زمینه و هدف

خانواده مولکول‌های Wnt گلیکوپروتئین‌های ترشحی و دارای چندین بخش غنی و حفاظت شده سیستئینی می‌باشند که در فرآیندهای متنوعی مثل القائات جنینی، تعیین قطبیت سلولها و تعیین تخصصی شدن سرنوشت سلولها دخالت دارند. دریافت و ارسال سیگنال‌های Wnt در نتیجه اتصال پروتئین‌های Wnt به گیرنده‌های عرض غشایی خانواده fzd به کمک اعضای خانواده پروتئینها وابسته به گیرنده LDL ، بنام LRP انجام می‌شود (1). تاکنون 19 نوع پروتئینWnt و 10 نوع گیرنده fzd شناخته شده است، این تنوع باعث پیچیدگی سیستمWnt signaling شده، به طوری که آبشار درون سلولیWnt signaling وابسته به ترکیب کمپلکس Wnt-fzd است (1).

مسیر سیگنال‌دهی Wnt از طریق سه آبشار درون سلولی القا می‌شود که شامل 1- مسیر اصلی

β-catenin/Wnt، 2- مسیر polarity/Wnt و 3- مسیر ca2+/Wnt می‌باشند. در مسیرWnt/-catenin اتصال Wnt به fzd موجب هیپرفسفریله شدن پروتئین سیتوپلاسمی به نام Dvl و منجر به مهار فعالیت سرین- ترئونین کیناز به نام گلیکوژن سنتاز کیناز3- بتا (GSK3-β) با فسفریله کردن آن در ناحیه Ser-9 می‌شود. این امر در نهایت منجر به آزادسازی و تثبیت β-catenin و در نتیجه افزایش آن در سیتوپلاسم سلول می‌شود. β-catenin وارد هسته شده و با اعضای (Tcf/Lef) از خانواده عوامل نسخه برداری هترودیمر می‌شود و بیان ژن‌های هدف از جمله cyclin-D1 و

c-myc را تنظیم می‌کند. در حالیکه در غیاب مولکول‌های Wnt، GSK3-β از طریق مولکولی به نام Axin به کمپلکس β-cateninو APC متصل می‌شود و با فسفریلاسیون β-catenin منجر به تخریب سریع آن توسط فرآیند Ubiquitination می‌شود (1). کنترل فعالیت Wnt signaling نه تنها وابسته به نوع کمپلکس Wnt-fzd است، بلکه توسط آنتاگونیست‌هایش نیز تنظیم می‌گردد (2). بزرگترین خانواده آنتاگونیست Wnt، خانواده 6Sfrps است که تاکنون پنج نوع آن (Sfrp1,-2,-3,-4,-5) گزارش شده و چگونگی مکانیسم اثر این آنتاگونیستها تحت بررسی است. گزارشها حاکی از نقش آنتاگونیستی Sfrps به دلیل قابلیت اتصال آنها از یک طرف به مولکول‌های Wnt و از طرف دیگر به رسپتورهای fzdمی‌باشد و بدین ترتیب از ایجاد کمپلکس Wnt-fzd جلوگیری به عمل می‌آورد (3).

به تازگی نقش آگونیستی نیز برای Sfrp1 گزارش شده است به طوری که نوع فعالیت آن بسته به میزان غلظت آن دارد؛ یعنی در غلظت پایین باعث پیشبرد Wnt/-catenin signaling و در غلظت بالا باعث مهار آن می‌شود (4). بنابراین با توجه به انواع Wnt و رسپتورها و همچنین آنتاگونیست‌هایش چنین به نظر می‌رسد که فعالیت مسیر Wnt signaling در تخمدان تحت تأثیر هورمون‌های مختلف اثرات فیزیولوژیکی مختلفی را به همراه داشته باشد.

برهم کنش آبشارهای سیگنال‌دهی هورمون‌های پپتیدی و استروئیدی، برای رشد فولیکولی، تخمک‌گذاری و تشکیل جسم زرد حیاتی است. از جمله مهم‌ترین مسیرهای سیگنال‌دهی که در تکوین راه‌های تناسلی ماده و در اعمال طبیعی تخمدان نقش دارد مسیر سیگنال‌دهی Wnt است (5). به تازگی نقش فعالWnt signaling در فرآیند فولیکولوژنز تخمدان جوندگان گزارش شده است. در این مطالعات افزایش بیان Wnt-4 و رسپتورهای fz-1 و fz-4 در سلول‌های گرانولوزا و تکا قبل از تخمک‌گذاری گزارش شده است (6). از طرفی بیان بالای یک آنتاگونیست Wnt بنام Sfrp-4 در جسم زرد مشاهده شده است که به نظر می‌رسد در عملکرد بیولوژیک جسم زرد و همچنین در تحلیل آن به‌واسطه رویدادهای آپوپتوتیک دخالت دارد (7).

