شده بود و در کل اندازه سلول بدلیل چروکیدگی، به‌طور واضح کاهش یافته است (شکل3-ب). در سیتوپلاسم برخی از سلول‌های سرتولی اجسام آپوپتوتیک نیز مشاهده می‌شود (شکل3- ج).

در گروه تحت درمان با mg/kg 40 در برخی لوله‌ها به طور کلی سلول‌های زایا از بین رفته بودند و فقط هسته‌های غول پیکر سرتولی و تعدادی هسته اسپرماتوگونی بسیار پراکنده به چشم می‌خورد. اغلب اسپرماتوگونیها علائم اپوپتوتیک را از خود نشان می‌دادند هرچند که تعدادی از آنها نیز بدون علائم دژنره شدن در لوله منی ساز مشاهده می‌شدند. ضمن این که تعدادی سلول دژنره نیز در داخل لومن لوله سمینیفروس دیده می‌شد و در سیتوپلاسم سلول‌های سرتولی نیز کمتر فاگوزوم و یا اجسام آپوپتوتیک دیده می‌شود (شکل 4- الف) و در آن دسته از لوله‌هایی که فقط سلول سرتولی وجود دارد اتصالات محکم بین سلول‌های سرتولی به وضوح دیده می‌شود و سیتوپلاسم سرتولی به‌صورت وسیعی در تمام لوله‌ها پخش شده است؛ ضمن اینکه غشاء پایه کاملاً به‌صورت مواج دیده بوده و در مقایسه با کنترل ضخیم‌تر به نظر می‌رسید. سلول‌های میوئید نیز به نظر کوتاهتر می‌رسیدند و سطح برخی از آنها بر خلاف گروه کنترل که صاف بود، به‌صورت دندانه‌دار مشاهده می‌شدند (شکل4-ب).

ارزیابی ایمونوهیستوشیمی با روش TUNEL: در ارزیابی میکروسکوپی نوری در گروه کنترل، تعداد سلول‌های دارای تست مثبت به رنگ قهوه‌ای و به‌صورت پراکنده بودند. در برخی لوله‌ها هیچ گونه سلول مثبت مشاهده نمی‌شد. تمام سلول‌های قهوه‌ای جزء سلول‌های زایا بودند و هیچ یک از سلول‌های سرتولی یا لیدیگ و میوئید به صورت مثبت رنگ نگرفتند. به‌عبارت دیگر این حالت نشان می‌داد که سلول‌های زایا دچار فرایند آپوپتوز در طی اسپرماتوژنز نرمال می‌شوند. آپوپتوز سلول‌های زایا در گروه کنترل بسیار کم بود و عمدتاً سلول‌های اسپرماتوسیت اولیه را در بر می‌گرفت. سلول‌های دیگر بندرت دارای نتایج مثبت TUNEL بودند (شکل 5).

درصد سلول‌های آپوپتوتیک در تمامی گروه‌های آزمایش، به‌صورت معنی‌دار در مقایسه با کنترل افزایش داشت (001/0p)، (جدول 1). نکته قابل توجه اینکه هرچند که علائم مورفولوژیک تخریب اسپرماتوژنز در گروه تحت درمان با mg/kg 40 بوسولفان شدیدتر به نظر می‌رسید ولی درصد سلول‌های زایای آپوپتوتیک در مقایسه با گروه‌های تحت درمان با mg/kg20 و 10 بوسولفان کمتر بود (01/0p). در گروه‌های آزمایشی نیز فقط سلول‌های زایا به‌صورت آپوپتوتیک مشاهده می‌شدند.

