اسپرماتوژنز، فرایندی ضروری در قدرت باروری مردان و تولیدمثل انسان است. اسپرماتوژنز روند پیچیده‌ای است که عملکرد صحیح آن، مستلزم عملکرد همزمان فاکتورهای آندوکرین و پاراکرین و میانکنش سلول‌های اسپرماتوژنیک و سرتولی می‌باشد. هورمون LH، تستوسترون و هورمون FSH، کنترل کننده‌های اصلی اسپرماتوژنز هستند و مطالعات نشان می‌دهد که 17β- استرادیول از طریق گیرنده‌های استروژنی (ER)، نقش بسزایی در تنظیم فرایند تولیدمثلی جنس مذکر ایفا می‌کند؛ چرا که فقدان گیرنده‌های استروژنی در موش، سبب تخریب فرایند اسپرماتوژنز و ایجاد ناباروری می‌شود. هورمون FSH متعلق به خانواده هورمون‌های گلیکوپروتئینی شامل TSH، LH و hCG است. این هورمونها، هترودایمرهای غنی از اسید آمینه سیستئین و پل‌های دی‌سولفید می‌باشند و تفاوت این هورمونها، در زیر واحد بتای آنها است. FSH پیام خود را از طریق گیرنده 75 کیلو دالتونی دارای 675 اسید آمینه انتقال می‌دهد (1). گیرنده FSH جزو گیرنده‌های G پروتئینی بوده و ژن کد کننده آن مرکب از 10 اگزون می‌باشد. این هورمون از هیپوفیز آزاد شده به گیرنده خود در سطح سلول‌های سرتولی متصل می‌شود و مسیرهای متعدد انتقال پیام را در داخل این سلولها طی می‌کند. اتصال FSH به سلول‌های سرتولی، سبب سنتز پروتئین متصل شونده به آندروژن (ABP) می‌شود. ABP گلیکوپروتئینی است که متصل به تستوسترون شده و غلظت‌های بسیار بالایی از تستوسترون تولید شده توسط سلول‌های لیدیگ را در موضع اسپرماتوژنز ایجاد می‌کند (2). هورمون استروژن نیز در جنس نر از آندروژن موجود در جریان خون مشتق می‌شود. آروماتیزاسیون کربن شماره 19 آندروژنها یعنی تستوسترون و آندروستن‌دیون، تولید استرادیول و استرون می‌نماید که تحت کنترل آنزیم آروماتاز است. آنزیم آروماتاز کمپلکس آنزیمی P 450 مونواکسیژناز موجود در رتیکولوم آندوپلاسمیک صاف است که سبب سه واکنش هیدروکسیلاسیون متوالی شده و مرحله نهایی آروماتیزاسیون حلقه A آندروژن می‌باشد (3). در طی مطالعات گذشته، استرادیول به عنوان هورمون زنانه و تستوسترون به عنوان هورمون مردانه مورد توجه بوده‌اند. امروزه با شناسایی اعمال مهم استروژنها در دستگاه تناسلی مردان، نقش این هورمون در باروری مردان پررنگ‌تر شده است؛ چرا که فقدان گیرنده آلفای استروژن (αERKO) یا فقدان آروماتاز، سبب اختلال در باروری موشها شده است (4). با توجه به مطالعات انجام شده در این زمینه، نقش هورمون‌های FSH و استرادیول در از سرگیری مجدد اسپرماتوژنز در موش‌های بالغ آزواسپرم، کمتر مورد بررسی قرار گرفته است و مطالعات بیشتر به بررسی اثرات این هورمونها در جنین موشها، موش‌های نوزاد و یا در محیط کشت متمرکز بوده‌اند؛ لذا با توجه اثرات مخرب داروهای شیمی‌درمانی و رادیوتراپی بر تکثیر فعال سلول‌های بدن که سلول‌های مولد اسپرم نیز مستثنی نمی‌باشند (5)، نیاز به بررسی بیشتر نقش هورمون‌های درگیر در روند اسپرماتوژنز به خصوص FSH و استرادیول بوده و بررسی اثرات تزریق مجزا و همزمان این هورمونها در موش‌های بالغ و آزواسپرم شده با داروی سمی بوسولفان، کمک به فهم بیشتر نقش این هورمونها در فرایند اسپرماتوژنز می‌نماید.