سندرم تخمدان پلی کیستیک (PCOS) یکی از اختلالات هورمونی زنان در سنین باروری است که 5 تا 10% آنان را در این سنین شامل می‌شود. علائم این سندرم شامل پرمویی و آکنه که به‌دلیل تولید زیاد آندروژن است و نیز اختلالات قاعدگی، عدم تخمک‌گذاری و ناباروری می‌باشد (8). در PCOS، توقف رشد فولیکولها و در نتیجه تجمع فولیکول‌های کوچک، وجود فولیکول‌های کیستیک و افزایش حجم استرومای تخمدان مشاهده می‌شود. این سندرم در دراز مدت موجب اختلالات متابولیکی مانند دیابت نوع II، افزایش چربی خون، افزایش فشار خون و عارضه‌های قلبی‌ـ عروقی می‌شود (9).

یافته‌های حاصل از ارزیابی انبوه بیان ژنها در زنان مبتلا به PCOS نشانگر اختلال سیگنال‌دهی Wnt در این بیماران است (10). Wood و همکاران (10) افزایش بیان DKK1 و Sfrp4، دو مولکول آنتاگونیست Wnt و کاهش بیان Wnt5A را در سلول‌های تکا ایزوله شده زنان PCOS را نشان داده‌اند. ولیکن نقش مسیر سیگنال‌دهی Wnt/-catenin در رویدادهای آپوپتوتیک تخمدان کاملاً ناشناخته و تاکنون گزارشی مبنی بر نقش اجزا Wnt signaling و ارتباط آنها با توقف رشد فولیکولها و آ پوپتوزیس درPCOS ارائه نشده است. لذا در این مطالعه با ایجاد مدل PCOS در رت ابتدا تغییرات مورفولوژیکی ایجاد شده نسبت به گروه کنترل مقایسه شد. در مرحله دوم، با توجه به وابستگی Sfrp4 با رویدادهای آپوپتوتیک (11) و گزارش حاکی از افزایش بیان ژن آن در زنان PCOS (10) آنالیز وسترن بلات Sfrp4 در مدل PCOS رت مورد بررسی قرار گرفت. مکان سیتوپلاسمی و یا هسته‌ای -catenin در سلول منوط به مهار فعالیت GSK3- با فسفریله شدن Ser-9 گزارش شده است (1). لذا با استفاده از روش‌های ایمنوهیستوشیمیایی بیان و مکان سلولیpGSK3Ser9، GSK3-β وβ-catenin مورد ارزیابی قرارگرفت و وابستگی این پروتئینها با فرآیند آپوپتوز در تخمدان مورد بررسی قرار گرفت.

روش بررسی

تیمار حیوانات: رت‌های ماده نابالغ از نژاد Wistar با وزن g50-40 از حیوانخانه دانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه شدند. رتها در قفس‌های جداگانه در شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی و در محدوده حرارتی C223 و دسترسی به مقادیر دلخواه آب و غذا نگهداری شدند.

موشها در سه سری مستقل تیمار شدند. تیمار و مطالعه در هر سری در دو گروه چهارتایی تیمار و کنترل انجام شد که در نهایت شامل دوازده نمونه تیمار (1هفته/4هفته) و دوازده نمونه کنترل (1هفته/4هفته) بود. گروه تیمار روزانه با تزریق زیرجلدی تستوسترون پروپیونات (TP) حل شده در روغن کنجد به میزان mg1 به ازای هر g100 وزن بدن به مدت یک و یا چهار هفته تیمار شدند (12)، در مقابل به گروه کنترل در طی این مدت روغن کنجد تزریق شد. در پایان تیمار، حیوانات هر گروه کشته و یک تخمدان برای مطالعات هیستولوژی، آنالیزهای ایمونوهیستوشیمی و آپوپتوزیس مورد استفاده قرار گرفت و تخمدان دیگر بلافاصله در ازت مایع منجمد شده و در دمای C70-

به منظور ارزیابی وسترن بلات نگهداری شد.