بحث

در این مطالعه از بوسولفان به‌عنوان یکی از داروهای گروه آلکیله‌کننده DNA استفاده شد که در برخی بیماران مبتلا به سرطان خون و قبل از پیوند مغز استخوان مورد استفاده قرار می‌گیرد. این مطالعه نشان داد که بوسولفان در دوزهای mg/kg40 و 20 و 10 باعث از بین رفتن سلول‌های اسپرماتوگونی در موش می‌شود؛ هرچند حتی در دوز بالا باعث از بین رفتن تمام آنها نمی‌شود. احتمالاً باقی ماندن اسپرماتوگونیها حتی در دوزهای زیاد می‌تواند دلیلی بر این مورد باشد که این سلولها می‌توانند پس از مدتی با تقسیم خود سلول‌های زایایی را در لوله منی‌ساز ایجاد نمایند. در موشها به‌دنبال تجویز بوسولفان سلول‌های اسپرماتوگونی باقیمانده می‌توانند مجموعه‌ای از سلولها را تشکیل دهند ولی نمی‌توانند به سلول‌های دیگر

تمایز یابند (10).

مشاهده واکوئل‌هایی در ضخامت اپی‌تلیوم ژرمینال می‌تواند حاصل از بین رفتن سلول‌های زایا باشند. درمان باسیس پلاتین (24) و درمان با اشعه (25) به‌طور مشابهی می‌توانند باعث ایجاد واکوئل در ضخامت اپی‌تلیوم ژرمینال شوند.

این مطالعه نشان داد که در گروه تحت درمان با mg/kg10 بین سلول‌های اسپرماتوگونی و سرتولی فضاهائی به وجود می‌آید که نشاندهنده از دست دادن اتصالات سلولی است که به عنوان یکی از علائم پره‌آپوپتوز مطرح است. در ارتباط با این زمینه آزمایشات In Vitro نشان داده‌اند که اتصال بین سلول‌های سرتولی‌ـ زایا باعث افزایش بقاء سلول زایا می‌شود وپروتئین‌های خارجی سلولی بافت همبند نقش مهمی در برقراری اتصالات بین سلول سرتولی و زایا دارند (27،26). در گروه mg/kg 10 علاوه بر ایجاد فضا بین سلول‌های اسپرماتوگونی، هسته اسپرماتوگونی‌های پر رنگ‌تر ضمن این که هتروکروماتین کناری نیز بیشتر بود و این علامت در گروه‌های آزمایشی دیگر نیز به میزان بیشتر مشاهده می‌شد. این علامت می‌تواند به‌عنوان مرحله اولیه آپوپتوز اسپرماتوگونی مطرح باشد و مطالعة حاضر با مطالعات Allan در سال 1998 و Ateeq در سال 2006 هماهنگی دارد (29،28). تغییر شکل هسته سایر سلول‌های زایا به‌ویژه اسپرماتوسیتها می‌تواند ناشی از تغییراتی در اسکلت هسته باشد. در تائید این یافته کلیه تغییرات در پروتئین‌های اسکلت سلولی و تجزیه لامیناهای هسته نیز به‌عنوان یکی از عوامل القاء کننده آبشار آپوپتوز مطرح می‌باشد (30).

با افزایش دوز بوسولفان یعنی در دوزهای mg/kg40 و 20، تراکم شدید هسته و سیتوپلاسم و وجود واکوئل داخل سیتوپلاسم به چشم می‌خورد که این علائم نیز به‌عنوان درجات پیشرفته‌تر آپوپتوز مطرح است (29،28). همچنین در گروه mg/kg 40، تعداد نسبتاً زیادی از سلولها دارای هسته کاملاً متراکم و نعل اسبی شکل و دارای واکوئل بودند؛ ضمن اینکه ارگانل‌های سلولی در نقطه مقابل هسته به چشم می‌خورد و براساس مطالعات Allan نیز می‌تواند به‌عنوان مرحله پیشرفته آپوپتوز مطرح شود (28). همچنین وجود اجسام آپوپتوتیک در داخل سیتوپلاسم سرتولی نیز می‌تواند از علائم آپوپتوز باشد که به طور مشابهی Print و Francavilla نیز این اجسام را در داخل سرتولی گزارش نموده‌اند (31،32). در این مطالعه به نظر می‌رسید که در گروه mg/kg40 میزان فاگوزومها و اجسام آپوپتوتیک داخل سرتولی کمتر از گروه‌های آزمایش دیگر باشد. ضمن این که در گروه چهارم تعدادی از سلول‌های زایایی که دچار تغییرات تخریبی شده بودند به جای آنکه در داخل سیتوپلاسم سلول‌های سرتولی دیده شوند در داخل لومن مشاهده می‌شوند. بنابراین به نظر می‌رسد که بوسولفان دارای تأثیر سوء روی کارکرد سلول سرتولی بود و احتمالاً به‌دلیل عدم عملکرد مناسب، این سلولها نمی‌توانند سلول‌های زایای آپوپتوتیک را به‌خوبی تشخیص داده و فاگوسیت نمایند (34،33) در رتها رشته‌های ویمنتین موجود در سلول‌های سرتولی نقش مهمی در نگهداری اسپرماتوژنز و سلول‌های لوله سمی‌نیفروس دارند و

