براساس نتایج مطالعات مختلف افزایش سن جوندگان تغییرات دژنراتیوی در بافت بیضه به همراه کاهش در کیفیت اسپرم (4-1) را به دنبال دارد (5). در موش‌های آزمایشگاهی با افزایش سن واکوئل‌هایی در سلول‌های ژرمینال بافت بیضه مشاهده می‌شود. به‌علاوه تعداد سلول‌های ژرمینال در بیضه آنها کاهش یافته است (5). همچنین در این موشها اسپرمها دارای تحرک کمتر و تغییرات دژنراتیو در بافت بیضه هستند و اغلب جفت‌گیریها منجر به موفقیت و باروری نمی‌گردد (5). پیدایش واکوئل در بافت بیضه نشانه فرایند استرس اکسیداتیو است (6). از طرفی استرس اکسیداتیو با فرایند پیری در ارتباط است (6) که با تجویز آنتی اکسیدانها می‌توان اثر رادیکال‌های آزاد اکسیژن را خنثی کرد (7). دو سیستم آنتی اکسیدانی در بدن وجود دارد؛ سیستم آنتی اکسیدانی پیشگیری کننده که شامل پروتیئن‌هایی مثل آلبومین، سرولوپلاسمین و ... است که متصل به فلزات هستند و از تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) جلوگیری می‌کنند و به این ترتیب از شروع واکنش زنجیره‌ای ممانعت می‌شود. در حالیکه سیستم آنتی اکسیدانی جاروب کننده مثل ویتامین E و ویتامین C و آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز، ROS بوجود آمده را حذف می‌کند تا از پراکسیداسیون لیپیدهای غشای پلاسمایی ممانعت کند (8). از جمله آنتی اکسیدانها سلنیوم است که به مقدار زیاد در فرآورده‌های دریایی، جگر و غلات یافت می‌شود (9). این عنصر برای سیستم آنتی اکسیدانی داخل سلولی به عنوان کوفاکتور آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز است،
به طوری که آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز اثرات ویتامین E را تکمیل می‌کند (10). بیضه یکی از ارگان‌های مهم هدف برای سلنیوم است (11). غلظت سلنیوم بافت بیضه در طول بلوغ با شروع اسپرماتوژنز افزایش می‌یابد. شاید علت غلظت بالای سلنیوم در بیضه نقش حمایتی آن و نیز دخالت آن در ساختمان آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز موجود در بافت بیضه باشد (12).
براساس نتایج مطالعات کمبود این عنصر در رژیم غذایی رتها باعث آسیب لوله‌های منی ساز، کاهش تحرک و تعداد اسپرم می‌شود (13). همچنین در مطالعه‌ای که روی خوکها انجام شد کمبود طولانی مدت سلنیوم باعث کاهش تحرک و تعداد اسپرم و افزایش قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم می‌شود (14).
از طرف دیگر میزان بالای سلنیوم هم اثرات نامطلوبی بر کیفیت اسپرم دارد؛ به طوری که Kaur و همکاران گزارش کردند دریافت ppm 8 سلنیوم (4 برابر بیشتر از مقدار مورد نیاز سلنیوم) به مدت 6 هفته باعث کاهش وزن بیضه و افزایش مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم می‌شود (15). به طور مشابه Hansen و همکاران با افزودن مقدار بالایی از سلنیوم در تغذیه انسان کاهش تحرک را در اسپرم مشاهده کردند (16).
چندین مطالعه اثر مثبت تجویز مقدار مناسب سلنیوم را بر کیفیت اسپرم به خصوص تعداد اسپرم، میزان زنده ماندن اسپرم، تحرک اسپرم و مورفولوژی اسپرم نشان داده‌اند. از آن جمله Macpherson و همکاران گزارش کردند که سلنیوم می‌تواند تحرک اسپرم مردان نابارور را بهبود بخشد (17). همچنینLenzi و همکاران
گزارش کردند که تجویز mg/day600 گلوتاتیون به مدت 8 هفته باعث بهبود تعداد، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم شد (18).
همانطور که گفته شد سلنیوم قادر به کاهش تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌باشد (13) و لذا انتظار می‌رود که در افزایش باروری موثر باشد. هدف از این مطالعه بررسی اثر دوزهای مختلف سلنیوم بر پارامترهای اسپرم و ساختار بیضه موش مسن بود.