آنالیز هیستولوژی: پس از تثبیت نمونه‌های بافتی

در پارافرمالدهید 4% حل شده در بافر فسفات (PBS)

به مدت 16-14 ساعت، نمونه‌ها توسط محلول‌های الکل با درجات صعودی 20% تا 100% در هر کدام برای مدت 45 دقیقه تا یک ساعت آبگیری و سپس درالکل‌ـ زایلن (50:50) و زایلن (سه بار) شفاف‌سازی و با پارافین قالب‌گیری شدند. سپس نمونه‌ها با میکروتوم به قطر m7 برش‌گیری و برشها بر روی لام‌های پوشیده شده با ژلاتین یا پلی ال لایزین 1/0% (برای آنالیز ایمنوهیستوشیمی) قرار داده شدند. به منظور بررسی هیستولوژی، برشها پس از پارافین زدایی و آبدهی توسط محلول‌های الکل با درجات نزولی، با هماتوکسیلن رنگ‌آمیزی شده و با محلول اسید- الکل تمایز یافته سپس با ائوزین رنگ‌آمیزی و با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز ایمونوهیستوشیمی: پس از پارافین زدایی و آب‌دهی برشها، برش‌های بافتی به منظور بازیابی آنتی‌ژنی، در بافر سیترات mM10 با 6 pH=به مدت 20 دقیقه در دمای C90 قرار گرفتند. حذف مکان‌های اتصال غیراختصاصی آنتی‌بادی اولیه با قرار دادن برشها در آلبوین سرم گاوی (سیگما) 4% در PBS برای یک ساعت در دمای معمولی اتاق انجام شد. سپس برشها با آنتی‌بادی پلی کلونال بر ضد pGSK3Ser9 (1:300) (Santa Cruz, USA)، آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوش ضد Total GSK3 (1:300) (Santa Cruz, USA) و یا آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوش ضد -catenin (1:350) (اهدایی از طرف دکتر عرب نجفی، دانشگاه تهران) رقیق شده در 4% PBS-BSA به مدت 24 ساعت در C4 در اتاق مرطوب و در کنترل منفی، برشها فقط با محلول 4% PBS-BSA انکوبه شدند. پس از شستشو در PBS مهار فعالیت پراکسیداز سلولی با قرار دادن لامها در محلول هیدروژن پراکسیداز 3/0% در متانول به مدت ده دقیقه انجام شد. سپس لامها شسته و با آنتی‌بادی ثانویه برای -catenin و آنتی‌بادی ثانویه برای GSK3, pGSK3Ser9 همگی با رقت 1:300 به مدت یک ساعت در دمای معمولی اتاق در اتاق مرطوب انکوبه شدند. آشکارسازی با استفاده از کیت Vectastain ABComplex, و نشانگر دی آمینوبنزیدین (DAB)، (Vector Laboratories, UK)، با ایجاد رسوب قهوه‌ای انجام گرفت. سپس آنالیز برشها با میکروسکوپ نوری (Axiophot Zeiss, Germany) انجام شد.

ارزیابی TUNEL : بازیابی آنتی‌ژنی و بلوکه کردن مکان‌های اتصال غیراختصاصی به شرح بالا انجام شد. سپس برشها با مخلوط واکنش TUNEL (Roche, Germany) حاوی آنزیم Tdt و نوکلئیوتیدهای نشاندار شده با فلورسئین به مدت 2 ساعت در دمای C37 در اتاق تاریک و مرطوب انکوبه شدند. در کنترل منفی، برشها با مخلوط واکنش TUNEL در غیاب آنزیم Tdt انکوبه شدند. پس از شستشو در PBS، برشها در مجاورت 4% PBS-BSA به مدت نیم ساعت مجاور و سپس با آنتی‌بادی ضد فلورسئین کونژوگه با HRP به مدت 30 دقیقه در C37 انکوبه شدند. آشکارسازی با استفاده از نشانگر DAB انجام شد، سپس برشها با هماتوکسیلین رنگ‌آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری بررسی شدند.

