Journal of Reproduction & Infertility

Journal of Reproduction & Infertility

Leukocytospermia and its Correlation with Sperm Parameters in Male Infertility

Authors
Hassan Hassani Bafrani 1
Mohamad Esmaiil Shahaboddin 2
1 Department of Anatomy and Embryology, Faculty of Medicine, Kashan University of Medical Sciences, Kashan, Iran
2 Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Kashan University of Medical Sciences, Kashan, Iran
Abstract
Introduction: Reactive oxygen species (ROS) in the seminal fluid are derived from abnormal sperm, white blood cells or both. Oxidative stress will cause lipid peroxidation, decreased sperm motility and abnormalities in sperm fertilizing capacity. The aims of this study were to compare sperm parameters (Sperm count, motility and morphology) in infertile men with or without leukocytospermia and to measure both seminal total antioxidant capacity (TAC) and malon-dialdehyde (MDA) concentration.Materials and Methods: This case-control study included 110 male subjects referring to Kashan Infertility Center during 2007-2008. Regarding the World Health Organization criteria and following sperm analysis and seminal leukocyte counts, the cases were divided into two leukocytospermic and non-leukocytospermic groups and a third group composed of 45 men with normal test results were selected as the controls. Seminal plasma MDA and TAC levels were spectrophotometrically measured.Results: Upon semen analyses of 110 subjects, 45 individuals were classified as healthy, 30 as leukocytospermic and 35 as non-leukocytospermic; although there were
Keywords
Leukocytospermia
Lipid peroxidation
Male infertility
oxidative stress
reactive oxygen species
Semen Analysis
sperm parameters

زمینه و هدف

نیمی از موارد ناباروری، به علت ناهنجارهای مربوط به مایع سمینال است (1). ناباروری مردان ناشی از علل متعددی از جمله اختلالات هورمونی، اختلالات کروموزومی، ناهنجاری‌های ساختاری بیضه و اختلال در روند اسپرماتوژنز، سموم، داروها، تشعشعات رادیواکتیو، بیماری‌های کلیوی، کبدی یا خونی، اورکیت، ترومای بیضه، تورشن بیضه، عدم نزول بیضه، واریکوسل، بیماری‌های انسدادی مادرزادی یا اکتسابی مسیر انتقال اسپرم و در نهایت اختلال عملکرد اسپرم می‌باشد و در بعضی موارد نیز علت خاصی برای ناباروری مرد یافت نمی‌شود (2).

یکی از مکانیسم‌های دخیل در ناباروری مردان، اختلال عملکرد اسپرم به علت واکنش‌های التهابی می‌باشد. این واکنشها ناشی از علل عفونی و غیرعفونی می‌باشد و ویژگی آنها وجود تعداد زیاد لکوسیت در مایع سمینال است؛ این وضعیت لکوسیتواسپرمی نامیده می‌شود.

با وجود شیوع بالای لکوسیتواسپرمی در مردان نابارور (20-10%)، هنوز نقش آن در پاتوژنز ناباروری نامشخص است (3).

براساس تعریف WHO، لکوسیتواسپرمی به وجود لکوسیت‌های پراکسیداز مثبت بیش از 1061 در هر میلی‌لیتر از مایع سمینال گفته می‌شود (4). برخی از مطالعات، لکوسیتواسپرمی را وجود 1065/0 یا 10625/0 لکوسیت در هر میلی‌لیتر مطرح کرده‌اند (5،6). 60-50% لکوسیت‌های پراکسیداز مثبت را لکوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئار (7) و 30-20% بقیه را ماکروفاژها به خود اختصاص می‌دهند (8).

لکوسیت‌های پراکسیداز مثبت، منبع عمده تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) در مایع سمینال می‌باشند (9،10). علاوه بر لکوسیت‌های مایع سمینال، اسپرم‌های معیوب بویژه اسپرم‌های حاوی بقایای سیتوپلاسمی نیز می‌توانند به عنوان تولید کننده ROS عمل نمایند (11).

سلول‌های ژرمینال در مردان، در همه مراحل تکاملی خود پتانسیل ایجاد ROS را دارند (12). عده‌ای از محققان، با توجه به نقش لکوسیتها در فاگوسیتوز اسپرم‌های غیر طبیعی، اثر لکوسیتواسپرمی را بر پارامترهای اسپرم (تعداد، تحرک و مورفولوژی)، مثبت می‌دانند؛ این اثر مثبت در برخی مطالعات نیز مشاهده شده است (13،14). گروهی دیگر در مطالعات خود، تأثیر منفی لکوسیتواسپرمی را بر پارامترهای اسپرم نشان داده‌اند. در برخی از مطالعات نیز ارتباطی میان لکوسیتواسپرمی و پارامترهای اسپرم مشاهده نشده است (15،16).