هرگونه تغییر در بیان پروتئین ویمنیتین با اختلالات و تخریب اسپرماتوژنز همراه است. به‌همین ترتیب Kopecky در سال 2005 نشان داد بوسولفان که باعث تخریب اسپرماتوژنز می‌شود با تغییراتی در سلول سرتولی و بیان ویمنتیین همراه است. به‌عبارت دیگر بوسولفان نه تنهادارای اثرات سوء بر سلول‌های زایا است بلکه سلول‌های سرتولی را نیز تغییر می‌دهد (35).

نشاندار کردن DNA قطعه قطعه شده که با استفاده از روش TUNEL نیز نتایج میکروسکوپ الکترونی را تائید نمود. این یافته نشان داد که درمان با بوسولفان در هر سه دوز mg/kg10 و 20 و40 می‌تواند باعث افزایش القاء آپوپتوز سلول‌های زایای پره‌میوز و میوتیک گردد که ممکن است روشی جهت جلوگیری از انتقال آنومالیها به حساب آید (36،37). این مطالعه در راستای مطالعه Choi در سال 2004 بود که اثر آپوپتوتیک بوسولفان در دوز mg/kg40 را در موشها در یک وضعیت وابسته به زمان انجام داد ضمن این که دوز ( mg/kg40) در موشها دوز بالائی است و می‌تواند با مرگ و میر نیز همراه باشد (9). در حالیکه در این مطالعه علاوه بر دوز mg/kg40 از دوزهای mg/kg 20 و10 نیز استفاده شد و در این دوزهای کمتر بوسولفان نیز اثر اپوپتوتیک مشاهده گردید. به‌طور مشابهی درمان با سیس پلاتین (38،24) و سیکلو فسفاماید (39)، دوکسوروبی سین (7) و همچنین اشعه‌درمانی (7) نیز باعث القاء آپوپتوز در سلول‌های زایا می‌شود. در مطالعه اخیر دوز mg/kg 40 نتوانست منجر به افزایش تعداد سلول‌های با تست TUNEL مثبت در مقایسه با دوزهای کمتر شود. احتمالاً این عامل می‌تواند ناشی از کاهش بیشتر سلول‌های زایای موجود در لوله منی‌ساز و در نتیجه کاهش سلول‌های دارای مثبت TUNEL باشد که این رابطه در مطالعه قبلی محققین با کمک روش‌های مورفومتریک و شمارش سلول‌های زایا نشان داده شد که در دوز mg/kg40، تعداد سلولها به میزان بیشتری کاهش می‌یابد و به‌عبارت دیگر در این دوز، تقریباً تمام لوله‌ها فاقد اسپرماتوگونی و اسپرم می‌گردند (21). یافته مشابهی به‌دنبال درمان با دوزهای بالای سیس پلاتین گزارش شده است (37) که احتمالاً حاصل از دست دادن بیشتر قطعات DNA در دوزهای بالاتر است (40،37).