ارزیابی وسترن بلات: در این آنالیز سه تخمدان در هر گروه در یک لوله قرار داده و توسط محلول لیز بافت (mM pH=7.220، Tris-HCl کلرید سدیم mM150، گلیسرول 10%، NP-401%، سدیم فلوراید mM10، سدیم اورتوواناداتmM 1، EDTA mM1، PMSF mM1 به‌خوبی هموژن شد و سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت g13000 در دمای C4 سانتریفیوژ و محلول شفاف فوقانی جهت آنالیز وسترن بلات استفاده گردید. جهت اندازه‌گیری میزان پروتئین موجود در نمونه‌ها، از معرف برادفورد (کوماسی بلو 10%، 5% اتانل 95% و10% اسید فسفریک 85%) استفاده شد. نمونه‌ها در ژل SDS-PAGE 10% الکتروفورز شدند. جهت بررسی صحت الکتروفورز و مشاهده باندهای پروتئین، رنگ‌آمیزی ژل توسط محلول روی- ایمیدازول (Imidazol 0.2 M+ ZnCl2 0.3M) به مدت 5 دقیقه صورت گرفت و سپس جهت رنگ بری به مدت 10 دقیقه در محلول ترانسفر (3/0% Tris-base +44/1% glycine+10% متانول) شستشو داده شد. پروتئین‌های روی ژل توسط تانک ترانسفر مرطوب (BioRad, USA) به مدت 90 دقیقه (100 ولت) بر روی غشا PVDF منتقل شدند. پس از ترانسفر جهت اطمینان از انتقال پروتئینها غشا با رنگ قرمز پونسو (قرمز پونسو 4%، اسید استیک 8%) رنگ و بعد از مشاهده باندها، غشا با آب مقطر شستشو و یک ساعت در دمای اتاق با محلول Top block 5/2% (Jura, Switzerland) در PBS قرار داده شد. سپس با آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوش ضد Sfrp4 (1:1000) (اهدائی پروفسور Friis از دانشگاه برن، سوئیس) در دمای C4 به مدت یک شبانه روز انکوبه شد. پس از شستشوی غشا با PBS آنتی‌بادی ثانویه (1:30000) کونژوگه با HRP (Cell Signaling, USA) به مدت یک ساعت بر روی غشا قرار گرفت و جهت ظهور باندها از محلول ECL (Millipore, USA) استفاده شد. به منظور اطمینان از یکسان بودن میزان پروتئین نمونه‌ها در هر چاهک، غشاء با محلولmM 25 Glycine (2pH=) به اضافه 1% SDS استریپ شد و سپس با آنتی‌بادی پلی‌کلونال خرگوش ضد بتا اکتین (1:500) (Biovision, USA) انکوبه و آشکارسازی باندها به شرح بالا انجام شد. بررسی کمی میزان Sfrp4 با استفاده از دستگاه دانسیتومتری (Kodak, England) و نرم افزار TotalLab صورت گرفت.

آنالیز آماری: برای آنالیز TUNEL و شمارش فولیکول‌های آپوپتوتیک آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS و بکارگیری Mann- Whitney U-testانجام شد. 05/0p به عنوان اختلاف معنی‌دار محاسبه و میانه نیز محاسبه و گزارش شد.

نتایج

آنالیز هیستولوژیک: در تخمدان‌های تیمار 1 هفته و چهار هفته با TP، ویژگی‌های PCO مانند فولیکول‌های بزرگ کیستیک، تعداد زیادی فولیکول کوچک پری‌آنترال، افزایش حجم استروما و عدم تخمک‌گذاری مشاهده شد (شکل 1- الف). در گروه کنترل مربوط به تیمار یک هفته، تخمدانها فاقد کیست و در رت بالغ (گروه کنترل تیمار چهار هفته) تخمدانها مملو از جسم زرد بودند که نشان‌دهنده تخمک‌گذاری طبیعی در این گروه است (شکل 1- ب).

ایمنولوکالیزاسیون GSK3 ؛ pGSK3Ser9و -cateninو ارتباط آنها با آپوپتوز: تاکنون شواهدی برای دخالت GSK3 در فرآیند آپوپتوز تخمدانی گزارش نشده و نظر به اهمیت آپوپتوزیس فیزیولوژیک در هموستاز تخمدان، نقش GSK3 در این روند مورد بررسی قرار گرفت که در تخمدان تیمار یک هفته‌ای با TP، پروتئین GSK3 در تمام مقاطع فولیکولی و استروما در سیتوپلاسم و یا هسته بیان گردید؛ ولی شدت بیان آن در فولیکول‌های کوچک (نخستین، اولیه و پیش آنترال کوچک) کمتر از فولیکول‌های پیش آنترال بزرگ و آنترال بود (شکل a2). سلول‌های گرانولوزا رو به حفره آنتروم بیان GSK3 هسته‌ای و یا سیتوپلاسمی را نشان می‌دهند (شکل a2و بزرگنمایی داخل آن)، که کاملا هم مکان با آپوپتوز رخ داده در این سلولها می‌باشد (شکلd 2و بزرگنمایی داخل آن). در تخمدان تیمار چهار هفته‌ای با TP، بیان GSK3 در تمام بخش‌های تخمدان قوی‌تر از تیمار یک هفته‌ای بود، و بیان آن در فولیکول‌های اولیه و نخستین نیز دیده می‌شد (شکل i2 و بزرگنمایی داخل آن). بیان قویتر GSK3 در تیمار چهار هفته‌ای نسبت به تیمار یک هفته‌ای با افزایش معنی‌دار درصد آپوپتوز (100% در مقابل 38%) (001/0p<) همراه بود (میانه تیمار چهار هفته‌ای 1 و تیمار یک هفته‌ای 25/0 محاسبه شد؛ شکل d2 در مقایسه باl 2). شکل a3 و i3 به ترتیب بیان قوی GSK3 را در یک فولیکول پری آنترال آپوپتوتیک (شکلd 3 و l3) در تیمار یک هفته و چهار هفته باTP را نشان می‌دهند. این مشاهدات نشان داد که تیمار طولانی مدت با تستوسترون باعث افزایش معنی‌دار آپوپتوز نسبت به تیـمار یک هفتـه (001/0p<) همـراه با افـزایش