در مطالعه Gomez و همکاران، ارتباط منفی بین میزان ROS تولیدی توسط اسپرم و کیفیت اسپرم در مایع سمینال نشان داده شده است (17). Huszar و همکاران، بیان کردند که کیفیت ضعیف اسپرم و افزایش ROS ایجاد شده، با وجود بقایای سیتوپلاسم در اسپرم مرتبط است. این محققین بیان کردند که وقتی اسپرماتوژنز دچار آسیب شود، در مکانیسم حذف سیتوپلاسم نیز اختلال بروز می‌کند، در نتیجه اسپرم که از اپی‌تلیوم ژرمینال آزاد می‌شود، مقداری از سیتوپلاسم اضافی را نیز با خود دارد. آنها خاطر نشان نمودند که ارتباط معنی‌داری بین وجود سیتوپلاسم اضافی با میزان فعالیت آنزیم کراتین فسفوکیناز وجود دارد (18). Aitken بیان نموده اسپرم‌هایی که سیتوپلاسم اضافی دارند، ممکن است توسط آنزیم گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز، ROS بیشتری تولید نمایند (19). همچنین اسپرم‌های نابالغ در پاسخ به اثر تحریکی استرهای فوربول مانند فوربول 12- میریستات 13- استات (PMA) ، میزان زیادی ROS ایجاد می‌کنند (17،20،21).

اسپرم نسبت به ROS حساس است؛ چرا که غشای پلاسمایی آن حاوی مقدار زیادی اسیدهای چرب غیراشباع است (22) و با توجه به عدم وجود سیتوپلاسم در آن، فاقد آنزیم‌های محافظتی است یا آنزیم‌های محافظتی آن خیلی کم است (23)؛ همچنین آنزیم‌های آنتی اکسیدانی داخل سلولی قادر به محافظت از غشای پلاسمایی اسپرم در نواحی آکروزوم و دم اسپرم نیست (24).

تولید ROS توسط دو منبع لکوسیتها، اسپرم یا هر دو، در مایع سمینال، استرس اکسیداتیو ایجاد می‌گردد که به پراکسیداسیون لیپید، اختلال در تحرک اسپرم و کاهش توانایی باروری آن منجر می‌شود (25)؛ بنابراین تعیین منشاء تولید ROS اضافی در مایع سمینال انسان اهمیت فوق‌العاده‌ای دارد.

اگرچه مطالعات زیادی در ارتباط با لکوسیتواسپرمی انجام شده است، ولی اندازه‌گیری میزان ملان دی‌آلدئید (MDA) و همچنین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی (TAC) مایع سمینال در مردان نابارور بدون لکوسیتواسپرمی، در مطالعات محدودی بررسی شده است. هدف از این مطالعه، اندازه‌گیری میزان ملان دی‌آلدئید و همچنین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی مایع سمینال در مردان نابارور مبتلا به لکوسیتواسپرمی یا بدون لکوسیتواسپرمی، و ارتباط آن با پارامترهای اسپرم (تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم) می‌باشد.

روش بررسی

نمونه مایع سمینال از تعداد 110 نفر از مردان مراجعه کننده به مرکز درمان ناباروری کاشان طی سال‌های 1386 تا 1387 دریافت شد. آنالیز استاندارد مایع سمینال در آزمایشگاه آندرولوژی مرکز ناباروری، براساس معیارهای WHO انجام شد.

بر اساس نتایج آنالیز مایع سمینال، نمونه‌های مایع سمینال به گروه‌های لکوسیتواسپرمی (تعداد لکوسیت پراکسیداز مثبت بیشتر از /ml106×25/0) و بدون لکوسیتواسپرمی (لکوسیت پراکسیداز مثبت با تعداد کمتر از /ml106×25/0) تقسیم شدند.

گروهی از مردان که به علت ناباروری همسرشان به مرکز درمان ناباروری مراجعه نموده‌ بودند و پارامترهای مایع سمینال آنها طبق معیارهای WHO نرمال بود، به عنوان گروه کنترل (تعداد 45 نفر) انتخاب شدند.