گروه‌بندی حیوانات: 20 موش از نژاد C57BL/6 با سن 25 روز از موسسه پاستور تهران، تهیه شده و به چهار گروه مساوی (یک گروه کنترل و سه گروه آزمایش) تقسیم شدند. موشها در حیوانخانه پژوهشگاه ابن‌سینا تحت شرایط بدون محدودیت آب و غذا نگهداری شدند. در ابتدا به موش‌های مورد مطالعه، mg/kg30 بوسولفان (Sigma, USA) تزریق شد. پس از 5 هفته از تزریق بوسولفان، این دارو آزواسپرمی را در موشها القاء کرد. برای اطمینان از آزواسپرم شدن موشها، پس از گذشت 4 هفته از بافت بیضه آنها مقطع‌گیری به عمل آمده و پس از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین‌ـ ائوزین، بافت بیضه مورد بررسی هیستولوژیک قرار گرفت (17). سپس هورمون‌های FSH (Gonal-f Serono, Switzerland) و استرادیول (Sigma Alderich, Germany) به موش‌های آزواسپرم تزریق شد. گروه اول 5/7 واحد FSH به صورت تزریق زیر جلدی، گروه دوم دوز g/kgµ5/12 استرادیول را به صورت تزریق داخل صفاقی و گروه سوم به طور همزمان، هر دو هورمون را با دوزهای یاد شده دریافت کردند. تزریق طی 10 روز متوالی (روزانه یک دوز) انجام شد (9). برای اندازه‌گیری سطح سرمی تستوسترون در روز 11، موشها با mg/kg64/0 زایلازین (Alfasan, Netherland) و نیز mg/kg20 کتامین (Alfasan, Netherland) بیهوش شده و دو بیضه حیوان از بدن خارج گردید. خونگیری نیز با استفاده از میکروتیوب و از چشم موشها انجام شد. یک بیضه برای آنالیز DNA به روش فلوسایتومتری آماده گردید و بیضه دیگر نیز در محلول فرمالین قرار داده شد و پس از مقطع‌گیری، بررسی‌های بافتی نیز انجام گرفت. سطح تستوسترون سرمی با روش کمی لومینسانس و با استفاده از کیت دیاسورین
(Diasorin, Italy) اندازه‌گیری شد. برای آنالیز DNA به روش فلوسایتومتری، بافت بیضه تازه، برداشت شده و از تونیکا آلبوژینه جدا گردید و سپس در بافر فسفات ایزواسمولار قرار داده شد. به روش مکانیکی با استفاده از تیغ جراحی تا حد ممکن قطعات بافتی و لوله‌های منی‌ساز خرد گردید و برای حذف بقایای سلولی، دو بار با PBS شسته شد. پس از سانتریفیوژ و دور ریختن مایع فوقانی، رسوب حاصل مخلوط شد. سپس ml1 اتانول 70٪ بسیار سرد به‌صورت قطره قطره به رسوب اضافه شد. سپس نمونه به مدت 10 دقیقه با سرعت
rpm3000 سانتریفیوژ و محلول فوقانی دور ریخته شد. از آنجا که مقدار اتانل باقی مانده در میکروتیوپ نباید بیشتر از ml2/0باشد، سلول‌های رسوب کرده مجدداً در محلول باقی مانده از اتانل ورتکس شدند. حدود ml1-5/0 محلول رنگ‌آمیزی پروپیدیوم آیوداید (PI) (Sigma, USA) به هر میکروتیوپ اضافه و ورتکس شد. این محلول شامل ml5/8 بافر رنگ‌آمیزی (BSA 1/0% در PBS)، ml1 RNAase 1/0% و ml5/0 محلول ذخیره PI(ng/ml1) بود. میکروتیوپها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. پس از انتقال حدود ml1 از سوسپانسیون حاصل در لوله‌های مخصوص دستگاه فلوسایتومتر، هیستوگرام‌های DNA با استفاده از دستگاه فلوسایتومتر (Bacton-Dickinson, USA) بدست آمد. سپس داده‌های حاصل با استفاده از نرم‌افزار Cell Quest آنالیز گردید.