موش‌های نر نژاد NMRI پس از خریداری از انستیتو پاستور تهران، برای تطابق با شرایط محیط به مدت
2 هفته در حیوانخانه دانشگاه تربیت مدرس نگهداری شدند. حیوانات تحت شرایط استاندارد از نظر غذایی و محیطی قرار گرفتند. گروه‌های سنی مورد استفاده در این تحقیق عبارت بودند از 60 سر موش بالغ 3-2 ماهه و100 سر موش مسن 12-10 ماهه.
دوز یابی: در این تحقیق از سلنیوم به صورت سدیم سلنیت (Na2Seo3) (Sigma, Germany) استفاده شد. ابتدا با تجویز دوزهای مختلف سلنیوم پارامترهای اسپرم موش‌های مسن بررسی شد. از 40 سر موش نر سوری 12-10 ماهه به تصادف 5 سر به ترتیب به گروه‌های کنترل، شم و دوزهای 04/0، 1/0، 2/0، 8/0 و 6/1 اختصاص یافتند. به 5 سر موش گروه کنترل هیچ تزریقی انجام نشد. به 5 سرموش گروه شم، هم حجم تزریق گروه آزمایش، حلال سلنیوم (نرمال سالین)
به صورت داخل صفاقی تزریق شد. برای هر دوز 5 سر موش استفاده شد. گروه‌های آزمایش دوزهای mg/kg04/0، 1/0، 2/0، 4/0، 8/0 و 6/1 از سلنیوم به صورت داخل صفاقی دریافت کردند. تزریقات به مدت 5 هفته و روزانه یک بار انجام شد. بعد از گذشت یک هفته از اتمام تزریقات، اپیدیدیم موشها خارج شده و پس از به دست آوردن اسپرم، آنالیز آن طبق دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی انجام گرفت (19).
دوز مطلوب: بهترین دوز سلنیوم (دوزی که پارامترهای اسپرم را به طور معنی‌داری بهبود بخشد) تعیین گردید. این دوز به موش‌های گروه آزمایش مسن و جوان تزریق شد. به این صورت که 60 سر موش نر سوری 12-10 ماهه و 60 سر موش 3-2 ماهه استفاده شد. هر کدام از گروه‌های سنی مورد استفاده بطور تصادفی به 3 گروه (کنترل، شم و آزمون) تقسیم شدند. به 20 سر موش گروه کنترل تزریقی انجام نشد. به 20 سر موش گروه شم، هم حجم گروه آزمایش حلال سلنیوم (نرمال سالین) به‌صورت داخل صفاقی تزریق شد. موش‌های گروه‌های آزمایش مسن و جوان mg/kg 2/0 سلنیوم به‌صورت داخل صفاقی دریافت کردند. تزریقات به مدت 5 هفته، روزانه یک بار انجام گرفت. در زمان‌های 21، 28، 35 و 42 بعد از شروع تزریقات 5 موش از هر گروه مورد نظر انتخاب و کشته شدند.
موشها به روش قطع مهره‌های گردن کشته و بعد از باز کردن حفره شکمی، بیضه و اپیدیدیم آنها خارج شد. یکی از بیضه‌ها برای بررسی بافت شناسی در محلول فیکساتیو بوئن (Merck, Germany) قرار داده و مراحل آبگیری و شفاف سازی به ترتیب با عبور از الکل با درجات صعودی و زایلین (Merck, Germany) انجام شد. سپس بافتها با پارافین (Merck, Germany) قالب‌گیری و با استفاده از میکروتوم
(Leica, Germany) به مقاطع با ضخامت 5 برش داده شد و رنگ‌آمیزی به روش هماتوکسیلین- ائوزین (Sigma, USA) انجام شد. سپس لام‌های رنگ آمیزی شده با میکروسکوپ نوری بررسی شد.
به منظور بررسی پارامترهای اسپرم ناحیه انتهایی اپیدیدیم جدا و توسط قیچی کاملاً قطعه قطعه گردید. قطعات خرد شده آن در PBS قرار گرفت و به مدت 20 دقیقه در انکوباتور در دمای C37 قرار گرفت. برای مطالعه تعداد اسپرم، بعد از خارج کردن نمونه از انکوباتور قطعات خرد شده اپیدیدیم از محلول خارج گردید و قطره‌ای از این محلول روی لام قرار داده شد و با بزرگنمایی400 × اسپرمها شمارش و در 106 ضرب شد. به منظور تعیین درصد تحرک، ابتدا درصد اسپرم‌های متحرک در 5 میدان میکروسکوپی تخمین زده شد و سپس میانگین آنها به‌عنوان درصد تحرک اسپرمها ثبت شد. برای تعیین درصد زنده بودن اسپرمها قطره‌ای از نمونه اپیدیدیم با یک قطره کوچک از رنگ حیاتی ائوزین B، مخلوط و سپس درصد اسپرم‌های زنده نسبت به تعداد کل اسپرم‌های موجود با بزرگنمایی 400 × محاسبه گردید.