آزمایش کشت ادرار و مایع سمینال افراد شرکت کننده در مطالعه، برای تشخیص وجود اشریشیا کلی ، استرپتوکوک و اوروپلاسما اورالیتیکوم انجام شد. تعداد کلونی‌های تشکیل شده بیشتر یا مساوی /ml1000، به عنوان کشت باکتریایی مثبت

در نظر گرفته شد.

آنالیز مایع سمینال: نمونه مایع سمینال به روش خودارضایی پس از 3 تا 5 روز پرهیز جنسی تهیه گردید. پس از مایع شدن مایع سمینال، آنالیز پارامترهای اسپرم (حجم، تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم) براساس استانداردهای WHO اندازه‌گیری شد. حجم مایع سمینال با پی‌پت مدرج مشخص شد. با استفاده از لام نئوبار (Conception Technologies, san Diego, CA) تعداد اسپرم به ازای واحد حجم تعیین گردید. لام اسمیر مایع سمینال با استفاده از روش پاپانیکولا رنگ‌آمیزی شد و طبق معیارهای WHO، مورفولوژی اسپرم ارزیابی شد. معیار نرمال برای پارامترهای اسپرم، عبارت از تعداد اسپرم /ml106×20≥، تحرک 50%≥ و مورفولوژی نرمال 30%≥ (26) بود.

تست پراکسیداز: میزان لکوسیت مایع سمینال با رنگ‌آمیزی پراکسیداز بررسی شد (27). حجم l20 مایع سمینال به ویال 2 میلی‌لیتری (Corning Costar Crop., UK) منتقل شد و سپس l20 بافر فسفات

(0/7 PBS; pH=) و l40 محلول بنزیدین به آن اضافه شد. پس از مخلوط کردن محلول فوق 5 دقیقه در درجه حرارت آزمایشگاه قرار داده شد. لکوسیت‌های پراکسیداز مثبت به رنگ قهوه‌ای، با لام نئوبار و میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 20× شمارش شدند. به طور میانگین 5 تا 10 میدان میکروسکوپی شمارش شد. نتایج حاصل از شمارش، پس از محاسبه میزان رقت مایع سمینال طبق معیار WHO مشخص شد. اگر تعداد لکوسیت پراکسیداز مثبت بیشتر از ml6/10×25/0 بود، در گروه لکوسیتواسپرمی قرار می‌گرفت (28). منظور از لکوسیتها در این مطالعه تمام لکوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئار و ماکروفاژها می‌باشد.

اندازه‌گیری MDA :میزان ملان دی‌آلدئید طبق پروتکل Rao و همکاران (29) اندازه‌گیری شد. در این روش میزان ملان دی‌آلدئید توسط روش تیوباربیتوریک اسید (TBA) مورد بررسی قرار گرفت. در این روش l100 از مایع سمینال به l900 آب مقطر اضافه شد. سپس ml5/0 از معرف TBA (Sigma alderich corp; USA) به نمونه رقیق شده اضافه شده و به مدت 60 دقیقه در دمای C°100 قرار داده شد. برای تهیه معرف TBA؛ در ml100 آب مقطر محتوی 5/0 گرم NaOH، g67/0 از2- تیوباربیتوریک اسید و ml100 اسید استیک گلایسیال اضافه شد. پس از سرد شدن نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه و در g4000 سانتریفیوژ شد. در نهایت مایع رویی جدا گردید و میزان جذب نوری آن با دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موج nm534 اندازه‌گیری شد. نتایج به صورت میکرومول در هر لیتر مایع سمینال بیان شده است.

اندازه‌گیری قدرت تام آنتی‌اکسیدانی (TAC): آزمایش FRAP با استفاده از متد Benzie وStrain قدرت آنتی‌اکسیدانی مایع سمینال (TAC)، اندازه‌گیری و نتایج به صورت میکرومول یون فریک در هر لیتر مایع سمینال بیان شد (30). آزمایش FRAP یک روش ساده برای اندازه‌گیری توانایی احیاکنندگی یون فریک است و اخیراً به‌عنوان یک روش جدید در ارزیابی قدرت آنتی‌اکسیدانی معرفی شده است. معرف FRAP حاوی ml5/2 از یک محلول mM10 تری پیریدیل تریازین (TPTZ) (Sigma alderich corp; USA) در mM40 اسید کلریدریک ((Merck, Germany به اضافهml 5/2 از بافر استات M3/0 با 6/3pH= می‌باشد. برای این آزمایش μl50 از مایع سمینال به معرف FRAP اضافه شده و پس از تشکیل کمپلکس رنگی، مقادیر با استفاده از مقایسه تغییرات جذب نوری در nm593 بین نمونه تحت آزمایش و استاندارد حاوی FeSO4 در مقادیر مشخص بدست می‌آمد.