بیان GSK3 می‌شود.

مشاهده افزایش بیان GSK3 می‌تواند همراه با افزایش فرم فسفریله آن نیز باشد. از آنجایی که فرم فسفریله GSK3 یعنی فرم غیر فعال آن، نقش بسزایی در براه‌اندازی مسیر Wnt/catenin و یا براه اندازی فعالیت Fas/Fas ligand در مسیر آپوپتوز خارجی ایفا می‌کند (13)، بنابراین جایابی آن در برش‌های پیاپی دنبال شد. در تیمار یک هفته‌ای هم مکانی بین GSK3 وpGSK3Ser9 در سلول‌های گرانوزا آپوپتوتیک رو به حفره (بزرگنمایی داخل شکل‌های b2 وa2) و نیز در فولیکول پری آنترال آپوپتوتیک دیده شد (شکل b3 و a3). در حالیکه در تیمار دراز مدت با TP رنگ‌آمیزی بسیار ضعیف pGSK3Ser9 در بعضی از سلول‌های آپوپتوتیک دیده می‌شود (شکل j2 و i3) بر مبنای این مشاهدات به نظر می‌رسد که مهار GSK3 در تیمار طولانی مدت با تستوسترون کاهش می‌یابد.

در گروه کنترل نیز بیان GSK3 در فولیکول‌های آنترال، جسم زرد، استروما (شکل a4) و پیش آنترال بزرگ (شکل i4) دیده شد و مانند تخمدان موش‌های تیمار شده، pGSK3Ser9 به میزان کمتری نسبت به GSK3 در سیتوپلاسم سلول‌های لوتئال بزرگ و سلول‌های آندوتلیال دیده شد (شکل j4 و b4). هم مکانی GSK3 در سلول‌های آپوپتوتیک درشکل i4 و d4 نشان داده شده است. آنالیز TUNEL تخمدان رت نابالغ (کنترل تیمار یک هفته‌ای) در مقایسه با رت بالغ (کنترل تیمار چهار هفته‌ای) نشانگر درصد بالای آپوپتوز در رت بالغ (32%) نسبت به کنترل رت نابالغ (10%) بوده (میانه کنترل رت بالغ 48/0 و رت نابالغ 9/0 محاسبه شد) که این نتیجه کاملاً منطبق با افزایش بیان GSK3 در تخمدان رت‌های بالغ در مقایسه با تخمدان رت‌های نابالغ بود.

-catenin به همـراه E-cadherin در چسبندگی سلولی

نقش دارد. بنابراین همانطور که انتظار می‌رفت در تخمدان‌های موش‌های تیمار شده و کنترل نیز رنگ‌آمیزی ایمنوهیستوشیمیک قوی دیده شد، ولیکن بیان سیتوپلاسمی و هسته‌ای -catenin فقط در سلول‌های آپوپتوتیک دیده می‌شود (شکل 2 و 3ردیف سوم). نکته جالب توجه کاهش شدت رنگ‌آمیزی

-catenin همانندpGSK3Ser9 در فولیکول‌های آپوپتوتیک تیمار چهار هفته‌ای نسبت به یک هفته‌ای می‌باشد (شکل c2 در مقایسه با k2 و شکل c3 در مقایسه با k3). براساس نتایج حاصل فسفریلاسیون GSK3 می‌تواند به‌دنبال فعال شدن مسیر Wnt/catenin باشد که به نظر می‌رسد تیمار دراز مدت با تستوسترون باعث مهار و یا اختلال این مسیر شده است. ارزیابی انبوه بیان ژنها در سلول‌های تکا زنان PCO نشان‌دهنده افزایش بیان Sfrp4 بوده است (10). در بررسی ایمنوهیستوشیمیک انجام شده در آزمایشگاه، ما بیان افزایش یافته Sfrp4 را در تیمار دراز مدت در سطح سلول‌های گرانولوزا، تکا و استروما مشاهده کردیم (نتایج نشان داده نشده‌اند) بنابر نتایج بدست آمده در این مطالعه، در ادامه این طرح بررسی کمی بیان Sfrp4 در تخمدان کنترل و PCO و ارتباطش با -catenin و GSK3 انجام شد.