ارزیابی آماری: آنالیز آماری با استفاده از نرم‌افزار SPSS ویرایش 13 انجام شد. آزمون کروسکال‌ـ والیس برای مقایسه هم زمان گروه‌ها با یکدیگر و من‌ویتنی برای مقایسه هر گروه با گروه کنترل، به کار گرفته شد و 05/0p< از لحاظ آماری معنی‌دار فرض شد. به منظور آنالیز داده‌های مربوط به مقاطع رنگ‌آمیزی شده بافت بیضه که متغیر کیفی بود، از آزمون دقیق فیشر
استفاده شد.
براساس نتایج این تحقیق، در موش‌های آزواسپرم سطح تستوسترون (ng/ml2/054/0) و شمارش سلـول‌های هـاپلوییـدی بافت بیضـه (97/28%) نسبت
به سطـح تستـوستـرون (ng/ml1/364/9) و شمــارش
سلول‌های هاپلوییدی (79/77%) موش‌های با اسپرماتوژنز طبیعی، کاهش نشان داد. بررسی مقاطع هیستوپاتولوژیک بافت بیضه با میکروسکوپ نوری، اثرات بوسولفان را پس از گذشت 4 هفته در بافت بیضه موش‌های مورد مطالعه بیشتر آشکار کرد. سطح تستوسترون در گروه‌های آزمایشی در مقایسه با گروه کنترل، افزایش به گروه سوم (تزریق همزمان دو هورمون) بود (نمودار1) و تنها تفاوت ایـن گـروه با گـروه کنترل از لحاظ آماری معنی‌دار بود (05/0p<). بررسی نتایج آنالیز DNA به روش فلوسایتومتری، نشان داد که تعداد سلول‌های هاپلوئید در گروه‌های آزمایشی نسبت به گروه کنترل افزایش داشت و گروه‌های 3و 4 افزایش بیشتری نسبت به گروه کنترل (9/28%) نشان دادند که به ترتیب 7/56% و 7/60% (نمودار 2) و تفاوت آنها از لحاظ آماری معنی‌دار بود (05/0p<). بررسی مقاطع هیستولوژیک بافت بیضه پس از تیمار هورمونی با استفاده از میکروسکوپ نوری، تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های آزمایشی و گروه کنترل نشان داد (0001/0p<). در گروه 1 با وجود افزایش سطح تستوسترون در اثر تزریق هورمون FSH، بررسی مقاطع رنگ‌آمیزی شده هماتوکسیلین‌ـ ائوزین بافت بیضه، بازیابی مجدد اسپرماتوژنز را نشان نداد. اما در گروه‌های 2 و 3 که هورمون استرادیول را به صورت مجزا و هورمون FSH و استرادیول را به صورت همزمان دریافت کرده بودند، بازیابی مجدد اسپرماتوژنز مشاهده شد (شکل 4-1).