آنالیز آماری: با استفاده از آزمون کروسکال والیس متغیرهای پیوسته بین سه گروه آنالیز شد. برای آنالیز سایر متغیرها از آزمون‌های 2 و فیشر استفاده گردید و ارتباط بین متغیرها با ضریب همبستگی اسپیرمن بررسی شد. محاسبات آماری با نرم‌افزار SPSS انجام شده است و 05/0p< به عنوان سطح معنی‌داری در نظر گرفته شد.

نتایج

در این مطالعه، 110 زوج نابارور مراجعه کننده به مرکز ناباروری کاشان طی سال‌های 87-1386 مورد بررسی قرار گرفتند. میانگین سن افراد مورد مطالعه، 35 سال (از 28 تا 41 سال) بود. از بین 110 مرد مراجعه‌کننده، 30 نفر لکوسیتواسپرمی داشتند و تعداد 35 نفر، اگر چه در مایع سمینال آنها لکوسیت وجود داشت، تعداد لکوسیت‌های آنان کمتر از /ml106×25/0 بود.

اگر چه بین میانگین تعداد اسپرم در افراد لکوسیتواسپرمی (/ml4106115/76) و در افراد سالم (/ml1061/1045/80) تفاوت وجود داشت، ولی این اختلاف معنی‌دار نبود.

در این مطالعه، اختلاف معنی‌داری بین مورفولوژی و زنده ماندن اسپرم بین افراد مبتلا به لکوسیتواسپرمی و غیر لکوسیتواسپرمی با گروه افراد سالم مشاهده نشد (جدول 1).

تحرک اسپرم در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با گروه غیر لکوسیتواسپرمی و گروه افراد سالم، اختلاف معنی‌داری را نشان داد (به ترتیب 05/0p> و 001/0p<).

شاخص معرف استرس اکسیداتیو نیز در هر سه گروه اندازه‌گیری شد. تعداد لکوسیت‌های مایع سمینال با ایجاد MDA ارتباط مستقیم دارد. میزان MDA در گروه لکوسیتواسپرمی (µmol/L 48/18178) به مقدار زیادی بیشتر از گروه غیر لکوسیتواسپرمی

(µmol/L 73/17/2) و افراد سالم (µmol/L 14/04/0) بود که این اختلاف بین گروه افراد سالم با گروه لکوسیتواسپرمی، و بین گروه غیر لکوسیتواسپرمی با گروه لکوسیتواسپرمی معنی‌داری می‌باشد (به ترتیب 001/0p< و 0001/0p<).

تحرک اسپرم (a+b) در گروه لکوسیتواسپرمی (44/2142) در مقایسه با افراد سالم (82/1178/74) اختلاف معنی‌دار داشت (0001/0p<).

میزان MDA موجود در مایع سمینال

(µmol/L 48/18178) در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با افراد سالم (µmol/L 14/04/0) به طور معنی‌داری بیشتر بود (0001/0p<). همچنین میزان TAC در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با گروه غیر لکوسیتواسپرمی و کنترل، به طور معنی‌داری (0001/0p<) پایین‌تر بوده است (جدول 1).

بحث

اگرچه مطالعات زیادی در ارتباط با لکوسیتواسپرمی انجام شده است، ولی اندازه‌گیری میزان MDA و همچنین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی (TAC) مایع سمینال در مردان نابارور بدون لکوسیتواسپرمی، کمتر مورد توجه قرار گرفته است. در این مطالعه، میزان MDA و TAC مایع سمینال در مردان نابارور مبتلا به لکوسیتو-اسپرمی یا بدون لکوسیتواسپرمی اندازه‌گیری شد. نتایج این مطالعه نشان داد که افزایش میزان MDA روی تحرک اسپرم تأثیر منفی دارد. در مطالعه حاضر، در افراد مبتلا به لکوسیتواسپرمی درصد تحرک اسپرم با اختلاف معنی‌داری کمتر از بقیه افراد است (01/0p<). در موافقت با این مطالعه، محققین دیگر بیان نمودند که در افرادی که لکوسیت‌های بیشتری در مایع سمینال آنها بوده، درصد تحرک و مورفولوژی اسپرم آنها کمتر از بقیه بیماران بوده است (13،31). مطالعه حاضر در مغایرت با آن نشان داد که اگرچه درصد مورفولوژی طبیعی اسپرمها در مردان مبتلا به لکوسیتواسپرمی کمتر از افراد سالم بوده، ولی اختلاف معنی‌داری با یکدیگر ندارند.