در این مطالعه عمده سلول‌های اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت اولیه مشخصات آپوپتوز را نشان دادند. با توجه به این که عوامل آلکیله به‌طور عمده روی سلول‌های با قدرت تقسیم بالا تاثیر می‌گذراند، سلول‌های اسپرماتوژنیک به‌خصوص اسپرماتوگونی هدف مهمی برای بوسولفان و عوامل مشابه می‌باشد (41،40،9). همچنین انواع مختلف سلول‌های زایا تفاوت‌های قابل توجهی در پاسخ به تحریکات استرس‌زای منجر به بروز آپوپتوز دارند (32،2). برای نمونه مارکرهای Pad51 و MAK در اسپرماتوسیتها

درحالیکه مارکرهای TGFß, L در اسپرماتیدهای گرد بیان می‌شوند (9). Choi نشان داد که به‌دنبال درمان با بوسولفان مارکرهای MAK وPad51 که در ترمیم DNA نقش دارند کاهش می‌یابند و بنابراین تعداد اسپرماتوسیت‌های اولیه‌ای که متحمل آپوپتوز می‌شوند زیاد می‌باشد (9). به عبارت دیگر سلول‌های مختلف در یک بافت حتی در برخورد با یک ماده با دوز مشابه، از نظر بروز آپوپتوز پاسخ یکسانی نمی‌دهند و شاید به همین دلیل در مطالعه حاضر نیز همة سلول‌های اسپرماتوژنیک پاسخ مشابهی در برابر بوسولفان بروز ندادند.

نتیجه‌گیری

به طور کلی مطالعات میکروسکوپ الکترونی و ایمونوهیستوشیمی نشان داد که یکی از مکانیسم‌های اثرات تخریبی بوسولفان بر روند اسپرماتوژنز، آپوپتوز است. بوسولفان در هر سه دوز mg/kg40 و20 و10 می‌تواند باعث القاء آپوپتوز در سلول‌های زایا، به‌ویژه سلول‌های اسپرماتوگونی و اسپرماتوسیت اولیه شود.

درمان با دوزهای بالاتر بوسولفان (mg/kg40) باعث القاء بیشتر آپوپتوز در سلول‌های زایا نمی‌شود. به‌هرحال به توجه به اینکه مکانیسم‌های دقیق شیمی‌درمانی که منجر به آپوپتوز می‌شود به طور کاملاً واضح شناخته نشده است به‌همین جهت مطالعات بیشتری به‌ویژه در سطح مولکولی مورد نیاز می‌باشد.

تشکر و قدردانی

با سپاس از معاونت محترم پژوهشی و مرکز تحقیقات کاربردی داروئی دانشگاه علوم پزشکی تبریز که هزینه‌های انجام این تحقیق را تأمین نمودند. همچنین از سرکار خانم آیدا اعظمی، کارشناس آزمایشگاه میکروسکوپ الکترونی، جهت همکاری صمیمانه در اجرای این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.