آنالیز آماری: نتایج حاصل از آزمایشات مختلف بصورت میانگین انحراف معیار (MSD)
بیان گردید. سپس داده‌ها با استفاده از نرم افزار SPSS ویرایش 13 و پس از کنترل نرمالیتی توزیع داده‌ها
با آزمون آنالیز واریانس، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای مقایسه درصد پارامترهای اسپرم
در موش‌های جوان و مسن از آزمون 2 و پیرسون استفاده گردید. سطح معنی‌داری 05/0p< در نظر
گرفته شد.
در این مطالعه ابتدا دوز مناسب و تأثیرگذار سلنیوم روی موش مسن مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آن در جدول 1 قابل مشاهده است. با توجه به نتایج این جدول، میانگین تعداد اسپرم بر حسب میلیون در میلی لیتر در گروه کنترل مسن، 66/0±06/4 بود؛ درحالیکه پس از تجویز میزان mg/kg4/0 از سلنیوم تعداد اسپرم به صورت معنی‌داری کاهش یافت (31/0±5/3). در دوزهای دیگر تفاوت معنی‌داری نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد. در عین حال تعداد اسپرم در گروهی که دوز mg/kg4/0 سلنیوم دریافت کرده بودند با گروه‌هایی که دوزهای mg/kg2/0 و mg/kg8/0 و mg/kg6/1 از سلنیوم دریافت کرده بودند، تفاوت معنی‌دار داشت (05/0p<). کمترین میزان تحرک اسپرم در گروهی بود که دوز mg/kg6/1 (بالاترین دوز سلنیوم) دریافت کرده بودند. در حالیکه بالاترین میزان تحرک اسپرم در گروهی بود که دوز mg/kg04/0 سلنیوم (پایین‌ترین دوز) دریافت کرده بود که این میزان تحرک با تحرک در گروه‌های دریافت کننده دوزهایmg/kg 8/0 و mg/kg6/1 سلنیوم دارای تفاوت معنی‌دار بود (05/0p<). با تجویز mg/kg 2/0 از سلنیوم بیشترین میزان درصد زنده بودن اسپرم مشاهده شد (39/5±73) که به صورت معنی‌داری بیشتر از گروه کنترل بود (05/0p<). تجویز دوزهای kg8/0 و mg/kg6/1 از سلنیوم باعث کاهش میزان درصد زنده ماندن اسپرمها گردید؛ ولی میزان این کاهش در مقایسه با گروه کنترل معنی‌دار نبود. در عین حال تفاوت معنی‌داری در میزان درصد زنده ماندن اسپرم این گروهها (گروه‌هایی که دوز mg/kg8/0 و mg/kg6/1 از سلنیوم دریافت کردند) با گروه دوز mg/kg2/0 سلنیوم مشاهده شد (05/0p<) (جدول 1). میزان درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم تمامی گروه‌های آزمایش نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی‌داری داشت (05/0p<). درمجموع نتایج نشان داد که دوز mg/kg2/0، دوز مناسب و تأثیرگذار بر روی پارامترهای اسپرم موش مسن است. بعد از تعیین دوز مؤثر mg/kg2/0 این دوز به موش‌های جوان و مسن تزریق شد. سپس پارامترهای اسپرم در 21، 28، 35 و 42 روز بعد از شروع تزریقات ارزیابی شد که نتایج آن در جدول 2 قابل مشاهده است. نتایج آنالیز اسپرم در روز 21 آزمایش تفاوت معنی‌داری در تعداد اسپرم گروه کنترل مسن نسبت به گروه کنترل جوان نشان داد (05/0p<). تجویز سلنیوم در موش‌های جوان موجب افزایش معنی‌داری در تعداد اسپرم نشد. هر چند که در موش‌های مسن تجویز سلنیوم باعث افزایش تعداد اسپرم شد؛ اما مقایسه آن با تعداد اسپرم موشی که سلنیوم دریافت نکرده بود تفاوت معنی‌دار نشان نداد. همین وضعیت در روز 28 و 35 آزمایش هم مشاهده شد. در روز 42 آزمایش تعداد اسپرم در موش‌های مسن افزایش یافت به گونه‌ای که پس از طی این مدت، تعداد اسپرم در موش‌های مسن دریافت کننده سلنیوم برابر موش‌های بالغ جوان بود. در مجموع نتایج تجویز سلنیوم بر روی تعداد اسپرم نشان داد که یک دوره تجویز 42 روزه تنها در موش‌های مسن باعث افزایش می‌شود. تجویز سلنیوم بر روی تحرک اسپرم اثر مثبتی نداشت؛ ولی میزان درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم در تمامی روزهای آزمایش نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی‌داری داشت (05/0p<). همچنین میزان زنده ماندن اسپرم نیز در تمامی روزهای آزمایش نسبت به گروه کنترل تفاوت معنی‌داری داشت (05/0p<) (جدول 2).