بررسی بیان Sfrp4 در تخمدان کنترل و PCO : ارزیابی وسترن بلات Sfrp4 و بررسی کمی آن نشانگر 7/2 بار افزایش میزان آن در تخمدان کنترل رت بالغ نسبت به کنترل رت نابالغ بود (شکل 5). تیمار دراز مدت تستوسترون باعث افزایش 1/5 برابر بیان Sfrp4 در تخمدان رت‌های تیمار چهار هفته‌ای نسبت به میزان آن در کنترل یک هفته‌ای بوده است (شکل 5). میزان افزایش Sfrp4 در تیمار دراز مدت نسبت به کنترل رت بالغ 1/5 می‌باشد. در حالیکه میزان Sfrp4 در تخمدان تیمار یک هفته‌ای نسبت به کنترل نابالغ کاهش 06/0 بار را نشان می‌دهد (شکل 5).

بحث

تنظیم دقیق وقوع رویدادهای آپوپتوتیک در تکوین و هموستازی تخمدان بسیار حائز اهمیت است. تاکنون مطالعه‌ای مبنی بر اختلال مسیر سیگنال دهی Wnt در توقف رشد فولیکولی و یا آپوپتوز، در مدل رت PCO القا شده با TP گزارش نشده است. بنابراین مطالعه حاضر به بررسی تاثیر تستوسترون روی بیان Sfrp4،GSK3 و مکان درون سلولی-catenin پرداخته است.

نتایج این مطالعه نشانگر همراهی GSK3 و -catenin در رویدادهای آپوپتوتیک تخمدان رت است. در مطالعه حاضر افزایش بیان هسته‌ای و یا سیتوپلاسمی GSK3 در فولیکول‌های آپوپتوتیک تخمدان طبیعی و PCO مشاهده شد. GSK3 به عنوان یک سرین/ ترئونین کیناز با سوبستراهای متعدد که اولین سوبسترای مشخص شده آن گلیکوژن سنتاز است؛ ولیکن امروزه پروتئین tau در میکروتوبولها، -catenin درگیر در مسیر Wnt signaling، عوامل رونویسی و پروتئین‌های دخیل در چرخه سلولی نیز از جمله سوبستراهای این کیناز شناخته شده‌اند (13،14). مطالعات متعدد نقش GSK3 را به عنوان عامل پیش برنده آپوپتوز در نورونها گزارش کرده‌اند (15،16). این مطالعات نقش مستقیم GSK3 در مسیر میتوکندریایی آپوپتوز به‌واسطه فعال کردن پروتئین Bax و Caspase-3 را نشان داده‌اند (17-16). از طرفی دیگر افزایش فرم فسفریله آن در به راه اندازی مسیر خارجی آپوپتوز (Fas-FasL) به‌ واسطه کاهش بیان فاکتور بقاNF kappa-B گزارش شده است (18). دخالتGSK3 در آپوپتوز با فعال کردن و افزایش ثبات P53 نیز گزارش شده است (18). در این راستا لوکالیزاسیون هسته‌ای P53 در سلول‌های آپوپتوتیک تخمدان نشان داده شده است (19) و در مطالعه حاضر نیز لوکالیزاسیون هسته‌ای GSK3 مشاهده شد؛ بنابراین GSK3 می‌تواند با اتصال به P53 نقش مهمی را در پیشبرد آپوپتوز در تخمدان ایفا کند. تاکنون تنها یک مطالعه در مورد نقش GSK3 در رشد تخمک و فرآیندهای آپوپتوتیک وابسته به آن در هیدر گزارش شده است (20) که نشانگر وابستگی افزایش بیان HyGSK3 (مشابه GSK3 در پستانداران) با رویدادهای آپوپتوتیک در سلول‌های احاطه کننده تخمک بوده است. براساس نتایج مطالعه حاضر چنین به نظر می‌رسد که GSK3 در تخمدان یک نقش حفاظت شده را در پیشبرد آپوپتوز ایفا می‌کند. از طرف دیگر فعالیت مسیر سیگنال‌دهی Akt Protein kinase B/ تحت تأثیر FSH نقش مهمی را در بقای سلول و جلوگیری از آپوپتوز دارد (21). نتایج مطالعه حاضر مبنی بر افزایش درصد آپوپتوز در مدل PCO همراه با رنگ‌آمیزی بسیار ضعیف pGSK3Ser9 در تیمار دراز مدت با TP می‌تواند به دلیل مهار سیگنال‌دهی Akt باشد. گزارش جدید Constantinou و همکاران (22) می‌تواند تاییدی برای این فرضیه باشد. آنها نشان داده‌اند که بیان بالای Sfrp4 در سلول‌های اپی‌تلیال پستان باعث مهار فسفریلاسیونAkt می‌شود. با توجه به مطالعات انجام شده و نتایج حاضر در این مطالعه بررسی دقیق فعالیت پروتئین‌های دخیل در مسیر خارجی و یا داخلی آپوپتوز و یا پروتئین‌های تنظیم کننده چرخه سلولی و ارتباط آنها با GSK3 امکان درک بهتر نقش GSK3 را در رویدادهای آپوپتوتیک تخمدان را فراهم می‌کند. همچنین استفاده از پروتئین Sfrp4 امکان درک مکانیسم اثر Sfrp4 روی مسیرهای سیگنال‌دهی مهمی مانندWnt و Akt را در تخمدان می‌دهد.