  1. Billig H, Chun SY, Eisenhauer K, J.W. Hsueh A. Gonadal cell apoptosis :hormone regulated cell demise. Hum Reprod Update.1996;2(2):103-17.
  2. Print CG, Loveland KL. Germ cell suicide: new insights into apoptosis during spermatogenesis. Bio-essay. 2000;22:423-30.
  3. Ohta H, Aizawa SH, Nishimune Y.Functional analysis of the p53 gene in apoptosis induced by heat stress or loss of stem cell factor signaling in mouse male germ cells. Biol Reprod. 2003;68:2249-54.
  4. Shuttlesworth GA, de Rooij DG, Huhtaniemi I, Reiss-mann T, Russell LD, Shetty G, et al. Enhancement of A Spermatogonial proliferation and differentiation in irradiated rats by GnRH antagonist administration. Endocrinology. 2000;141:37-49.
  5. Tohda A, Matsumiya K, Tadokoro Y, Yomogida K, Miyagawa Y, DohmaeK, et al. Testosterone suppresses spermatogenesis in juvenile spermatogonial depletion (jsd) mice. Biol Reprod. 2001;65:532-7.
  6. Omezzine A, Chater S, Mauduit C,Florin A, Tabone E, Chuzel F, et al. Long-term apoptotic cell death process with increased expression and activation of caspase 3 and-6 in adult rat germ cells exposed in utero to fluta-mide. Endocrinology.2003;144(2):648-61.
  7. Roberts R. Apoptosis in toxicology. 2nd ed. Taylor & Francies, London. 2000;p 130-204.
  8. Anderson PhO, Knoben JE, Troutman WG. Handbook of clinical data. 10th Edition. Mc Graw Hill, New york. 2002;p:136-40.
  9. Choi YJ, Ok DW, Kwon DN, Chung JI, Kim HC, Yeo SM, et al. Murine male germ cell apoptosis induced by busulfan treatment correleates with loss of c-kit-expression in a Fas/FasL-and P53-independent manner. FEBS Lett. 2004;575(1-3):41-51.
  10. Van Keulen CJ, de Rooij DG. Spermatogenetic clones developing from repopulating stem cells surviving a high dose of an alkylating agent. Cell Tissue Kinet. 1975;8(6):543-51.
  11. Bishop JB, Wassom JS. Toxicological review of busulfan (Myleran). Mutat Res. 1986;168(1):15-45.
  12. Bucci LR, Meistrich ML. Effects of busulfan on mu-rine spermatogenesis: cytotoxicity, sterility, sperm ab- normalities, and dominant lethal mutations. Mutat Res. 1987;176(2):259-68.
  13. Janes GF, Pomerantz DK. The effect of prenatal treat-ment with busulfan on in vitro androgen production by testes from rats of various ages. Can J Physiol Pharma-col. 1985;63(9):1155-58.
  14. Boujrad N, Hochereau-de Rivers MT, Kamtchouing P, Perreau C, Carreau S.Evolution of somatic and germ cell populations after busulfan treatment in utero or neonatal cryptorchidism in the rat. Andrologia. 1995; 27(4):223-8.
  15. Grigg AP, Mclachlan R, Zaja J, Szer J. Reproductive status in long term bone marrow transplant survivors receiving busulfan- cychlophosphamide. Bone Marrow Transplant. 2000;26(10):1086-95.
  16. Afify Z, Shaw PJ, Clavano-Harding A, Cowell CT. Growth and endocrine function in children with acute myeloid leukemia after bone marrow transplantation usingbusulfan/ cychlophosphamide. Bone Marrow Transplant. 2000;25(10):1087-92.
  17. Veccino P, Uranga J, Arechaga J. Suppression of sper-matogenesis for cell transplantation in adult mice. Protoplasma. 2001;217(4):191-8.
  18. Honaramooz A, Behboodi E, Hausler CL, Blash S, Ayres S, et al. Depletion of endogenous germ cells in male pigs and goats in preparation for germ cell trans-plantation. J Androl .2005;26(6):698-705.
  19. Boujrad N, Hochereau-de Rivers MT, Kamtchouing P, Perreau C, Carreau S. Evolution of somatic and germ cell populations after busulfan treatment in utero or neonatal cryptorchidism in the rat. Andrologia. 1995; 27(4):223-8.
  20. Howell SJ, Shalet SM. Testicular function following chemotherapy. Hum Reprod Update. 2001;7(4):363-9.
  21. Mohammad-Ghasemi F, Soleimanirad J, Ghanbari AA. A morphologic and morphometric study of adult mouse testis following different doses of busulfan administration. J Reprod Infertil. 2006;7(1):25-36.