به منظور بررسی اثرات سلنیوم بر بافت بیضه، مقاطع بافتی از بیضه موش‌های جوان و مسن تهیه شد. در مشاهدات میکروسکوپی، بیضه موش‌های گروه کنترل جوان ظاهر طبیعی داشتند و شامل مجاری منی ساز و بافت بینابینی طبیعی بودند. لوله‌های منی ساز محتوی اسپرم و اپیتلیوم آن یکدست و فاقد شکاف بود (شکل 1). نتایج مشابهی برای مقاطع بافتی از بیضه در گروه آزمون جوان مشاهده گردید (شکل 1). در بیضه موش‌های گروه کنترل مسن کاهش در اسپرماتید و اسپرم بالغ مشهود بود. همچنین واکوئل‌هایی با ابعاد متفاوت در اپیتلیوم به چشم می‌خورد که ابعاد متفاوتی داشتند (شکل1). در موش‌های گروه آزمون هم این واکوئلها دیده شد که در مقاطع بیضه موش‌هایی که بالاترین دوزها (دوزهای mg/kg8/0 و 6/1) را دریافت کردند تعداد واکوئلها به طور چشمگیری افزایش یافته بود (شکل 1).
مطالعـات بسیاری نشـان داده است که بـا افـزایش سن،
کیفیت پارامترهای اسپرم کاهش می‌یابد (4-1). با افزایش سن تغییراتی نیز در بافت پروستات رخ می‌دهد. از آن جمله آتروفی عضلات صاف و کاهش محتویات پروتئین و آب در ترشحات پروستات بر حجم مایع منی و تحرک اسپرم اثر می‌گذارد (5). همچنین اسپرم با عبور از اپیدیدیم توانایی تحرک را کسب می‌کند. پس اپیدیدیم نقش مهمی در بلوغ اسپرم دارد که اگر با افزایش سن عملکرد آن دچار تغییر شود، ممکن است بر تحرک اسپرم اثر بگذارد. مورفولوژی اسپرم علامتی مناسب برای چگونگی وضعیت اپیتلیوم لوله‌های
منی ساز است. تغییرات دژنراتیو اپیتلیوم لوله‌های منی ساز روی مورفولوژی اسپرم تاثیر منفی می‌گذارد (5).