در مطالعة Moskovtsev و همکاران، نشان داده شد که در دو گروه با و بدون لکوسیتواسپرمی، تعداد، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم تفاوت معنی‌داری با افراد سالم دارد (001/0p<) (21، 9-10).

Saleh و همکاران، بیان کردند که در افراد لکوسیتواسپرمی، درصد تحرک اسپرمها در مقایسه با افراد سالم تفاوت معنی‌داری را نشان می‌دهد؛ در حالیکه این ارتباط بین تعداد لکوسیت و مورفولوژی اسپرم معنی‌دار نبوده است (32).

مطالعه حاضر در تأیید مطالعه سایر محققین (35-33)، نشان داد که غلظت لکوسیت‌های مایع سمینال با ایجاد ROS ارتباط مستقیم دارد و میزان MDA در گروه لکوسیتواسپرمی به مقدار زیادی بیشتر از گروه غیر لکوسیتواسپرمی و افراد سالم است.

در موافقت با مطالعات Gambera (22) و Lackner (23)، مطالعه ما نشان داد که افزایش میزان MDA با افزایش تعداد لوکوسیتها ارتباط مستقیم و بر تحرک اسپرم تأثیر منفی دارد. تحرک اسپرم در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با افراد سالم، به طور معنی‌داری پایین‌تر است. همچنین میزان MDA موجود در مایع سمینال در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با افراد سالم به طور معنی‌داری بیشتر بود، ولی ظرفیت تام آنتی‌اکسیدانی (TAC) در گروه لکوسیتواسپرمی در مقایسه با گروه غیر لکوسیتواسپرمی و کنترل، به طور معنی‌داری پایین‌تر می‌باشد که با مطالعه Saleh و همکاران (32) مطابقت دارد.

اساس مولکولی ناباروری با عامل ناشناخته همچنان مورد بحث است (33). بسیاری از مطالعات توجه خود را بر استرس اکسیداتیو در مردان نابارور متمرکز نموده‌اند (35). استرس اکسیداتیو به علت عدم تعادل بین ایجاد ROS و فعالیت آنتی‌اکسیدانی در مایع سمینال بوجود می‌آید (12). مکانیسم آنتی‌اکسیدانی اسپرم را در برابر اکسیدانها محافظت می‌نماید و گزارش شده که میزان آنتی‌اکسیدان‌های مایع سمینال در مردان نابارور به طور معنی‌داری پایین‌تر از افراد بارور می‌باشد. به هر حال اسپرم فاقد سیستم آنزیمی سیتوپلاسمی لازم برای ترمیم ضایعة ناشی از میزان بالای ROS می‌باشد. این یکی از عواملی است اسپرم را در برابر استرس اکسیداتیو ناتوان می‌کند (32).

لکوسیت‌های موجود در مایع سمینال، یکی از مهمترین منابع ایجاد ROS در مایع سمینال هستند (35). نتایج ما در موافقت با مطالعه Alvarez و همکاران (35) نشان داد که لکوسیت‌های پراکسیداز مثبت به عنوان منبع عمده ایجاد ROS در مایع سمینال می‌باشد. نتایج مطالعه ما نشان داد که در مایع سمینال مردان نابارور مبتلا به لکوسیتواسپرمی در مقایسه با مایع سمینال مردان نابارور بدون لکوسیتواسپرمی و مردان نرمال در گروه کنترل، MDA بیشتری وجود دارد که اختلاف معنی‌داری را نشان می‌دهد.

محققین بیان نموده‌اند که لکوسیت‌های مایع سمینال ممکن است اسپرمها را نیز تحریک کنند تا ROS بیشتری تولید نمایند. به هر حال مکانیسم این تحریک مشخص نبوده و ممکن است به تماس مستقیم اسپرم با لکوسیت مربوط شود یا توسط موادی که از لکوسیتها آزاد می‌شود تنظیم گردد (28،35).