تاکنون اطلاعات واضحی راجع به اثر تستوسترون بر روی فسفریلاسیون و تغییر بیان کینازهای درون سلولی و یا اثرش بر روی بیان فاکتورهای رونویسی در تخمدان گزارش نشده است. وجود گیرنده آندروژنها در سلول‌های گرانولوزا، استروما و اووسیت جوندگان گزارش شده است (23،24). Tetsuka و همکاران بیان بالای رسپتور آندروژن را در کومولوس و سلول‌های گرانولوزا، رو به آنتروم را نسبت به سلول‌های گرانولوزای دیواره‌ای گزارش کرده‌اند (23). نقش آندروژن، در رشد فولیکولها و افزایش تعداد فولیکول‌های کوچک به‌خصوص فولیکول‌های پیش آنترال قبلاً گزارش شده است (25) و در مدل PCO رت نیز شاهد افزایش تعداد فولیکول‌های پیش آنترال بوده‌ایم. از طرف دیگر در جوندگان آندروژنها باعث افزایش آپوپتوز نیز می‌شود (26). در نتایج حاضر نیز افزایش میزان آپوپتوز در رت‌های تیمار شده با TP در سلول‌های گرانولوزای رو به آنتروم، استروما و کومولوس که دارای رسپتور آندروژن هستند نسبت به کنترل مشاهده شد.

-catenin به عنوان جزیی از کمپلکس پروتئین

E-cadherin در چسبندگی بین سلولی گزارش شده است اما نقش مهمی را نیز درWnt signaling ایفا می‌کند. Parakh و همکاران نقش مهم -catenin را در مسیر سیگنال‌دهی FSH و القا آروماتاز را گزارش کرده‌اند. این مطالعه نشان داده است که فعالیت آروماتاز نیاز به اتصال -catenin به ناحیه آغازگر ژن آروماتاز دارد (27). گرچه Hsieh و همکاران تفاوتی در میزان -catenin آزاد در سیتوپلاسم در موش بالغ نسبت به موش نابالغ مشاهده نکرده‌اند (6). از طرف دیگر ثبات و تجمع هسته‌ای -catenin در تومورزایی وابسته به افزایش فعالیت بعضی از مولکول‌هایWnt ، ضروری گزارش شده است (28). مطالعات معدودی نیز نقش پیش برنده آپوپتوز را برای-catenin نشان داده‌اند (30-29). چنانچه در تخمدان افزایش-catenin آزاد را مرتبط با آپوپتوز گزارش کرده‌اند (31).