سلنیوم جزء ساختاری آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز است (20) که کمبود این عنصر در موش صحرایی، منجر به ایجاد تغییر شکل غیرطبیعی اسپرم (دمهای غیر طبیعی و بی حرکت) می‌شود. مشخص شده این ناهنجاریها
در رابطه با افزایش شکنندگی کپسول میتوکندری اسپرم است (21). مطالعه Brownو همکاران هم نشان داد که سلنیوم برای اسپرماتوژنز ضروری است (22). مطالعه Agarwal و همکاران (23) اثرات مثبت تجویز سلنیوم را بر کیفیت اسپرم به‌خصوص تعداد اسپرم، میزان زنده ماندن اسپرم، تحرک اسپرم و مورفولوژی اسپرم نشان داد. از آن جمله Mac-Phersonو همکاران اعلام کردند که سلنیوم می‌تواند تحرک اسپرم مردان نابارور را بهبود بخشد (17). همچنین Scott و همکاران گزارش کردند که تجویز g/day40-30 سلنیوم باعث بهبود کیفیت اسپرم و باروری می‌شود (24). مطالعه دیگری که توسط Agarwal و همکاران انجام شد نشان داد که تجویز خوراکی g/day225 از سلنیوم به مدت 3 ماه تحرک اسپرم را بهبود می‌بخشد (8). نتایج تحقیق حاضر نیز نشان داد که یک دوره تجویز 42 روزه در موش‌های مسن باعث بهبود پارامترهای اسپرم می‌شود. از طرفی در برخی از تحقیقات اثر مفیدی از رژیم غذایی سرشار از آنتی اکسیدان گزارش نشده است (25). در مطالعاتی که به رژیم غذایی گوسفند، خوک و گاو سلنیوم اضافه کردند هیچ بهبودی در کیفیت منی مشاهده نشد (25). پس اگرچه بعضی مطالعات تأثیر مثبت آنتی اکسیدانها را نشان می‌دهند، مطالعات دیگر آن را رد می‌کنند. این می‌تواند به دلیل استفاده از دوز خیلی کم آنتی اکسیدانها یا دوره کوتاه درمان باشد. چون مکملها باید به غلظت خاصی برسند تا روی استرس اکسیداتیو اثر بگذارند (23).
نتایج حاصل از بررسی‌های هیستولوژیکی نشان داد که افزایش سن باعث تغییراتی در بافت بیضه می‌شود و این تغییرات در قالب کاهش سلول اسپرم و پیدایش واکوئل در اپیتلیوم و کاهش تعداد سلول‌های ژرمینال بود. محققین گزارش کردند با افزایش سن جوندگان تغییرات دژنراتیوی در بافت بیضه به همراه کاهش در کیفیت اسپرم دیده می‌شود. موش‌های مسن دارای واکوئل‌هایی در سلول‌های ژرم می‌باشند. به علاوه تعداد سلول‌های ژرمینال در بیضه آنها کاهش یافته است. همچنین تحرک اسپرم کاهش می‌یابد و تغییرات دژنراتیو در بافت بیضه مشاهده می‌شود و در اغلب موارد جفت‌گیری منجر به موفقیت و بارداری نمی‌گردد. در موش‌های خیلی مسن ناپدید شدن اسپرماتید و اسپرماتوسیتها به علت وقفه در اسپرماتوژنز مشاهده شده است (5). در تحقیق حاضر هم واکوئل‌هایی در بافت بیضه موش‌های مسن مشاهده شد. پیدایش واکوئل در بافت بیضه یکی از نشانه‌های فرایند استرس اکسیداتیو است از طرفی استرس اکسیداتیو با فرایند پیری در ارتباط است (6) که با تجویز آنتی اکسیدانها می‌توان اثر آنها را خنثی کرد (13). در تجویز آنتی اکسیدانها دوز مصرفی بسیار مهم است؛ چرا که مشاهده شد که موش‌هایی که دوز بالا دریافت کرده بودند، تعداد واکوئل‌های زیادی در مقاطع بافتی بیضه داشتند که این نشان می‌دهد مقادیر بالای سلنیوم سمی است. در این موارد سلنیوم خود با تولید ROS باعث توقف سیکل سلولی و افزایش فرایند آپوپتوز می‌شود (26). پس آنتی اکسیدانها شمشیر دو لبه‌ای هستند که دوز و مدت زمان مصرف آنها مهم است (20). استفاده از دوز نامناسب یا دوره کوتاه درمان آنها، حتی اثر معکوس دارد (23).
با توجه به نتایج بررسی حاضر به نظر می‌رسد که یک دوره تجویز 42 روزه از سلنیوم با دوز mg/kg2/0 در موش‌های مسن باعث بهبود پارامترهای اسپرم می‌شود که احتمالاً می‌تواند کیفیت اسپرم بیماران تراتواسپرمی و مردان مسن را بهبود بخشد؛ در حالیکه استفاده از دوز نامناسب حتی باعث کاهش کیفیت اسپرم و ایجاد واکوئل در بافت بیضه می‌شود.
بدینوسیله نویسندگان این مقاله از زحمات همکاران سرکار خانم ابراهیمی و جناب آقای پور بیرانوند کارشناسان گروه علوم تشریح کمال تشکر و قدردانی را می‌نمایند. کلیه هزینه‌های این تحقیق از محل بودجه تحقیقاتی مصوب در دانشگاه تربیت مدرس پرداخت شده است.