نتیجه‌گیری

ایجاد رادیکال‌های آزاد (ROS) در مایع سمینال با وجود مقادیر بالای لکوسیت، افزایش می یابد. ROS و محصولات پایدار ناشی از آن نظیر ملان دی‌آلدئید (MDA)، باعث اکسیداسیون ترکیبات آنتی‌اکسیدانی و در نتیجه کاهش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی (TAC) مایع سمینال می‌گردد. کاهش TAC و افزایش میزان MDA در مایع سمینال، عملکرد اسپرم به ویژه تحرک آن را دچار اختلال می‌کند. با توجه به ارتباط تحرک اسپرم با لکوسیتواسپرمی و نقش اصلی تحرک اسپرم بر قدرت لقاح و باروری آن، می‌توان نتیجه گرفت احتمالاً لکوسیتواسپرمی در بروز ناباروری زوجین مؤثر است. اگر چه گزارش شده که استفاده از آنتی‌اکسیدان در درمان لکوسیتواسپرمی در بسیاری از مطالعات توصیه شده است؛ ولی تأثیر نهایی آن در بهبودی لکوسیتواسپرمی هنوز مورد بحث می‌باشد.

تشکر و قدردانی

از همکاری سرکار خانم دکتر مرضیه افروغ، سرکار خانم دکتر فاطمه فروزانفرد، پرسنل مرکز درمان ناباروری کاشان و همچنین کارکنان گروه بیوشیمی دانشگاه علوم پزشکی کاشان، تشکر و قدردانی می‌شود.