در سلول‌های اپی‌تلیال سطح تخمدان افزایش بیانE-cadherin و در نتیجه کاهش میزان سیتوپلاسمیک و هسته‌ای -catenin را مرتبط با ترانسفورماسیون و ایجاد تومور اپی‌تلیوم سطح تخمدان گزارش کرده‌اند (31). در سرطان تخمدان نیز با وجود افزایش بیان

-catenin آنرا در هسته سلول مشاهده نکرده‌اند و فقط به دور سلولها دیده شده است (32). براساس گزارشها و نتایج به‌دست آمده در مطالعه حاضر که نشانگر لوکالیزاسیون سیتوپلاسمی و یا هسته‌ای -catenin در سلول‌های آپوپتوتیک در تخمدان رت‌های کنترل و تیمار یک هفته‌ای با TP می‌باشند، به نظر می‌رسد که افزایش سطوح-catenin آزاد در سلول‌های گرانولوزا می‌تواند نقش مهمی را در پیشبرد آپوپتوز ایفا کند.

تاکنون پنج نوعSfrps به عنوان آنتاگونیستWnt signaling شناخته شده است (33) که در میان آنها افزایش بیان Sfrp4 وابسته به رویدادهای آپوپتوتیک تخمدان گزارش شده است (33) ولیکن نقش غیر آپوپتوتیک و وابسته به لوتئینیزاسیون نیز برای آن گزارش شده است (7). آنالیز ایمنوهیستوشیمی انجام شده در مطالعه حاضر نیز افزایش معنی‌دار بیان Sfrp4 وابسته به آپوپتوز در تیمار دراز مدت با TP نسبت به تیمار یک هفته‌ای و کنترل را نشان داده است (این نتایج در این مطالعه نشان داده نشده‌اند). به همین دلیل محققین مطالعه حاضر انتظار داشتند که کاهش لوکالیزاسیون سیتوپلاسمیک و یا هسته‌ای-catenin و همچنین کاهشpGSK3Ser9 در تیمار دراز مدت با TP در ارتباط با اختلال Wnt signaling در PCO باشد. بررسی کمی میزان بیان Sfrp4 و افزایش بیان آن در تیمار دراز مدت با TP نسبت به کنترل و تیمار یک هفته‌ای می‌تواند نشانگر مهارWnt signaling در تیمار طولانی مدت باشد. از طرفی دیگر در ارزیابی وسترن بلات کاهش بیان Sfrp4 در تیمار یک هفته‌ای نسبت به کنترل آن قابل تامل و ملاحظه می‌باشد. در همین راستاUren و همکاران (4) نشان داده‌اند که بیان کم Sfrp1 نقش آگونیست Wnt signaling و افزایش-catenin هسته‌ای را به‌دنبال دارد؛ در حالیکه افزایش میزان بیانSfrp1 باعث مهارWnt signaling و کاهش چشمگیر میزان-catenin آزاد می‌شود. بر پایه این گزارش شایدSfrp4 نیز در تخمدان بسته به میزان بیان آن بتواند نقش دوگانه‌ای را در تنظیمWnt signaling بازی کند و همین دلیلی برای کاهش میزان-catenin آزاد در تیمار دراز مدت باشد.

نتیجه‌گیری

نتایج مطالعه حاضر اولین گزارش دخالت مستقیم GSK3 و -catenin در رویدادهای آپوپتوتیک تخمدان می‌باشد. افزایش بیانGSK3 کاملاً وابسته به آپوپتوز بوده درحالیکه به نظر می‌رسد ارتباط بین میزان

-catenin آزاد در سلول و آپوپتوز بستگی به میزان بیانSfrp4 دارد. با توجه به اهمیت روز افزون درک بهتر مسیرهای دخیل در سیگنال‌دهی درون تخمدانی و اهمیت آن در روند فولیکولوژنز بررسی مسیر و نقش دقیق Wnt signaling و همچنین ارتباطش با دیگر مسیرهای مهم سیگنال‌دهی مانند TGF-signaling، Akt، Hedgehog می‌تواند کمک به‌سزایی برای درک بهتر مکانیسم مولکولی توقف رشد فولیکولها در سندرم PCO، عارضه از کار افتادگی زودرس تخمدان (POF) و یا در سندرم عدم تخمک‌گذاری فولیکول لوتنئیزه (LUF) باشد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از سرکار خانم دکتر حوری سپهری و جناب آقای دکتر بهمن زینلی از گروه فیزیولوژی جانوری دانشگاه تهران برای حمایت و تشویق بی دریغ در انجام این طرح، سرکارخانم فاطمه رضایی برای کمک در تیمار حیوانات، سرکار خانم لادن دلفی کارشناس آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری و Dr. A. de Agostini از دانشگاه ژنو سوییس برای کمکها و حمایت بی‌دریغشان تشکر و قدردانی می‌نمایند. منابع مالی اجرای این طرح به شماره‌های 04/6ک/268308 و 01/1/268308 توسط دانشگاه تهران تامین گردیده است.