رادیوتراپی و شیمی‌درمانی سبب تخریب سلول‌های ژرمینال در لوله‌های منی‌ساز شده و سبب ایجاد آزواسپرمی طولانی مدت در جوندگان، میمون و انسان می‌گردد (6). در موش این عوامل سبب ممانعت از تمایز اسپرماتوگونی تیپ A و نهایتـأ آزواسپرمی می‌شود (5). در مطالعه‌ای در سال 2005 بر روی موش‌های آزواسپرم، این موشها به مدت دو هفته با هورمون FSH تیمار شدند، میزان تمایز سلولی در توبولها پس از این مدت زمان در موش‌های مورد مطالعه، کاهش نشان داد. تیمار گروهی دیگر از موشها با تستوسترون نتیجه مشابهی در پی داشت. نتایج مطالعه ما نیز نشان داد که FSH با وجود افزایش اندکی در سطح تستوسترون سرم و تعداد سلول‌های هاپلوئید که از نظر آماری نیز معنی‌دار نبود، نتوانست بازیابی اسپرماتوژنز را در موش‌های آزواسپرم القاء کند. بررسی مقاطع رنگ‌آمیزی شده بافت بیضه نیز نشان دهنده عدم توانایی هورمون FSH در القاء اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم بود. هنوز مشخص نشده است که مهار تمایز اسپرماتوگونی ناشی از افزایش سطح تستوسترون، در اثر هورمون FSHباشد. در موش‌های صحرایی که در اثر تابش پرتو، باروری خود را از دست داده‌اند، به دنبال تزریق تستوسترون برون‌زاد، بقاء و تمایز اسپرماتوگونی تیپ A توسط تستوسترون و FSH مهار می‌شود (8) و مطالعه فوق برای اولین‌بار توانست نقش تستوسترون برون‌زاد را در مهار بازگشت اسپرماتوژنز در موش‌های صحرایی پس از پرتوگیری اثبات نماید. گیرنده‌های FSH و آندروژن در سلول‌های ژرمینال وجود ندارند و این هورمونها اثرات خود را از طریق سلول‌های سوماتیک روی سلول‌های ژرمینال اعمال می‌کنند. Kula و همکاران، موش‌های صحرایی 15 روزه و نابالغ را به مدت 10 روز متوالی تحت تزریق هورمون FSH قرار دادند، بر خلاف موش‌های بالغ، در موش‌های نوزاد، تزریق هورمون FSH سبب القای اسپرماتوژنز و بلوغ زودرس گردید (9). مطالعات نشان داده است که در موش‌های با اسپرماتوژنز طبیعی، تزریق هورمون FSH نه تنها اثر مهاری بر اسپرماتوژنز نداشته، بلکه سبب حمایت از مراحل بعدی تمایز سلولی می‌شود (10). همچنین در نوزادان، تزریق این هورمون سبب افزایش فعالیت میتوزی سلول‌های سرتولی می‌شود (9). اما بررسی‌های اخیر نشان داده‌اند که تزریق این هورمون اثر منفی روی غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم دارد (11). اساس مولکولی اثر مهاری این هورمون در بازیابی اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم، هنوز ناشناخته است. Eddy و همکاران نشان دادند که قرارگیری در معرض غلظت‌های بالایی از استرادیول، سبب القاء ناهنجاری‌هایی در دستگاه تناسلی نر می‌شود (12)؛ اما هنوز اهمیت استروژن در تنظیم عملکرد دستگاه تناسلی نر مشخص نبود. در دهه 1990 اکتشافات جدیدی منجر به شکل‌گیری این فرضیه شد که استروژن نه تنها عملکردهای بسیار مهمی در تولیدمثل در جنس نر دارد، بلکه این هورمون و گیرنده آلفای آن، برای حفظ باروری طبیعی در این جنس مورد نیاز است (7). مطالعات متعددی مبنی بر نقش این هورمون در دستگاه عصبی و همچنین دستگاه تناسلی ماده انجام شده است، ولی کمتر به بررسی نقش این هورمون در سلول‌های ژرمینال موش‌های آزواسپرم پرداخته شده است (11). نتایج حاصل از مطالعه حاضر، نشان داد که استرادیول با دوز g/kgµ5/12 سبب بازیابی مجدد اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم گردیده و افزایش معنی‌دار تستوسترون سرم و جمعیت سلول‌های هاپلوئیدی بافت بیضه و بررسی هیستولوژیک بیضه، همگی حاکی از سرگیری مجدد اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم است. نتایج این مطالعه، با مطالعه Toyama و همکاران، مطابقت داشت (13). آنها از 6 دوز مختلف استرادیول برای تیمار موش‌های آزواسپرم استفاده کردند. با توجه به مطالعات انجام شده و نتایج آنها، اثرات استرادیول در دستگاه تناسلی جنس نر وابسته به دوز بوده و اثرات مهاری این هورمون از دوز g/kgµ16 به بالا دیده می‌شود. گیرنده بتای استرادیول در سلول‌های سرتولی وجود دارد و احتمال دارد که مکانیسم عملکرد این هورمون به طور مستقیم از طریق این گیرنده صورت گیرد (14). Ebling و همکاران، با تزریق استرادیول به موش‌های هیپوگناد سبب افزایش 5-4 برابری حجم توبول‌های منی‌ساز شدند که نقش این هورمون را در باروری پررنگ‌تر می‌کند. مطالعه‌ای مشابه نیز بر روی موش‌های نوزاد انجام گرفته که در آن از هورمون FSH با دوز 5/7 واحد و استرادیول با دوز g/kgµ5/12 برای تیمار موشها به صورت مجزا و همزمان استفاده شده است. نتایج این مطالعه نشان داد که تزریق FSH به تنهایی سبب تحریک تمایز اسپرماتوگونی و افزایش 5 برابری در تعداد اسپرماتوسیتها نسبت به گروه کنترل شده و تزریق استرادیول به تنهایی، سبب مهار اسپرماتوژنز در موشها می‌شود. تزریق این دو هورمون به طور همزمان نه تنها اثر مهاری بر جای نگذاشت، بلکه این دو هورمون اثر هم‌افزایی داشته و سبب تسریع آغاز روند اسپرماتوژنز در موش‌های نوزاد شدند (9). Maccalman و همکاران، نیز نشان دادند که استرادیول سبب افزایش اثرات تحریکی FSH بر میزان mRNA، N- کادهرین (پروتئینی که برای الحاق و چسبندگی داخل سلولی در اپیتلیوم منی‌ساز ضروری است) می‌گردد (15). مطالعه دیگری نیز نشان داد که واکنش بین هورمون FSH و استرادیول در سلول‌های سرتولی، سبب تحریک فعالیت میتوزی این سلولها می‌شود (16).
با توجه به یافته‌های سایر مطالعات و مطالعه حاضر مبنی بر نقش دو هورمون FSH و استرادیول بر روند اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم، FSH با دوز و مدت زمان مورد استفاده در این مطالعه، نتوانست سبب القاء اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم شود؛ اما تزریق استرادیول به صورت مجزا و همزمان با هورمون FSH، سبب القاء مجدد اسپرماتوژنز در موش‌های آزواسپرم گردید.
با توجه به نتایج مطالعات دیگر در مورد اثرات استرادیول در موش‌های بالغ و آزواسپرم، تزریق دوزهای کمتر از g/kgµ16 سبب القاء اسپرماتوژنز و در دوره نوزادی سبب ناهنجاری‌های متعددی در دستگاه تناسلی می‌شود که منجر به اختلال در اسپرماتوژنز می‌گردد (13). اما تزریق هورمون FSH اثرات بلوغ زودرس را در نوزادان در پی دارد؛ لذا لازم است مطالعاتی در انسان به منظور درمان آزواسپرمی ناشی از شیمی‌درمانی با استفاده همزمان از استرادیول و FSH و بررسی اثرات آنها طراحی و اجرا گردد.
بدینوسیله از همکاران محترم گروه جنین‌شناسی پژوهشگاه فن‌آوری‌های نوین علوم پزشکی جهاددانشگاهی‌ـ ابن‌سینا و مسئولین محترم مرکز فوق‌تخصصی درمان ناباروری و سقط مکرر ابن‌سینا برای همکاری صمیمانه در اجرای این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.