  1. Schmidt L, Münster K, Helm P. Infertility and the seeking of infertility treatment in a representative population. Br J Obstet Gynaecol. 1995; 102(12): 978-84.
  2. Paul j, Turek MD, editors. Male infertility. New York: McGraw-Hill companies; 2004. 678 p. (Tanagho EA, McAninch JW, editors. Smith’s General Urology, Vol. 42).
  3. Aziz N, Agarwal A, Lewis-Jones I, Sharma RK, Thomas AJ Jr. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 2004; 82(3): 621-7.
  4. Hendin BN, Kolettis PN, Sharma RK, Thomas AJ Jr, Agarwal A. Varicocele is associated with elevated spermatozoal reactive oxygen species production and diminished seminal plasma antioxidant capacity. J Urol. 1999; 161(6): 1831-4.
  5. Menkveld R, Kruger TF. Sperm morphology and male urogenital infections. Andrologia. 1998; 30 Suppl 1: 49-53.
  6. Menkveld R. Leukocytospermia. International Con-gress Series (ICG). 2004; 1266: 218-24.
  7. Steckel J, Dicker AP, Goldstein M. Relationship be-tween varicocele size and response to varicocelectomy. J Urol. 1993; 149(4): 769-71.
  8. Kursh ED. What is the incidence of varicocele in a fertile population? Fertil Steril. 1987; 48(3): 510-1.
  9. Yanushpolsky EH, Politch JA, Hill JA, Anderson DJ. Is leukocytospermia clinically relevant? Fertil Steril. 1996; 66(5): 822-5.
  10. Thomas J, Fishel SB, Hall JA, Green S, Newton TA, Thornton SJ. Increased polymorphonuclear granulo-cytes in seminal plasma in relation to sperm morph-ology. Hum Reprod. 1997; 12(11): 2418-21.
  11. Koksal IT, Usta M, Orhan I, Abbasoglu S, Kadioglu A. Potential role of reactive oxygen species on tes-ticular pathology associated with infertility. Asian J Androl. 2003; 5(2): 95-9.
  12. Sharma RK, Pasqualotto FF, Nelson DR, Thomas AJ Jr, Agarwal A. The reactive oxygen species-total antioxidant capacity score is a new measure of oxida-tive stress to predict male infertility. Hum Reprod. 1999; 14(11): 2801-7.
  13. Kiessling AA, Lamparelli N, Yin HZ, Seibel MM, Eyre RC. Semen leukocytes: friends or foes? Fertil Steril. 1995; 64(1): 196-8.
  14. Tomlinson MJ, White A, Barratt CL, Bolton AE, Cooke ID. The removal of morphologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? Hum Reprod. 1992; 7(4): 517-22.
  15. Van der Ven HH, Jeyendran RS, Perez-Pelaez M, Al-Hasani S, Diedrich K, Krebs D. Leucospermia and the fertilizing capacity of spermatozoa. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1987; 24(1): 49-52.
  16. Fedder J, Askjaer SA, Hjort T. Nonspermatozoal cells in semen: relationship to other semen parameters and fertility status of the couple. Arch Androl. 1993; 31(2): 95-103.
  17. Gomez E, Irvine DS, Aitken RJ. Evaluation of a spectrophotometric assay for the measurement of malondialdehyde and 4-hydroxyalkenals in human spermatozoa: relationships with semen quality and sperm function. Int J Androl. 1998; 21(2): 81-94.
  18. Huszar G, Vigue L. Correlation between the rate of lipid peroxidation and cellular maturity as measured by creatine kinase activity in human spermatozoa. J Androl. 1994; 15(1): 71-7.
  19. Aitken RJ. The Amoroso Lecture. The human sperm-atozoon -- a cell in crisis? J Reprod Fertil. 1999;115(1): 1-7.
  20. Krausz C, Mills C, Rogers S, Tan SL, Aitken RJ. Stimulation of oxidant generation by human sperm suspensions using phorbol esters and formyl peptides: relationships with motility and fertilization in vitro. Fertil Steril. 1994; 62(3): 599-605.
  21. Moskovtsev SI, Willis J, White J, Mullen JB. Leuko-cytospermia: relationship to sperm deoxyribonucleic acid integrity in patients evaluated for male factor infertility. Fertil Steril. 2007; 88(3): 737-40.
  22. Gambera L, Serafini F, Morgante G, Focarelli R, De Leo V, Piomboni P. Sperm quality and pregnancy rate after COX-2 inhibitor therapy of infertile males with abacterial leukocytospermia. Hum Reprod. 2007;22(4): 1047-51.
  23. Lackner JE, Herwig R, Schmidbauer J, Schatzl G, Kratzik C, Marberger M. Correlation of leukocyto-spermia with clinical infection and the positive effect of antiinflammatory treatment on semen quality. Fertil Steril. 2006; 86(3): 601-5.
  24. Cavallini G, Ferraretti AP, Gianaroli L, Biagiotti G, Vitali G. Cinnoxicam and L-carnitine / acetyl-L-carnitine treatment for idiopathic and varicocele-associated oligoasthenospermia. J Androl. 2004; 25(5): 761-70.
  25. Sheweita SA, Tilmisany AM, Al-Sawaf H. Mechan-isms of male infertility: role of antioxidants. Curr Drug Metab. 2005; 6(5): 495-501. Review.
  26. Kruger TF, Ackerman SB, Simmons KF, Swanson RJ, Brugo SS, Acosta AA. A quick, reliable staining tech-nique for human sperm morphology. Arch Androl. 1987; 18(3): 275-7.
  27. Shekarriz M, Sharma RK, Thomas AJ Jr, Agarwal A. Positive myeloperoxidase staining (Endtz test) as an indicator of excessive reactive oxygen species forma-tion in semen. J Assist Reprod Genet. 1995; 12(2): 70-4.
  28. World Health Organisation. Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th Edition. New York: Cambridge University Press, 1999.
  29. Rao B, Soufir JC, Martin M, David G. Lipid per-oxidation in human spermatozoa as related to midpiece abnormalities and motility. Gamete Res. 1989; 24(2): 127-34.
  30. Benzie IF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239(1): 70-6.
  31. Huszar G, Sbracia M, Vigue L, Miller DJ, Shur BD. Sperm plasma membrane remodeling during spermio-genetic maturation in men: relationship among plasma membrane beta 1,4-galactosyltransferase, cytoplasmic creatine phosphokinase, and creatine phosphokinase isoform ratios. Biol Reprod. 1997; 56(4): 1020-4.
  32. Saleh RA, Agarwal A, Kandirali E, Sharma RK, Anthony J, Thomas AJ, et al. Leukocytospermia is associated with increased reactive oxygen species production by human spermatozoa. Fertil steril. 2002; 78(6): 1215-24.
  33. Sikka SC. Role of oxidative stress and antioxidants in andrology and assisted reproductive technology. J Androl. 2004; 25(1): 5-18. Review.
  34. Alvarez JG, Storey BT. Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa. Mol Reprod Dev. 1995; 42(3): 334-46.
Journal of Reproduction & Infertility
Volume 9, Issue 4
Winter 2009
Pages 325-333