  22. Udagawa K, Ogawa T, Watanabe T, Yumura Y, Take-da M, Hosaka M. GnRH analog, leuprorelin acetate, promotes regeneration of rat spermatogenesis after severe chemical damage. Int J Urol. 2001;8:615-22.
  23. Labat-Moleur F, Guillermet C, Lorimier P, Robert C, Lantuejoul S, Brambilla E, Negoescu A. TUNEL apop-totic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J Histochem Cytochem. 1998;46(3): 327-34.
  24. Sawhney P, Gimmona J, Meistrich ML, Richburg JH. Cisplatin-induced long-term failure of spermatogenesis in adult c57/BL/6J Mice. J Androl. 2005;26(1):136-45.
  25. Swada H, Esaki M. Electron microscopic observation of 137Cs-irradiated rat testis: Production of basal lami-nae for germ cells, despite their absence. J Electron Microsc. 2003;52(4):391-7.
  26. Newton SC, Blaschuk OW, Millette CF. N-cadherin mediates Sertoli cell-spermatogenic cell adhesion. Dev Dyn. 1993;197(1):1-13.
  27. Day ML, Zhao X, Vallorosi CJ, Putzi M, Powell CT, Lin C, et al. E-cadherin mediates aggregation depen-dent survival of prostate and mammary epithelial cells through the retinoblastoma cell cycle control pathway. J Biol Chem. 1999;274(14):9656-64.
  28. Allan DJ, Gobe GC, Harmon BV. Sertoli cell death by apoptosis in the immature rat testis following x-irra-diation. Scaning Microsc. 1998;2(1):503-12.
  29. Ateeq B, Farah MA, Ahmad W. Evidence of apoptotic effects of 2,4-D and butachlor on walking catfish, clarios batrachus, by transmission electron microscopy and DNA degradation studies. Life Science. 2006;78 (9):977-86.
  30. Andrew W, Vicki D, Berton F, Hill D, Mansow S. Apoptosis and cell differentiation. 2nd Edition. Boeh-ringer Mannheim. 1998;p:116-20.
  31. Francavilla S, D'Abrizio P, Cordeschi G, Pelliccione F, Necozione S, Ulisse S,et al. Fas expression corre-lates with human germ cell degeneration in meiotic and post-meiotic arrest of spermatogenesis. Mol Hum Reprod. 2002;8(3):213-20.
  32. Print CG, Loveland KL. Germ cell suicide: new insights into apoptosis during spermatogenesis. 2000; Bioessays. 22(5):423-30.
  33. Shiratsuchi A, Kawasaki Y, Ikemoto M, Arai H, Nakanishi Y. Role of class B scavenger receptor type I in phagocytosis of apoptotic rats spermatogenic cells by sertoli cells. J Biol Chem. 1999;274(9):5901-08.
  34. Tesarik J, Greco F, Cohen-Bacrie P, Mendoza C. Germ cell apoptosis in men with complete and income-plete spermiogenesis failure. Mol Hum Reprod. 1998;4 (8):757-62.
  35. Kopcky M, Semecky V, Nachtigal P. Vimentin ex-pression during altered spermatogenesis in rats. Acta Histochem. 2005;107(4):279-89.
  36. Brinkworth MH, Nieschlag E. Association of cychlo-phosphamide-induced male mediated, foetal abnor-malities with reduced paternal germ cell apoptosis. Mutat Res. 2000;447:149-54.
  37. Sawhney P, Gimmona J,Meistrich ML, Richburg JH. Cisplatin induced long-term failure of spermatogenesis in adult C57 /BL/6J mice. J Androl. 2005;26(1):136-45.
  38. Zhang X, Yamamoto N, Soramoto S, Takenaka I. Cis-platin-Induced germ cell apoptosis in mouse testes. Arch Androl. 2001;46(1):43-9.
  39. Cai L, Hales BF, Robaire B. Induction of apoptosis in the germ cells of adult male rats after exposure to cyclophosphamide. Biol Reproduction. 1997;56(6): 1490-7.
  40. Krishnamurty H, Weinbauer GF, Aslam H, Yeung CH. Quantification of apoptotic testicular germ cells in normal and Methoxyacetic acid-treated mice as deter-mined by flow cytometry. J Androl. 1998;19(6): 710-7.
  41. Udagawa K, Takeda M, Hosaka M, Kubota Y, Ogawa T. Recovery of spermatogenesis by high dose gonado-tropin-releasing hormone analoge treatment in rat cryptorchid testis after orchiopexy. J Urol. 2002;168 (3):1279-83.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 8, Issue 4
Winter 2008
Pages 319-329